CN103127235B - 一种具有保肝和治疗肝纤维化作用药物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药品制备技术领域,具体地说是一种具有保肝和治疗肝纤维化作用药物的制备方法,该方法采用水提醇沉,超声提取,固相萃取,喷雾干燥一系列工艺制得巧玲花颗粒剂或胶囊;本发明制备的药物,具有明显的保肝和治疗纤维化的作用,且药效作用物质基础明确、质量可控;本发明提供的该药物的制备方法,过程简单,且原料易得,适合大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及医药品制备技术领域,具体地说是一种具有保肝和治疗肝纤维化作用药物的制备方法。
背景技术
肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是肝组织对反复或慢性肝实质炎症、坏死或慢性肝损伤等的修复反应,是多种类型细胞、氧化应激、细胞因子和生长因子等一系列复杂作用的结果,以细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)成分的过度增生与异常沉积为主要特征。肝纤维化是慢性肝病(病毒性肝炎、脂肪肝、酒精肝等)重要的病理特征,是晚期肝病的共同病理归属,严重威胁人类健康,如果不及时治疗,其中25-40%肝纤维化最终发展为肝硬化乃至肝癌,因此,防治肝纤维化是临床治疗慢性肝病的关键环节。
目前的研究认为肝纤维化病变经过适当的积极治疗有希望延缓甚至逆转,而发展到肝硬化阶段则难以逆转。国际著名肝病学家Hans Popper 曾指出,谁能阻止或减慢肝纤维化的发生、发展,谁就将会治愈大多数慢性肝病患者,因而,阻止肝纤维化的形成与发展对防治慢性肝病具有重要意义。尽管科学家从肝纤维化发生发展的不同环节入手做了很多研究,但由于肝纤维化病理机制的多环节和复杂性,单一环节或靶向的干预效果尚不理想,迄今仍没有十分满意的治疗药物,因此,深入了解药物抗肝纤维化分子作用机制,从不同作用靶点寻找新的更有效、更安全的抗肝纤维化药物是亟待解决的难题。
中医药具有多成分、多环节和多靶点的特色和优势,对病理复杂的疾病可以发挥综合治疗作用,中药抗肝纤维化可以从多个方面同时作用。另外,肝纤维化的逆转是一个渐变的过程,不可能一蹴而就,需要一个较长时间的服用药物的过程,在这个治疗过程中,中药治疗可以充分发挥其低毒或无毒,以及对正常肝细胞具有保护作用,适合长期服用的优点。
巧玲花(Syringa pubescens Turca)为木犀科丁香属植物,灌木,又名毛(叶)丁香,小叶丁香,产自河南、河北、陕西等省地。经前期研究表明,巧玲花中含有三萜类、黄酮类和皂苷类化合物,发现其粗提物有一定的预防和治疗化学性及免疫性肝损伤的作用。进一步的药理实验表明,该粗提物抗肝纤维化疗效显著,治愈平稳持久,且无毒副作用。
经对河南豫西伏牛山区巧玲花的民间应用调查,发现巧玲花在豫西民间泡茶饮用治疗肝炎、肝硬化、肝癌等由来己久,其治疗肝病疗效明显,但还尚未发现有以巧玲花为原料制备的具有保肝和治疗肝纤维化作用的药物。
发明内容
为解决现有技术中尚未有以巧玲花为原料制备的具有保肝和治疗肝纤维化作用的药物的问题,本发明提供一种具有保肝和治疗肝纤维化作用药物的制备方法。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:
一种具有保肝和治疗肝纤维化作用药物的制备方法,包括以下步骤:
步骤一:取干燥的巧玲花为原料,加入10-15倍量的水浸泡24-36h,然后在60-80℃条件下超声提取2-4次,每次30-50min,合并提取液,过滤,滤液减压浓缩成密度为1.05-1.12的浸膏,备用;
步骤二:取步骤一制得的浸膏,加入食品级乙醇,使溶液中乙醇的含量为50-70%,搅拌均匀后静止36-72h,过滤,弃滤渣,减压回收滤液中乙醇,浓缩至浸膏,备用;
步骤三:将步骤二所得的浸膏用无水乙醇溶解,过滤,滤液与硅胶和硅藻土混合搅拌,其中硅胶与硅藻土的质量比为2:1~1:2,混合均匀后置于常温下挥干溶剂,混合物依次用乙酸乙酯和无水乙醇分别萃取,取无水乙醇萃取所得溶液,过滤,滤液浓缩至60℃相对密度为1.1-1.2的浸膏,备用;
步骤四:取步骤三所得的浸膏加辅料喷雾干燥制粒,得巧玲花颗粒剂;或取步骤三所得的浸膏喷雾干燥,得巧玲花喷雾干燥粉,将此干燥粉装胶囊,即得巧玲花胶囊;
所述步骤一中的巧玲花为巧玲花的花或含有嫩叶或嫩枝的花;
所述步骤三中用于溶解浸膏的无水乙醇为浸膏质量的5-7倍;
所述步骤三中硅胶和硅藻土的总重量为浸膏重量的4-7倍;
所述步骤四中辅料为淀粉和葡萄糖,且淀粉和葡萄糖的质量比为98:2~99:1。
本发明的有益效果:
本发明采用水提醇沉,具有提取量大、工艺简单的特点,用水和乙醇作为溶剂,经济简便,易于工业化,超声提取效率高,温度较低,避免了在煮沸条件下对某些成分糖苷类成分含量的影响;
本发明采用乙醇溶解用水提取浓缩的浸膏,过滤浓缩,然后再用乙醇溶解,可有效去除浓缩的浸膏中的水分,减小了水分对后续固相萃取的干扰,提高了固相萃取效率;
本发明采用硅胶和硅藻土混合搅拌固相萃取,提高了分离提纯效率,且萃取溶剂用量少,成本低,工业化操作方便;
以其中主要成分,松果菊苷和橄榄苦苷含量为依据,在保证药学的前提下,对胶囊的质量控制方法进行了研究,建立了其中两个主要成分,所得的产品中松果菊苷含量>8%,橄榄苦苷的含量>10%;
本发明制备的药物,具有明显的保肝和治疗纤维化的作用,且药效作用物质基础明确、质量可控;本发明提供的该药物的制备方法,过程简单,且原料易得,适合大规模工业化生产。
附图说明
图1松果菊苷和橄榄苦苷对照品HPLC谱图;
图2实施例1供试品HPLC谱图;
图3实施例2供试品HPLC谱图;
图4实施例3供试品HPLC谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的阐述。
一种具有保肝和治疗肝纤维化作用药物的制备方法,包括以下步骤:
步骤一:取干燥的巧玲花为原料,加入10-15倍量的水浸泡24-36h,然后在60-80℃条件下超声提取2-4次,每次30-50min,合并提取液,过滤,滤液减压浓缩成密度为1.05-1.12的浸膏,备用;
步骤二:取步骤一制得的浸膏,加入食品级乙醇,使溶液中乙醇的含量为50-70%,搅拌均匀后静止36-72h,过滤,弃滤渣,减压回收滤液中乙醇,浓缩至浸膏,备用;
步骤三:将步骤二所得的浸膏用无水乙醇溶解,过滤,滤液与硅胶和硅藻土混合搅拌,其中硅胶与硅藻土的质量比为2:1~1:2,混合均匀后置于常温下挥干溶剂,混合物依次用乙酸乙酯和无水乙醇分别萃取,取无水乙醇萃取所得溶液,过滤,滤液浓缩至60℃相对密度为1.1-1.2的浸膏,备用;
步骤四:取步骤三所得的浸膏加辅料喷雾干燥制粒,得巧玲花颗粒剂;或取步骤三所得的浸膏喷雾干燥,得巧玲花喷雾干燥粉,将此干燥粉装胶囊,即得巧玲花胶囊;
所述步骤一中的巧玲花为巧玲花的花或含有嫩叶或嫩枝的花;
所述步骤三中用于溶解浸膏的无水乙醇为浸膏质量的5-7倍;
所述步骤三中硅胶和硅藻土的总重量为浸膏重量的4-7倍;
所述步骤四中辅料为淀粉和葡萄糖,且淀粉和葡萄糖的质量比为98:2~99:1。
以下为本发明制得药物主要成分含量的测试方法:
1、仪器、试剂及药材
(1) Agilent1100高效液相色谱仪:四元泵和二极管阵列检测器(G1313A);在线脱气,柱温箱,自动进样器,Agilent1100色谱工作站; 国产AR级2140型电子分析天平。
(2) 对照品松果菊苷和橄榄苦苷,经NMR和 ESI-MS鉴定了化合物的结构,经HPLC测定纯度大于98%。
(3) 乙腈为色谱纯,水为双蒸水,磷酸二氢钾为色谱纯,其余试剂均为分析纯。
2、检测方法
(1) 吸收波长的选择
取松果菊苷和橄榄苦苷溶解于甲醇中用可见紫外分光光度计进行全波长扫描,用甲醇作空白对照,在波长200~400 nm间扫描,可以看出松果菊苷在330~335 nm处有明显的吸收峰,橄榄苦苷在232和285 nm两处有明显吸收峰。
(2) 色谱条件
色谱仪:Agilent1100高效液相色谱仪;
色谱柱:Zorbax SB C18色谱柱(4.6×250mm,5μm);
流动相:乙腈-磷酸二氢钾缓冲盐(PH=2.5),梯度洗脱【(18:82)0-6min;(30:70)6-15min】
流 速: 体积流速为1.0 ml·min-1;
检测波长: 334 nm(0~15min), 285 nm(15min后);
柱温:30℃;
进样量:10 μL。
(3) 对照品溶液的制备
精密称取一定量对照品松果菊苷和橄榄苦苷混合,配置成一定浓度混合溶液,即为对照品溶液。
(4) 供试品溶液的制备
精密称取一定量的巧玲花胶囊,用甲醇溶剂,配置成溶液,滤液用0.45μm的微孔滤膜过滤,定溶于100mL容量瓶中,即为供试品溶液。
实施例1
一种具有保肝和治疗肝纤维化作用药物的制备方法,包括以下步骤:
步骤一:取干燥的含有嫩叶的巧玲花1kg,加入15倍量的水浸泡36h,在80℃条件下超声提取4次,每次50分钟,合并提取液,过滤,滤液减压浓缩成密度为1.05-1.12的浸膏,备用;
步骤二:取步骤一制得的浸膏,加入食品级95%乙醇,使溶液中乙醇的含量为70%,搅拌均匀后静止72h,过滤,弃滤渣,减压回收滤液中乙醇,浓缩至浸膏,备用;
步骤三:将步骤二所得的浸膏用7倍量的无水乙醇溶解,过滤,滤液用质量倍数为浸膏7倍量的硅胶和硅藻土混合物拌样,其中硅胶与硅藻土的质量比为2:1,混合均匀后置于常温下挥干溶剂,混合物依次用乙酸乙酯和无水乙醇分别萃取,取无水乙醇萃取所得溶液,过滤,滤液浓缩至60℃相对密度为1.1-1.2的浸膏,备用;
步骤四:取一半质量步骤三所得的浸膏,按照每5份加入辅料4份的比例称取辅料,将辅料用水制成混悬液,将此辅料混悬液加入浸膏中充分混合均匀,喷雾干燥制粒,得颗粒剂130g;所述辅料为淀粉和葡萄糖,其质量比为98:2;
取剩余一半质量的浸膏喷雾干燥,得巧玲花喷雾干燥粉,将此干燥粉装胶囊,得胶囊230粒。
采用前述分析方法方法,按照外标法,对得到的胶囊的主要成分的含量进行测定,对照品和样品的色谱图见图1和图2,结果显示:其中橄榄苦苷含量为12.3%,松果菊苷含量为8.7%。
实施例2
一种具有保肝和治疗肝纤维化作用药物的制备方法,包括以下步骤:
步骤一:取干燥的含有嫩枝的巧玲花1kg,加入15倍量的水浸泡36h,在80℃条件下超声提取4次,每次50分钟,合并提取液,过滤,滤液减压浓缩成密度为1.05-1.12的浸膏,备用;
步骤二:取步骤一制得的浸膏,加入食品级95%乙醇,使溶液中乙醇的含量为70%,搅拌均匀后静止72h,过滤,弃滤渣,减压回收滤液中乙醇,浓缩至浸膏,备用;
步骤三:将步骤二所得的浸膏用5倍量的无水乙醇溶解,过滤,滤液用质量倍数为浸膏4倍量的硅胶和硅藻土混合物拌样,其中硅胶与硅藻土的质量比为1:1,混合均匀后置于常温下挥干溶剂,混合物依次用乙酸乙酯和无水乙醇分别萃取,取无水乙醇萃取所得溶液,过滤,滤液浓缩至60℃相对密度为1.1-1.2的浸膏,备用;
步骤四:取一半质量步骤三所得的浸膏,按照每5份加入辅料3份的比例称取辅料,将辅料用水制成混悬液,将此辅料混悬液加入浸膏中充分混合均匀,喷雾干燥制粒,得颗粒剂125 g;所述辅料为淀粉和葡萄糖,其质量比为99:1;
取剩余一半质量的浸膏喷雾干燥,得巧玲花喷雾干燥粉,将此干燥粉装胶囊,得胶囊250粒。
采用前述分析方法方法,按照外标法,对得到的胶囊的主要成分的含量进行测定,对照品和样品的色谱图见图1和图3,结果显示:其中橄榄苦苷含量为11.9%,松果菊苷含量为8.4%。
实施例3
一种具有保肝和治疗肝纤维化作用药物的制备方法,包括以下步骤:
步骤一:取干燥的巧玲花1kg,加入10倍量的水浸泡24h,在60℃条件下超声提取2次,每次30分钟,合并提取液,过滤,滤液减压浓缩成密度为1.05-1.12的浸膏,备用;
步骤二:取步骤一制得的浸膏,加入食品级95%乙醇,使溶液中乙醇的含量为50%,搅拌均匀后静止48h,过滤,弃滤渣,减压回收滤液中乙醇,浓缩至浸膏,备用;
步骤三:将步骤二所得的浸膏用7倍量的无水乙醇溶解,过滤,滤液用质量倍数为浸膏7倍量的硅胶和硅藻土混合物拌样,其中硅胶与硅藻土的质量比为1:2,混合均匀后置于常温下挥干溶剂,混合物依次用乙酸乙酯和无水乙醇分别萃取,取无水乙醇萃取所得溶液,过滤,滤液浓缩至60℃相对密度为1.1-1.2的浸膏,备用;
步骤四:取一半质量步骤三所得的浸膏,按照每5份加入辅料1份的比例称取辅料,将辅料用水制成混悬液,将此辅料混悬液加入浸膏中充分混合均匀,喷雾干燥制粒,得颗粒剂80 g;所述辅料为淀粉和葡萄糖,其质量比为99:1;
取剩余一半质量的浸膏喷雾干燥,得巧玲花喷雾干燥粉,将此干燥粉装胶囊,得胶囊200粒。
采用前述分析方法方法,按照外标法,对得到的胶囊的主要成分的含量进行测定,对照品和样品的色谱图见图1和图4,结果显示:其中橄榄苦苷含量为12.9%,松果菊苷含量为9.2%。
以下为本发明所制得药物的药理试验研究:
1、试验材料
实施例1得到的胶囊作为供试样品,四氯化碳(分析纯,天津市福晨化学试剂厂)造模,采用水飞蓟素(由德国马博士药厂生产)作为阳性对照。SD级Wistar大鼠,雌雄各半,体重190-250g,随机分组,标准饲料喂养,自由进水(河南科技大学实验动物中心提供);
血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、血清冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、血清白蛋白(ALB)试剂盒和血清球蛋白(GLB)试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)。
2、试验方法
将大鼠随机分组,分为:(1) 正常对照组:以皮下注射植物油,2次/周,并以蒸馏水灌胃,1次/天,持续 6周;(2) 阳性对照组:皮下注射CCL4与植物油1:1混合物,2次/周;10%酒精+蒸馏水灌胃,1次/天,持续6周;(3) 剂量组:用 CCL4与植物油1:1混合物,2次/周,10%酒精,灌胃,同时分别给予实施例1制得的胶囊供试样品,100mg/kg/天,持续6周。
3、试验结果
1) 抗肝纤维化作用
(1) 样品对肝纤维化大鼠脏器指数的影响
试验结果(见表1):与正常对照组比较,模型组大鼠肝脏指数和脾脏指数显著升高(p<0.01);样品高、中、低剂量组可显著降低模型组大鼠肝脏指数和脾脏指数。
表1样品对肝纤维化大鼠脏器指数的影响(x±s,n=12)
与正常对照组相比:##p<0.01;与模型组相比:*p<0.05,**p<0.01。
样品对肝纤维化大鼠AST、ALT、HA、LN和Hyp的影响
试验结果(表2):与正常对照组比较,模型组大鼠血清ALT和AST含量显著升高(p<0.01),样品高、中、低剂量组可显著降低模型组大鼠血清ALT和AST含量。
表2样品对肝纤维化大鼠AST、ALT、HA、LN和Hyp的影响( x ±s,n=12)
与正常对照组相比:##p<0.01;与模型组相比:*p<0.05,**p<0.01。
样品对肝纤维化大鼠GSH、MDA和SOD的影响
试验结果(见表3):与正常对照组比较,模型组大鼠血清GSH和SOD显著降低(p<0.01),MDA显著升高(p<0.01),样品可显著升高模型组大鼠血清GSH和SOD并降低MDA。
表3 样品对肝纤维化大鼠GSH、MDA和SOD的影响( x ±s,n=12)
与正常对照组相比:##p<0.01;与模型组相比:*p<0.05,**p<0.01。
2) 保肝作用
研究考察了样品对四氯化碳、D-半乳糖胺化学性肝损伤的保护作用,结果如下:
样品对CCl4 所致小鼠化学性肝损伤的保护作用
试验结果(见表4):样品连续灌胃7天,能抑制CCl4和D-GalN引起小鼠急性肝损伤所致的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和谷氨酸氨基转移酶(AST)的升高。
表4 样品对CCl4 所致小鼠化学性肝损伤ALT、AST 的影响
与正常对照组比较:##p<0.01;与模型对照组比较:*p<0.05,**p<0.01。
样品对D-GalN所致小鼠化学性肝损伤的保护作用
结果显示(见表5),样品连续灌胃14天,与正常对照组比较,D-GalN模型对照组小鼠ALT、AST含量显著升高(p<0.01),证明D-GalN小鼠急性肝损伤模型造模成功。样品高、中、低剂量组均可显著降低D-GalN急性肝损伤小鼠ALT、AST含量,与模型对照组比较差异显著(P<0.01)。
表5 样品对D-GalN所致大鼠化学性肝损伤ALT、AST的影响
与正常对照组比较:##p<0.01;与模型对照组比较:*p<0.05,**p<0.01。
以上试验结果说明:巧玲花胶囊具有较好的保肝和防治肝纤维化的作用。
Claims (5)
1.一种具有保肝和治疗肝纤维化作用药物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一:取干燥的巧玲花为原料,加入10-15倍量的水浸泡24-36h,然后在60-80℃条件下超声提取2-4次,每次30-50min,合并提取液,过滤,滤液减压浓缩成密度为1.05-1.12的浸膏,备用;
步骤二:取步骤一制得的浸膏,加入食品级乙醇,使溶液中乙醇的含量为50-70%,搅拌均匀后静止36-72h,过滤,弃滤渣,减压回收滤液中乙醇,浓缩至浸膏,备用;
步骤三:将步骤二所得的浸膏用无水乙醇溶解,过滤,滤液与硅胶和硅藻土混合搅拌,其中硅胶与硅藻土的质量比为2:1~1:2,混合均匀后置于常温下挥干溶剂,混合物依次用乙酸乙酯和无水乙醇分别萃取,取无水乙醇萃取所得溶液,过滤,滤液浓缩至60℃相对密度为1.1-1.2的浸膏,备用;
步骤四:取步骤三所得的浸膏加辅料喷雾干燥制粒,得巧玲花颗粒剂;或取步骤三所得的浸膏喷雾干燥,得巧玲花喷雾干燥粉,将此干燥粉装胶囊,即得巧玲花胶囊。
2.如权利要求1所述的具有保肝和治疗肝纤维化作用药物的制备方法,其特征在于:所述步骤一中的巧玲花为巧玲花的花或含有嫩叶或嫩枝的花。
3.如权利要求1所述的具有保肝和治疗肝纤维化作用药物的制备方法,其特征在于:所述步骤三中用于溶解浸膏的无水乙醇为浸膏质量的5-7倍。
4.如权利要求1所述的具有保肝和治疗肝纤维化作用药物的制备方法,其特征在于:所述步骤三中硅胶和硅藻土的总重量为浸膏重量的4-7倍。
5.如权利要求1所述的具有保肝和治疗肝纤维化作用药物的制备方法,其特征在于:所述步骤四中辅料为淀粉和葡萄糖,且淀粉和葡萄糖的质量比为98:2~99:1。
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小叶丁香抗肝纤维化有效成分含量测定方法的研究;王争等;《河南省化学会2010年学术年会论文摘要集》;20100924;第1段 * |
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Granted publication date: 20140730 Termination date: 20160227 |