CN101890084B

CN101890084B - 黑种草子总苷提取物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101890084B
Application number: CN2010102509361A
Authority: CN
Inventors: 赵军; 徐芳; 徐建国; 杨伟俊; 刘亚婷; 谭为
Original assignee: INST OF PHARMACOLOGY XINJIANG UYGUR AUTONOMOUS REGIONS
Current assignee: INST OF PHARMACOLOGY XINJIANG UYGUR AUTONOMOUS REGIONS
Priority date: 2010-08-11
Filing date: 2010-08-11
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2030-08-11
Also published as: CN101890084A

Abstract

本发明涉及植物提取物及其制备方法和应用的技术领域，是一种黑种草子总苷提取物及其制备方法和应用，特别在炎症及过敏性疾病治疗上的应用。该黑种草子总苷提取物是从黑种草种子中提取得到组合物，该组合物按重量百分比含有50%至80%的皂苷、3%至11%的黄酮，该组合物为淡棕黄色粉末、易溶于水。本发明以大孔树脂柱层析的方法固相萃取富集包含皂苷和黄酮类成分，在吸附黑种草总苷的同时将植物中无效成分糖类等分离，并在保证黑种草子药材中皂苷和黄酮类成分含量的前提下，选择性地去除鞣质和糖类，能有效的富集黑种草总苷。本发明代替了传统的有机溶媒萃取法，避免了有机溶媒的污染，具有成本低、无污染、有利于工业化生产的优点。

Description

黑种草子总苷提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及植物提取物及其制备方法和应用的技术领域，是一种黑种草子总苷提取物及其制备方法和应用，特别在炎症及过敏性疾病治疗上的应用。

背景技术

黑种草子为毛茛科黑种草属一年生草本植物黑种草Nigella damascena L.、家（果）黑种草Nigella sativa L.、瘤果（腺毛）黑种草Nigella glandulifera Freyn的种子。广泛分布于中亚、西亚以及地中海沿岸地区。具有利尿、补脑肾、活血、解毒、下乳通经、止咳和乌发等功效，用于胸闷气促、乳肿、耳鸣和乳汁减少等病症的治疗，是维吾尔医临床常用的药物。近年来药理研究表明黑种草子具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、降血糖、保肝等多种生物活性。黑种草子含有大量具有显著生物活性的不饱和脂肪酸和挥发油。阿吉等学者就瘤果黑种草子油制备方法及其降糖作用申报了国家发明专利（申请号200710147492.7）。然而化学成分的研究表明，黑种草子中除富含的挥发油和脂肪酸外，还含有黄酮、皂苷和生物碱等化合物。其中皂苷和黄酮类化合物是其中含量最高的两类化合物，同时也是黑种草子水溶性成分中的代表性化合物。据文献报道，黑种草子水提取物有着显著的抗氧化、抗肿瘤和保肝等生物活性。目前对黑种草水溶性成分的研究仅限于其中各单体化合物的提取分离纯化，而没有对其有效部位总皂苷和总黄酮的制备工艺及药效进行研究。

发明内容

本发明提供了一种黑种草子总苷提取物及其制备方法和应用，其克服了现有技术之不足，其提取物未被有机溶媒污染，生产效率高，生产成本低，利于工业化生产。

本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种黑种草子总苷提取物，其是从黑种草种子中提取得到组合物，该组合物按重量百分比含有50 %至 80%的皂苷、3%至 11%的黄酮，该组合物为淡棕黄色粉末、易溶于水。

下面对上述技术方案之一作进一步优化或/和选择：

上述黑种草种子的来源植物为黑种草Nigella damascena L.或家黑种草即果黑种草Nigella sativa L.或瘤果黑种草即腺毛黑种草Nigella glandulifera Freyn的种子。

本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种上述的黑种草子总苷提取物的制备方法，其采用如下步骤进行：包括黑种草子的脱脂、提取、浓缩、大孔树脂吸附、洗脱、浓缩干燥步骤得到黑种草子总苷提取物。

下面对上述技术方案之二作进一步优化或/和选择：

上述制备方法可按下述步骤进行：黑种草子粉碎后，在封闭式连续提取装置中以水或体积百分比为10%的乙醇水溶液或体积百分比为30%的乙醇水溶液或体积百分比为50%的乙醇水溶液或体积百分比为70%的乙醇水溶液或体积百分比为50%的甲醇水溶液连续回流提取3小时至6小时，浓缩提取液至无醇味，大孔树脂吸附，以10倍至20倍树脂柱体积的去离子水及体积百分比为10%的乙醇水溶液洗去糖类和鞣质部分，再以5倍至8倍树脂柱体积的体积百分比为30%至70%的乙醇水溶液洗脱，体积百分比为30%至70%的乙醇水洗脱液减压浓缩后，真空或喷雾干燥，得到淡棕黄色粉末，即黑种草子总苷提取物。

上述所使用的大孔树脂可是AB-8的弱极性大孔吸附树脂。

上述所使用的大孔树脂可是D101的弱极性大孔吸附树脂。

上述所使用的大孔树脂可是HPD-600的弱极性大孔吸附树脂。

本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种上述的黑种草子总苷提取物在制备治疗关节炎疾病的药物的应用。

本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：一种上述的黑种草子总苷提取物在制备治疗过敏性疾病的药物的应用。

本发明的有益效果：本发明以大孔树脂柱层析的方法固相萃取富集包含皂苷和黄酮类成分，在吸附黑种草总苷的同时将植物中无效成分糖类等分离，并在保证黑种草子药材中皂苷和黄酮类成分含量的前提下，选择性地去除鞣质和糖类，能有效的富集黑种草总苷。本发明代替了传统的有机溶媒萃取法，避免了有机溶媒的污染，具有成本低、无污染、有利于工业化生产的优点。

具体实施方式

总皂苷含量测定方法：应用黑种草总苷中主要特征性成分常春藤皂苷元3-O-b-D-吡喃木糖基-(1→3)-a-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-a-L-吡喃阿拉伯糖-28-O-a-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-b-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-b-D-吡喃葡萄糖酯苷做为对照品，香草醛浓硫酸显色，采用分光光度法于波长529 nm处，测定不同浓度对照品的吸收度，根据吸收度与浓度间的关系，绘制出标准曲线，以甲醇溶解黑种草总苷定容，香草醛浓硫酸比色法测定吸收度。根据所得吸收度便可由标准曲线上查出对照品的含量，并计算出黑种草总苷中总皂苷的标示含量。

该总皂苷测定方法具有优异的准确性、稳定性及重现性，能精确测定黑种草总皂苷的含量。根据此方法测定的本发明黑种草子总苷提取物中总皂苷的重量百分比在50%至80%之间。

总黄酮测定方法采用《中国药典》2005版测定方法，测得本发明黑种草子总苷提取物中总黄酮含量的重量百分比在3%至11%之间。

为了更好地理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明不局限于此。

实施例1

称取瘤果黑种草子药材10.0 kg，粉碎，石油醚脱脂后，置于提取罐中，加入8 倍量的体积百分比为70%的乙醇水溶液，回流提取3次，每次1小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，AB-8型大孔树脂吸附，先以10倍树脂柱体积的去离子水洗脱，再以6倍树脂柱体积的体积百分比为50%乙醇水溶液洗脱，收集体积百分比为50%乙醇水洗脱液，减压浓缩，喷雾干燥，即得淡棕黄色粉末，总皂苷含量的重量百分比为63.2%，总黄酮含量的重量百分比为5.6%。

实施例2

称取瘤果黑种草子药材1.0 kg，粉碎，石油醚脱脂后，置于提取罐中，加入8倍量的体积百分比为50%的乙醇水溶液，回流提取3次，每次1小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，D101型大孔树脂吸附，先以10倍树脂柱体积的去离子水及体积百分比为10%的乙醇水溶液洗脱，再以8倍树脂柱体积的体积百分比为70%的乙醇水溶液洗脱，收集体积百分比为70%的乙醇水洗脱液，减压浓缩，真空干燥，即得淡棕黄色粉末，总皂苷含量的重量百分比为51.6%，总黄酮含量的重量百分比为4.7%。

实施例3

称取瘤果黑种草子药材1.0 kg，粉碎，石油醚脱脂后，置于提取罐中，加入8倍量的去离子水，回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，HPD-600型大孔树脂吸附，先以20倍树脂柱体积的去离子水及体积百分比为10%的乙醇水溶液洗脱，再以5倍树脂柱体积的体积百分比为30%的乙醇水溶液洗脱，收集体积百分比为30%的乙醇水洗脱液，减压浓缩，真空干燥，即得淡棕黄色粉末，总皂苷含量的重量百分比为69.1%，总黄酮含量的重量百分比为9.2%。

实施例4

称取瘤果黑种草子药材1.0 kg，粉碎，石油醚脱脂后，置于提取罐中，加入8倍量的体积百分比为10%的乙醇水溶液，回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，D101型大孔树脂吸附，先以10倍树脂柱体积的去离子水及体积百分比为10%的乙醇水溶液洗脱，再以7倍树脂柱体积的体积百分比为50%的乙醇水溶液洗脱，收集体积百分比为50%的乙醇水洗脱液，减压浓缩，真空干燥，即得淡棕黄色粉末，总皂苷含量的重量百分比为52.8%，总黄酮含量的重量百分比为5.9%。

实施例5

称取家黑种草子药材0.5 kg，粉碎，石油醚脱脂后，置于提取罐中，加入8倍量的体积百分比为30%的乙醇水溶液，回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，AB-8型大孔树脂吸附，先以15倍树脂柱体积的去离子水及体积百分比为10%的乙醇水溶液洗脱，再以6倍树脂柱体积的体积百分比为50%的乙醇水溶液洗脱，收集体积百分比为50%的乙醇水洗脱液，减压浓缩，真空干燥，即得淡棕黄色粉末，总皂苷含量的重量百分比为66.7%，总黄酮含量的重量百分比为6.6%。

实施例6

称取黑种草子药材0.5 kg，粉碎，石油醚脱脂后，置于提取罐中，加入8倍量的体积百分比为50%的甲醇水溶液，回流提取3次，每次1小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，AB-8型大孔树脂吸附，先以10倍树脂柱体积的去离子水及体积百分比为10%的乙醇水溶液洗脱，再以6倍树脂柱体积的体积百分比为60%的乙醇水溶液洗脱，收集体积百分比为60%的乙醇水洗脱液，减压浓缩，真空干燥，即得淡棕黄色粉末，总皂苷含量的重量百分比为63.5%，总黄酮含量的重量百分比为4.2%。

实施例7

该黑种草子总苷提取物是从黑种草种子中提取得到组合物，该组合物按重量百分比含有50 %至 80%的皂苷、3%至 11%的黄酮，该组合物为淡棕黄色粉末、易溶于水；其中，黑种草种子的来源植物为黑种草Nigella damascena L.或家黑种草即果黑种草Nigella sativa L.或瘤果黑种草即腺毛黑种草Nigella glandulifera Freyn的种子；该黑种草子总苷提取物通过如下步骤得到：包括黑种草子的脱脂、提取、浓缩、大孔树脂吸附、洗脱、浓缩干燥步骤得到黑种草子总苷提取物；具体为：黑种草子粉碎后，在封闭式连续提取装置中以水或体积百分比为10%的乙醇水溶液或体积百分比为30%的乙醇水溶液或体积百分比为50%的乙醇水溶液或体积百分比为70%的乙醇水溶液或体积百分比为50%的甲醇水溶液连续回流提取3小时至6小时，浓缩提取液至无醇味，大孔树脂吸附，以10倍至20倍树脂柱体积的去离子水及体积百分比为10%的乙醇水溶液洗去糖类和鞣质部分，再以5倍至8倍树脂柱体积的体积百分比为30%至70%的乙醇水溶液洗脱，收集体积百分比为30%至70%的乙醇水洗脱液，减压浓缩后，真空或喷雾干燥，得到淡棕黄色粉末，即黑种草子总苷提取物。

以上实例仅为了对本发明作进一步的说明，而本发明的范围不受所举实施例的局限。

本发明提供的是一种新型的天然植物提取物——黑种草总苷即黑种草子总苷提取物，可用于关节炎及过敏性疾病的治疗中，为证明其效果，将上述实施例1至实例6所得黑种草子总苷提取物进行了体内外药效学试验，其结果如下：

1 本发明黑种草子总苷提取物对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

18-22 g昆明种小鼠60只，雌雄各半，随机分为5组，每组12只，即空白组、醋酸泼尼松组、样品高、中、低三个剂量组（100、50、25 mg/kg），连续7天给药，于末次给药后30 min，各小鼠右耳涂二甲苯0.05 ml，1.5 h后将小鼠颈椎脱臼处死，剪下左右耳廓，用打孔器打下直径7 mm的耳片，称重，计算肿胀率；将取耳后的小鼠迅速剖腹，取出胸腺、脾脏，用电子天平称其鲜重并计算胸腺指数和脾脏指数。

结果表明，与空白组相比较，本发明黑种草子总苷提取物高剂量组100 mg/kg、醋酸泼尼松50 mg/kg对二甲苯致小鼠耳肿胀有明显的抑制作用，本发明黑种草子总苷提取物高剂量组肿胀抑制率为45.90%，醋酸泼尼松组肿胀抑制率为35.38%；同样本发明黑种草子总苷提取物中剂量组50 mg/kg、低剂量组25 mg/kg对二甲苯所致小鼠耳肿胀也有一定的抑制作用，肿胀抑制率分别为35.72%和30.19%；本发明黑种草子总苷提取物高剂量组、醋酸泼尼松组均能显著降低小鼠的胸腺指数和脾脏指数，低剂量组也能降低小鼠的脾脏指数。说明本发明黑种草子总苷提取物有一定的抗炎作用。

2 本发明黑种草子总苷提取物对冰醋酸致小鼠扭体反应的影响

18-22 g昆明种小鼠60只，雌雄各半，随机分为5组，每组12只，即空白对照组、阳性对照组吲哚美辛、样品高、中、低三个剂量组（100、50、25 mg/kg），各组均按设定剂量灌胃给药，空白对照组灌胃等量的蒸馏水，1次/天，连续5天，于末次给药后1.5 h，每鼠ip 0.6%冰醋酸0.2 ml。立即观察记录小鼠15 min内扭体次数，计算抑制率。

结果表明，与空白对照组相比较，本发明黑种草子总苷提取物高剂量组100 mg/kg、吲哚美辛组0.125g/kg对冰醋酸致小鼠扭体反应有明显的抑制作用，抑制率分别为52.56%和40.22%；同样本发明黑种草子总苷提取物中剂量组50 mg/kg、低剂量组25 mg/kg对冰醋酸致小鼠扭体反应也有一定的抑制作用，抑制率分别为37.48%和32.29%。说明本发明黑种草子总苷提取物有较好的镇痛作用。

3 本发明黑种草子总苷提取物对DNCB（2,4-二硝基氯苯）所致小鼠DTH（迟发性过敏反应）的影响

18-22g昆明种小鼠60只，雌雄各半，随机分为5组，每组12只，即空白对照组、阳性对照组醋酸泼尼松、样品高、中、低三个剂量组（200、100、50 mg/kg），每鼠腹部去毛，将1%DNCB 0.05 ml均匀涂抹致敏。第二天强化一次，致敏前一天开始灌胃，连续给药8天。致敏6天后，将1%DNCB丙酮液0.01ml均匀涂抹于小鼠右耳进行攻击，攻击后24小时即末次给药后1小时，处死小鼠，剪下左右耳廓，用直径7 mm的打孔器取下左右耳片，称重，以左右耳片重量之差为肿胀度，并计算抑制率；取出胸腺、脾脏，称重，计算胸腺指数和脾脏指数。

结果表明，醋酸泼尼松和本发明黑种草子总苷提取物高剂量组200 mg/kg对DNCB所致小鼠DTH反应有较为明显的抑制作用，抑制率分别为51.5%和41.2%；本发明黑种草子总苷提取物中、低剂量组对DNCB所致小鼠DTH反应也有一定的抑制作用，抑制率分别为26.8%和17.1%，且本发明黑种草子总苷提取物高、中、低(200 、100、50mg/kg)三个剂量组均能降低小鼠的胸腺指数和脾脏指数。

4 本发明黑种草子总苷提取物对右旋糖酐所致小鼠皮肤瘙痒的影响

18-22g昆明种小鼠60只，雌雄各半，随机分成5组，每组12只，即空白对照组、阳性对照组扑尔敏、样品高、中、低三个剂量组（200、100、50 mg/kg），连续7天给药，于末次给药后30 min，各小鼠尾静脉注射0.04%右旋糖酐 0.1 ml/10g，以小鼠前爪搔痒头部，后爪搔痒躯干，嘴咬全身各部位作为搔痒指征，记录30 min内小鼠搔痒次数及搔痒持续时间。

结果表明，与空白组相比较，本发明黑种草子总苷提取物高剂量组200 mg/kg能显著减少搔痒次数，其结果接近于阳性对照组扑尔敏。其它两个剂量组(100、50mg/kg)也能减少搔痒次数；说明本发明黑种草子总苷提取物有一定的抗过敏作用。

综上所述，通过大孔树脂技术，使黑种草子的主要特征性成分得到有效富集，其皂苷含量的重量百分比为50 %至 80%，其黄酮含量的重量百分比为3%至 11%；药效学试验结果显示本发明黑种草子总苷提取物具有显著的抗炎镇痛及抗过敏作用，进一步说明了黑种草子的新用途，发明黑种草子总苷提取物还可用于关节炎等炎性疾病以及过敏性疾病的预防和治疗。

Claims

1.一种黑种草子总苷提取物，其特征在于从黑种草种子中提取得到组合物，该组合物按重量百分比含有50 %至 80%的皂苷、3%至 11%的黄酮，该组合物为淡棕黄色粉末、易溶于水；该黑种草子总苷提取物采用如下步骤得到：包括黑种草子的脱脂、提取、浓缩、大孔树脂吸附、洗脱、浓缩干燥步骤得到黑种草子总苷提取物，其中：该黑种草子总苷提取物采用如下的具体步骤得到：黑种草子粉碎后，在封闭式连续提取装置中以水或体积百分比为10%的乙醇水溶液或体积百分比为30%的乙醇水溶液或体积百分比为50%的乙醇水溶液或体积百分比为70%的乙醇水溶液或体积百分比为50%的甲醇水溶液连续回流提取3小时至6小时，浓缩提取液至无醇味，大孔树脂吸附，以10倍至20倍树脂柱体积的去离子水及体积百分比为10%的乙醇水溶液洗去糖类和鞣质部分，再以5倍至8倍树脂柱体积的体积百分比为30%至70%的乙醇水溶液洗脱，体积百分比为30%至70%的乙醇水洗脱液减压浓缩后，真空或喷雾干燥，得到淡棕黄色粉末，即黑种草子总苷提取物；所使用的大孔树脂是AB-8的弱极性大孔吸附树脂或D101的弱极性大孔吸附树脂或HPD-600的弱极性大孔吸附树脂。

2.根据权利要求1所述的黑种草子总苷提取物，其特征在于黑种草种子的来源植物为黑种草Nigella damascena L.或家黑种草即果黑种草Nigella sativa L.或瘤果黑种草即腺毛黑种草Nigella glandulifera Freyn的种子。

3.一种根据权利要求1或2所述的黑种草子总苷提取物的制备方法，其特征在于采用如下步骤进行：包括黑种草子的脱脂、提取、浓缩、大孔树脂吸附、洗脱、浓缩干燥步骤得到黑种草子总苷提取物；其中具体步骤按下述进行：黑种草子粉碎后，在封闭式连续提取装置中以水或体积百分比为10%的乙醇水溶液或体积百分比为30%的乙醇水溶液或体积百分比为50%的乙醇水溶液或体积百分比为70%的乙醇水溶液或体积百分比为50%的甲醇水溶液连续回流提取3小时至6小时，浓缩提取液至无醇味，大孔树脂吸附，以10倍至20倍树脂柱体积的去离子水及体积百分比为10%的乙醇水溶液洗去糖类和鞣质部分，再以5倍至8倍树脂柱体积的体积百分比为30%至70%的乙醇水溶液洗脱，体积百分比为30%至70%的乙醇水洗脱液减压浓缩后，真空或喷雾干燥，得到淡棕黄色粉末，即黑种草子总苷提取物；所使用的大孔树脂是AB-8的弱极性大孔吸附树脂或D101的弱极性大孔吸附树脂或HPD-600的弱极性大孔吸附树脂。

4.一种根据权利要求1或2所述的黑种草子总苷提取物在制备治疗关节炎疾病的药物的应用。

5.一种根据权利要求1或2所述的黑种草子总苷提取物在制备治疗过敏性疾病的药物的应用。