CN101250207B - 鸡骨草总黄酮碳苷有效部位、其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于天然药物领域，具体涉及从中药毛鸡骨草中提取分离的一种总黄酮碳苷有效部位提取物，主要含有芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、以及芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷，其黄酮碳苷含量达40％以上。本发明还涉及上述总黄酮碳苷提取物的提取分离方法。药效学试验表明，鸡骨草总黄酮碳苷提取物可以作为活性部位制备预防和治疗急慢性肝炎及其相关疾病药物。

Description

鸡骨草总黄酮碳苷有效部位、其制备方法和用途

技术领域

本发明属于天然药物领域，具体涉及从中药毛鸡骨草中提取分离的一种总黄酮碳苷有效部位，其制备方法及其在制备预防及治疗急慢性肝炎及其相关疾病药物中的应用。

背景技术

肝病是严重威胁人类健康的常见传染病、多发病之一，根据病因可分为病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、药物中毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝、遗传代谢性肝病和其他感染因子引起的肝炎。肝炎中以病毒性肝炎对人类危害最大，而病毒性肝炎中以乙肝和丙肝尤为突出。乙型肝炎是世界性疾病，全球约有3.5亿患者，我国是乙肝大国，乙肝表面抗原(HBsAg)阳性者约占总人口的1/10。目前全世界约有3亿(我国1.2亿)乙肝病毒携带者。近年来，国际医药界对防治肝炎药物研究工作比较活跃，主要针对抑制肝炎病毒复制、改善肝功能障碍、抗肝细胞脂质过氧化、免疫调节等方面进行研究。临床上常用的肝炎药物包括抗病毒类的干扰素、阿昔洛韦，免疫抑制剂环磷酰胺，保肝的水飞蓟素、联苯双酯等。目前，化学药物对于病毒性肝炎，尤其是慢性肝炎的防治尚无明确的疗效，并且存在着毒副作用等弊端。我国有着丰富的天然药物资源，在防治肝炎的临床应用等许多方面有着丰富的经验，并成功开发出茯芩多糖、甘利欣(甘草酸二铵)、水飞蓟素、联苯双酯等天然药物，并用于临床治疗，但由于肝炎发病机制较为复杂，多数药物疗效有限，对肝炎不能有效根治，故研究和开发出新一代的肝炎治疗药物是非常必要的。

中药防治肝损伤作用主要为改善肝功能，降低血清谷丙转氨酶ALT、降低血清总胆红素Bil，增加血清白蛋白Alb；促进肝糖元合成，保护肝细胞，防止急慢性肝损伤造成的糖元合成障碍；改善肝细胞病理，对急性肝损伤能减轻细胞肿胀，防止脂肪变性、阻止肝纤维化；抑制肝胶原纤维、网状纤维增生。通常认为中药的抗肝伤作用在于能提高SOD或其他抗氧化酶活性，从而清除自由基，阻止肝细胞脂质过氧化，维持细胞膜的正常结构，避免细胞的损害。

鸡骨草为豆科植物鸡骨草Abrus cantoniensis Hance和毛鸡骨草Abrus mollis Hance的干燥全株。具有清热利湿、舒肝止痛、活血散瘀的功效，临床用于治疗急慢性肝炎、肝硬化腹水、胃痛、风湿痹痛等症。其中毛鸡骨草为豆科植物相思子属毛鸡骨草Abrus mollis去除荚果后干燥全草，主要分布于中国的南部地区，如广西、广东、福建及海南等。相思子属植物中鸡骨草和毛鸡骨草治疗传染性肝炎疗效显著，从民间草药使用发展到中成药制剂，广泛应用于临床，现有鸡骨草冲剂、复方鸡骨草片、鸡骨草丸等剂型。目前国内外对药材鸡骨草和毛鸡骨草的化学成分研究较少，文献报道本植物分离得到脂肪酸、三萜、甾体、异黄酮等，已有的化学成分研究与药效活性筛选工作脱节，未能系统地阐明药材鸡骨草治疗肝炎的药效物质基础。文献报道鸡骨草提取物及鸡骨草中三萜皂苷槐花皂苷III和大豆皂苷I具有保肝降酶的活性(Miyao H，et al.Kaikasaponin III and Soyasaponin I，major triterpene saponins of Abruscantoniensis，act on GOT and GPT：influence on transaminase elevation of rat liver cellsconcomitantly exposed to CCl₄ for one hour.Planta Medica.1998，64(1)：5-7.)。到目前为止，国内外均未明确提出鸡骨草治疗肝炎的药效物质基础，更无文献报道鸡骨草植物中治疗肝炎的有效成分为黄酮碳苷类有效成分。为了寻找传统中药鸡骨草的治疗肝炎的药效活性成分，本发明在对中药毛鸡骨草进行系统的化学成分研究基础上，结合与治疗肝炎相关的药效活性筛选，寻找出本植物治疗肝炎的药效活性部位为黄酮碳苷类化合物，主要成分为芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷和芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷。从中药毛鸡骨草中提取分离一种总黄酮碳苷有效部位，及其制备预防和治疗急慢性肝炎及其相关疾病药物的用途，未见文献报道。

发明内容

本发明公开了利用现代分离技术从中药毛鸡骨草中提取分离得到的总黄酮碳苷有效部位，主要含有芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷(1)、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷(2)、芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷(3)等黄酮碳苷类化学成分，化学结构如通式I所示：

其中

1芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷(apigenin-6，8-di-C-β-D-glucopyranoside)，Vicenin；

2芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷(apigenin 6-C-β-D-glucopyranosyl-8-C-α-L-arabinopyranoside)，Schaftoside；

3芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷(apigenin 6-C-α-L-Arabinopyranosyl-8-C-β-D-glucopyranoside)，Isoschaftoside；

本发明的鸡骨草总黄酮碳苷有效部位，由以下方法制备得到：

a.以水溶性溶剂作为提取溶剂提取中药毛鸡骨草原料，提取液浓缩至适量，得到提取浓缩液，所述的水溶性溶剂选自水、乙醇中的一种溶剂或两种溶剂组成的混合溶剂；

b.提取液浓缩液，过滤或离心，滤液或上清液上样于层析柱，依次用水、30～60％乙醇洗脱，洗脱至流出液无色，收集30～60％乙醇洗脱液，减压蒸干，即得总黄酮碳苷提取物，其中层析柱选自大孔吸附树脂柱或聚酰胺树脂柱。

上述的鸡骨草总黄酮碳苷有效部位，其中大孔吸附树脂为聚苯乙烯骨架的极性或非极性大孔吸附树脂，可选自D101型、HPD100型、HPD200型、AB-8型。D101型、AB-8型、HPD100型。其中层析用聚酰胺树脂的规格可选自30～60目、60～100目、100目以上各种孔径。

上述方法得到的总黄酮碳苷提取物再经精制过程，便能得到纯度更高的提取物，所述的精制方法为同样或不同的层析方法纯化，或者将总黄酮碳苷提取物以合适极性的溶剂进行提取，提取液回收溶剂，浓缩、干燥后即得到纯度更高的提取物，所述合适极性的溶剂选自体积比为75-100∶25-0的乙醇∶水、丙酮∶水或甲醇∶水。

本发明进一步提出所述的中药鸡骨草可以是豆科相思子属植物毛鸡骨草Abrus mollis及鸡骨草Abrus cantoniensi，优选为毛鸡骨草。

采用色谱和波谱技术，对鸡骨草黄酮碳苷有效部位进行分离及结构鉴定，分离得到3个黄酮碳苷单体化合物，分别鉴定为芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷(1)、芹菜素-6-C-葡萄糖糖-8-C-阿拉伯苷(2)及芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷(3)。

化合物1：淡黄色粉末(MeOH)，AlCl₃反应阳性，提示为黄酮类化合物，mp 235-236℃，结合¹H，¹³C NMR信息推断该化合物的分子式为C₂₇H₃₀O₁₅。IR(KBr)ν_max cm^-1：3397(OH)，1650(C＝O)，1564(Ar)，1512(Ar)，1042(C-O)。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)δppm：13.80(1H，s，C₅-OH)，10.33(1H，，C₇-OH)，9.40(1H，，C_4′-OH)，8.04(2H，d，J＝8.7Hz，H-2′，6′)，6.91(2H，d，J＝8.7Hz，H-3′，5′)，6.79(1H，s，3-H)，4.80(1H，d，J＝9.4Hz，H-1″of Glc)，4.71(1H，d，J＝9.8Hz，H-1′″of Glc)。¹³C NMR(125MHz，DMSO-d₆)δppm：163.7(C-2)，102.2(C-3)，182.3(C-4)，161.5(C-5)，108.5(C-6)，159.9(C-7)，105.1(C-8)，159.0(C-9)，103.9(C-10)，121.4(C-1′)，128.9(C-2′，6′)，115.9(C-3′，5′)，161.2(C-4′)，73.9(C-1″of Glc)，71.3(C-2″of Glc)，78.8(C-3″ofGlc)，70.3(C-4″of Glc)，81.1(C-5″)，61.2(C-6″of Glc)，72.3(C-1′″of Glc)，70.1(C-2′″of Glc)，79.2(C-3′″of Glc)，70.5(C-4′″of Glc)，81.8(C-5′″of Glc)，59.7(C-6′″of Glc)。根据以上数据，并与文献对照，鉴定化合物1为芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷(apigenin-6，8-di-C-β-D-glucopyranoside，Vicenin)。

化合物2：淡黄色粉末，AlCl₃反应阳性，盐酸-镁粉反应阳性，mp.201-203℃；Positive-ESI-MS m/z：587[M+Na]⁺结合¹H、¹³C NMR信息推断化合物2的分子式为C₂₆H₂₈O₁₄。IR(KBr)ν_max cm^-1：3365(OH)，1649(C＝O)，1583(C＝C)，1512(C＝C)，1092(C-O)。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)δppm：13.79(1H，s，C₅-OH)，8.09(2H，d，J＝6.7Hz，H-2′，6′)，6.91(2H，d，J＝8.8Hz，H-3′，5′)，6.75(1H，s，H-3)，4.78(1H，d，J＝9.4Hz，H-1″of Glc)，4.71(1H，d，J＝9.8Hz，H-1′″of Ara)。¹³C NMR(125MHz，DMSO-d₆)δppm：163.7(C-2)，102.2(C-3)，182.0(C-4)，161.1(C-5)，108.5(C-6)，159.5(C-7)，104.3(C-8)，159.5(C-9)，103.6(C-10)，121.3(C-1′)，129.0(C-2′，6′)，115.9(C-3′，5′)，161.1(C-4′)，73.6(C-1″of Glc)，70.9(C-2″of Glc)，78.7(C-3″of Glc)，70.1(C-4″of Glc)，81.3(C-5″of Glc)，60.9(C-6″)，74.5(C-1′″)，69.1(C-2′″)，75.0(C-3′″)，68.8(C-4′″)，70.7(C-5′″)。根据以上数据，并与文献对照，鉴定化合物2为芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯苷(apigenin 6-C-β-D-glucopyranosyl-8-C-α-L-arabinopyranoside，Schaftoside)。

化合物3：淡黄色粉末，AlCl₃反应阳性，盐酸-镁粉反应阳性，mp.200-201℃；Positive-ESI-MS m/z：587[M+Na]⁺，结合¹H、¹³C NMR信息推断化合物3的分子式为C₂₆H₂₈O₁₄。IR(KBr)ν_max cm^-1：3362(OH)，1649(C＝O)，1582(C＝C)，1520(C＝C)，1090(C-O)。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δppm：13.80(5-OH)，7.99(2H，d，J＝8.4Hz，H-2′，6′)，6.89(2H，d，J＝8.2Hz，H-3′，5′)，6.73(1H，s，H-3)4.80(1H，d，J＝9.2Hz，H-1″of Glc)，4.65(1H，d，J＝8.8Hz，H-1′″ofAra)。¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δppm：163.5(C-2)，102.3(C-3)，181.8(C-4)，161.1(C-5)，108.2(C-6)，161.1(C-7)，104.4(C-8)，154.8(C-9)，102.3(C-10)，121.6(C-1′)，128.7(C-2′，6′)，115.8(C-3′，5′)，158.4(C-4′)，74.3(C-1″of Ara)，74.0(C-2″of Ara)，71.0(C-3″of Ara)，70.0(C-4″of Ara)，68.6(C-5″of Ara)，73.3(C-1′″of Glc)，70.6(C-2′″of Glc)，78.9(C-3′″of Glc)，70.5(C-4′″of Glc)，81.8(C-5′″of Glc)，61.2(C-6′″of Glc)。综合以上信息，并与文献比较，化合物3的以上数据与异夏佛塔苷一致，故鉴定化合物3为芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷(apigenin6-C-α-L-arabinosyl-8-C-β-D-glycopyranoside，Isoschaftoside)。

本发明的鸡骨草黄酮碳苷有效部位提取物的总黄酮碳苷含量40～90％。采用HPLC-UV法，色谱柱为Zorbax SB C₁₈ 4.6×250mm，流动相为甲醇-水梯度洗脱，检测波长为272nm，以分离得到的3种黄酮碳苷为对照，对本发明的总黄酮碳苷提取物进行多成分定量分析，结果表明，该提取物中芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷(1)、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷(2)及芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷(3)的含量分别为17.0％，15.1％，及19.6％。

本发明的鸡骨草总黄酮碳苷提取物可以作为药物活性成分制备成各种临床用药物制剂，其中含有治疗有效量的鸡骨草总黄酮碳苷提取物及药学上可接受的载体。还可以作为活性部位与其它中药提取物/有效部位或相关化学合成药物与药学上可接受的赋性剂或辅料一起用于制备药物组合物。

上述两种药物组合物均可采用药剂学的常规方法制备成各种剂型，如胶囊、片剂、颗粒剂、滴丸、缓释剂等口服制剂及注射剂等胃肠外给药剂型。

药理学试验表明，本发明的鸡骨草总黄酮碳苷有效部位具有显著的保肝降酶、利胆等功效。鸡骨草总黄酮碳苷提取物可以作为活性部位制备预防和治疗急慢性肝炎及其相关疾病药物，急慢性肝炎及其相关疾病包括：病毒性肝炎、免疫性肝炎、酒精性肝炎、脂肪肝和胆囊炎。

本发明的鸡骨草总黄酮碳苷提取物用于临床治疗时，建议剂量范围200～800mg/天，也可根据剂型的不同和疾病严重程度，使用剂量超出该范围。

下面通过实施例对本发明做进一步描述，但本发明并不限于实施例所述范围。

具体实施方式

                        实施例1

鸡骨草总黄酮碳苷提取物的制备

取毛鸡骨草药材1Kg，加70％乙醇回流提取2次，合并醇提液，减压回收至无醇味，离心，上清液上样于已处理好的D101大孔吸附树脂柱吸附后，依次用3升去离子水，5升50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压蒸干，即得鸡骨草总黄酮碳苷提取物21g。采用HPLC-UV法进行定量分析，芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷及芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷的含量分别为17.0％，15.1％，及19.6％。

                        实施例2

鸡骨草总黄酮碳苷提取物的制备

实施例1所得提取物加入10倍量的95％乙醇，加热回流提取1h，趁热抽滤，滤液回收乙醇后真空干燥，即得纯度较高的鸡骨草总黄酮碳苷提取物。采用HPLC-UV法进行定量分析，芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷及芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷的含量分别为20.0％，17.5％，及25.6％。

                        实施例3

鸡骨草总黄酮碳苷提取物的制备

实施例1所得提取物加入10倍量的75％乙醇，加热回流提取1h，趁热抽滤，滤液回收乙醇后真空干燥，即得纯度较高的鸡骨草总黄酮碳苷提取物。采用HPLC-UV法进行定量分析，芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷及芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷的含量分别为22.0％，15.5％，及24.3％。

                        实施例4

鸡骨草总黄酮碳苷提取物的制备

实施例1所得提取物加适量的水溶解后，上样于已处理好的D101大孔吸附树脂柱吸附后，依次用去离子水，20％乙醇、40％乙醇洗脱，收集40％乙醇洗脱液，减压蒸干，即得纯度较高的鸡骨草总黄酮碳苷提取物。采用HPLC-UV法进行定量分析，芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷及芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷的含量分别为23.0％，13.4％，及25.8％。

                        实施例5

鸡骨草总黄酮碳苷提取物的制备

实施例1所得提取物加适量的水溶解后，上样于已处理好聚酰胺柱，依次用去离子水、50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压蒸干，即得纯度较高的鸡骨草总黄酮碳苷提取物。采用HPLC-UV法进行定量分析，芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷及芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷的含量分别为25.0％，18.4％及28.8％。

                        实施例6

鸡骨草总黄酮碳苷提取物的制备

取毛鸡骨草药材1Kg，加水回流提取2次，离心，上清液上样于D101大孔吸附树脂柱吸附后，，依次用3升去离子水，3升20％乙醇、5升50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压蒸干，所得提取物加入10倍量的95％乙醇，加热回流提取1h，趁热抽滤，滤液回收乙醇后真空干燥，即得鸡骨草总黄酮碳苷提取物24g。采用HPLC-UV法进行定量分析，芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷及芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷的含量分别为15.4％，12.5％，及21.6％。

                        实施例7

鸡骨草总黄酮碳苷提取物的制备

取毛鸡骨草药材1Kg，加70％乙醇回流提取2次，合并醇提液，减压回收至无醇味，离心，上清液上样于已处理好聚酰胺树脂柱，依次用3升去离子水，5升50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压蒸干，所得提取物加入10倍量的70％乙醇，加热回流提取1h，趁热抽滤，滤液回收乙醇后真空干燥，即得鸡骨草总黄酮碳苷提取物24g。即得鸡骨草总黄酮碳苷提取物26g。采用HPLC-UV法进行定量分析，芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷及芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷的含量分别为28.0％，21.5％，及28.6％。

                        实施例8

鸡骨草总黄酮碳苷有效部位的药效学研究

1.实验材料

1.1动物

ICR种小白鼠，雌雄各半，初始体重18-22g，购自扬州大学比较医学中心，合格证号：SCXK(苏)2002-0009；SD大鼠，体重180～220g，购自扬州大学比较医学中心，合格证号：SCXK(苏)2002-0009。

1.2试剂与药物

四氯化碳(CCl₄)，分析纯，南京化学试剂一厂；D-半乳糖胺(D-gal)，购自南京生兴生物技术公司；大肠杆菌脂多糖(LPS)，10mg/瓶，Sigma公司，批号：017k098；冻干卡介苗(BCG)，1×10^-6菌苗/mg，上海生物制品研究所，批号：200701001；鸡骨草总黄酮碳苷，本发明实施例1方法制备得到，批号：070911；阳性药1：鸡骨草胶囊，广西玉林制药有限责任公司；阳性药2：甘草酸二铵盐，江苏正大天晴制药有限公司；阳性药3：茵栀黄注射液，山西太行药业股份有限公司；阳性药4：东宝肝泰胶囊，吉林通化东宝药业有限公司。

2.实验方法

2.1鸡骨草总黄酮碳苷提取物对CCl₄致小鼠急性肝损伤的保护作用

ICR种小白鼠，雌雄各半，初始体重18-22g，随机分为7组，每组动物10只，分为正常对照组，模型对照组，鸡骨草总黄酮碳苷提取物(AM Ext)低剂量组(25mg/kg，ig)、中剂量组(50mg/kg，ig)和高剂量组(100mg/kg，ig)，阳性药鸡骨草胶囊(12g/kg，ig)，阳性药甘草酸二铵盐(25mg/kg，iv)。本试验采取预防和治疗结合给药方案，各组动物预防给药5天，每天上午给药1次，第5天上午给药完毕1h后，除正常组外，其余组动物均ip 0.15％四氯化碳10ml/kg，造成急性肝损伤模型，四氯化碳造模后6h、22h，各组分别治疗给药1次，造模24h后，每组动物摘眼球取血，分离血清，测定ALT、AST、TP、ALB和GLU。

2.2鸡骨草总黄酮碳苷提取物对D-半乳糖胺致小鼠急性肝损伤的保护作用

ICR种小白鼠，雌雄各半，初始体重18-22g，分组同上，每组动物10只，本试验采取预防和治疗结合给药方案，各组动物预防给药5天，每天上午给药1次，第5天上午给药完毕1h后，除正常组外，其余组动物均ip D-半乳糖胺(D-gal)800mg/kg。D-gal造模后6h，各组分别治疗给药1次，造模16h后，每组动物摘眼球取血，分离血清，测定ALT、AST、TP、ALB和GLU。

2.3鸡骨草总黄酮碳苷提取物对卡介苗加脂多糖所致小鼠免疫性肝损伤的保护作用

ICR种小白鼠，雌雄各半，初始体重18-22g，随机分为6组，每组动物10只，分为正常对照组，模型对照组，鸡骨草总黄酮碳苷提取物(AM Ext)低剂量组(25mg/kg，ig)、中剂量组(50mg/kg，ig)和高剂量组(100mg/kg，ig)，阳性药甘草酸二铵盐(25mg/kg，iv)。正常组小鼠尾静脉注射生理盐水10ml/kg外，其余各组小鼠尾静脉注射卡介苗(BCG)0.2ml(含1×10^-7活菌)。次日起，各药物组按上述剂量给药。正常对照组和模型组均尾静脉注射等体积的生理盐水，连续9d。9d后，除正常对照组以生理盐水0.2ml/只尾静脉注射外，其余各组以脂多糖(LPS)10μg/0.2ml/只尾静脉注射，10h后每组动物摘眼球取血，分离血清，测定ALT、AST。

2.4鸡骨草总黄酮碳苷提取物对α-萘异硫氰酸脂致小鼠黄疸性肝损伤的保护作用

ICR种小白鼠，雌雄各半，初始体重18-22g，随机分为6组，每组动物10只，分为正常对照组，模型对照组，鸡骨草总黄酮碳苷提取物(AM Ext)低剂量组(25mg/kg，ig)、中剂量组(50mg/kg，ig)和高剂量组(100mg/kg，ig)，阳性药茵栀黄注射液组(2ml/kg，iv)。各药物组按照剂量给药，正常对照组和α-萘异硫氰酸酯模型组每天腹腔注射等体积生理盐水，连续7d。末次给药后1h，除正常对照组外，其余各组小鼠按剂量100mg/kg灌服α-萘异硫氰酸酯造模，同时禁食不禁水，48h后由眼眶静脉丛取血，常规分离血清，采用试剂盒按咖啡因法测定总胆红素(T.BIL)的含量。

2.5鸡骨草总黄酮碳苷提取物对CCl₄致大鼠慢性肝损伤的保护作用

SD大鼠，全部雄性，体重180～220g，随机分为5组，每组动物10只，分为正常对照组，模型对照组，鸡骨草总黄酮碳苷提取物(AM Ext)低剂量组(25mg/kg，ig)、中剂量组(50mg/kg，ig)，阳性药甘草酸二铵盐组(25mg/kg，iv)。除正常对照组外，其余4组每周灌胃50％CCl₄2次(周二、五)，给药体积为0.1ml/100g。除正常对照组及模型组外，其余3组给药组动物在每周灌胃CCl₄的同时，分别ig AM Ext.25mg/kg、50mg/kg，iv甘草酸二铵盐25mg/kg，每天1次。造模和给药时间为1个月，期间全部动物每周测定体重1次，根据体重调整给药量。最后1次灌胃CCl₄ 24h后，全部动物股动脉取血，分离血清，测定血清丙氨酸氨基转换酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转换酶(AST)、总胆红素(TB)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(G)、白球比(A/G)、血糖(GLU)。测定肝脏重量系数，另取部分肝脏福尔马林固定后进行组织病理学检查。

2.6鸡骨草总黄酮碳苷提取物对酒精性大鼠肝损伤的保护作用

SD大鼠，全部雄性，体重180～220g，随机分为5组，每组动物10只，分为正常对照组，模型对照组，鸡骨草总黄酮碳苷提取物(AM Ext)低剂量组(25mg/kg，ig)、中剂量组(50mg/kg，ig)，阳性药东宝肝泰胶囊(600mg/kg，ig)。正常对照组动物给予普通饲料，其余4组动物每天上午灌胃56度红星二锅头0.5ml/100g，每天下午灌胃3％胆固醇高脂乳剂1ml/100g(高脂乳剂配制：将3g胆固醇溶于熔化的6g猪油中；将0.6g胆酸钠、0.3g甲基硫氧嘧啶溶于约40ml蒸馏水中再加1.2ml丙二醇。将两液混匀，加1.2ml吐温80搅拌成乳剂，最后加蒸馏水定溶至100ml)；另每隔5d皮下注射40％CCl₄橄榄油溶液0.15ml/100g，共5次。各药物组每日灌胃造模后3h按上述剂量灌胃给药1次。造模和给药时间为20d，期间全部动物每周测定体重1次，根据体重调整给药量。最后1次皮下注射40％CCl₄橄榄油溶液后16h，全部动物股动脉取血，取肝制备10％(丙二醇-丙酮，1∶1)肝匀浆，离心，检测肝匀浆上清液中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)，检测血清中ALT和AST。另取部分肝脏福尔马林固定后进行组织病理学检查。

3.结果与讨论

3.1鸡骨草总黄酮碳苷提取物对CCl₄致小鼠急性肝损伤的保护作用

CCl₄造模24hr后，与正常对照组相比，模型组血清中ALT和AST活力显著升高(P＜0.01)。阳性药甘草酸二铵盐(25mg/kg，iv)、鸡骨草胶囊组(12g/kg，ig)及测试药物组鸡骨草总黄酮碳苷提取物25、50、100mg/kg三个剂量组均可显著降低CCl₄所致的小鼠的ALT和AST活力升高，呈剂量相关性。结果见表1。

表1.鸡骨草总黄酮碳苷对CCl₄致小鼠急性肝损伤的影响

^*P＜0.05，^**P＜0.01vs模型组；^#P＜0.05，^##P＜0.01vs正常组.

3.2鸡骨草总黄酮碳苷提取物对D-半乳糖胺致小鼠急性肝损伤的保护作用

D-半乳糖胺造模24hr后，与正常对照组相比，模型组血清中ALT和AST活力显著升高(P＜0.01)。阳性药甘草酸二铵盐(25mg/kg，iv)、鸡骨草胶囊组(12g/kg，ig)及测试药物鸡骨草总黄酮碳苷提取物25、50、100mg/kg三个剂量组均可显著降低D-半乳糖胺致所致的小鼠的ALT和AST活力升高，呈剂量相关性。结果见表2。

表2.鸡骨草总黄酮碳苷对半乳糖胺致小鼠急性肝损伤的影响

^*P＜0.05，^**P＜0.01vs模型组；^#P＜0.05，^##P＜0.01vs正常组.

3.3鸡骨草总黄酮碳苷提取物对卡介苗加脂多糖所致小鼠免疫性肝损伤的保护作用

造模10h后，与正常对照组相比，模型组血清ALT活力和AST活力显著升高(P＜0.01)。阳性药甘草酸二铵盐(25mg/kg，iv)和测试药物鸡骨草总黄酮碳苷提取物25、50、100mg/kg三个剂量组均可显著降低卡介苗联合LPS引起的ALT和AST活力升高。结果见表3。

表3.鸡骨草总黄酮碳苷对小鼠免疫性肝损伤的影响

^*P＜0.05，^**P＜0.01vs模型组；^#P＜0.05，^##P＜0.01vs正常组.

3.4鸡骨草总黄酮碳苷提取物对α-萘异硫氰酸酯致小鼠黄疸性肝损伤的保护作用

与对照组相比，α-萘异硫氰酸酯显著提高小鼠血清中T.BIL含量(P＜0.01)，引起小鼠黄疸性肝损伤。阳性药茵栀黄注射液和鸡骨草总黄酮碳苷提取物的三个剂量组均能抑制α-萘异硫氰酸酯引起的小鼠血清T.BIL含量升高(与模型组比较，P＜0.01)，呈剂量相关性。结果见表4。

表4.鸡骨草总黄酮碳苷对α-萘异硫氰酸酯致小鼠黄疸性肝损伤的影响

^*P＜0.05，^**P＜0.01vs模型组；^#P＜0.05，^##P＜0.01vs正常组.

3.5鸡骨草总黄酮碳苷提取物对CCl₄致大鼠慢性肝损伤的保护作用

与对照组相比，CCl₄所致慢性肝损伤模型组大鼠表现为血清ALT、AST和ALP水平显著增高(均为P＜0.01)，GLU水平显著降低(P＜0.01)。鸡骨草总黄酮碳苷提取物(AM Ext.)的两个剂量组对多数指标均有不同程度的改善作用，与模型组相比达到统计学显著差异的指标包括：ALT，AST，ALP和GLU，结果见表5。CCl₄致大鼠慢性肝损伤的病理学检查结果计数资料以非参数方法进行统计学处理，结果见表6。

表5.鸡骨草总黄酮碳苷.对CCl₄致大鼠慢性肝损伤血液生化学指标的影响

^*P＜0.05，^**P＜0.01vs正常组；^#P＜0.05，^##P＜0.01vs模型组

表6.鸡骨草总黄酮碳苷.对CCl₄致大鼠慢性肝损伤病理结果

^#P＜0.05、^##P＜0.01vs模型组

3.6鸡骨草总黄酮碳苷提取物对酒精性大鼠肝损伤的保护作用

与对照组相比，酒精性大鼠肝损伤模型组大鼠表现为血清TC、TG、ALT和AST水平显著增高(均为P＜0.01)。阳性药东宝肝泰胶囊(600mg/kg)及测试药物组鸡骨草总黄酮碳苷提取物25、50mg/kg二个剂量组均可显著降低酒精等综合因素所致大鼠的TC、TG、ALT和AST活力升高，呈剂量相关性。结果见表7。病理切片检查结果表明，酒精性肝损伤造模大鼠肝与正常组比较有明显的组织学变化，肝细胞呈弥漫性轻至重度脂肪变性，可见明显脂滴，并有少量炎细胞浸润。阳性药东宝肝泰、测试药物鸡骨草总黄酮碳苷二个剂量组与模型组比较，均有明显的组织学改善，肝细胞脂肪变性显著改善，肝组织的脂肪变性和脂滴空泡均明显减少。

表7.鸡骨草总黄酮碳苷对酒精性大鼠肝损伤的影响

^*P＜0.05，^**P＜0.01vs正常组；^#P＜0.05，^##P＜0.01vs模型组

Claims (5)

1.一种从中药毛鸡骨草中提取分离得到的总黄酮碳苷提取物，该提取物的总黄酮碳苷含量达40％以上，其中芹菜素-6，8-二-C-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷、芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-葡萄糖苷所占比例分别为10～30％，5～30％和10～40％，所述提取物由以下方法制备得到：

a.以水溶性溶剂作为提取溶剂提取中药毛鸡骨草原料，提取液浓缩至适量，得到提取浓缩液，所述的水溶性溶剂选自水、乙醇的一种溶剂或两种溶剂组成的混合溶剂；

b.上述a得到的提取液浓缩液，过滤或离心，滤液或上清液上样于层析柱，以水、30～60％乙醇梯度洗脱，收集30～60％乙醇洗脱液，减压回收至干，即得总黄酮碳苷提取物，其中所述的层析柱选自大孔吸附树脂柱或聚酰胺树脂柱。

2.根据权利要求1的总黄酮碳苷提取物，其中通过制备方法得到的总黄酮碳苷提取物再经精制过程，便能得到纯度更高的提取物，所述的精制过程为同样或不同的层析方法纯化，或者将总黄酮碳苷提取物以合适极性的溶剂进行提取，提取液回收溶剂，浓缩、干燥后即得到纯度更高的提取物，所述合适极性的溶剂选自体积比为75-100∶25-0的乙醇∶水、丙酮∶水或甲醇∶水。

3.一种药物组合物，其特征是：含有权利要求1至2任一项的总黄酮碳苷提取物及药学上可接受的载体。

4.权利要求1至2任一项的总黄酮碳苷提取物及权利要求3的药物组合物在制备预防和治疗急慢性肝炎及其相关疾病药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于急慢性肝炎及其相关疾病选自：病毒性肝炎、免疫性肝炎、酒精性肝炎、脂肪肝和胆囊炎。