CN105012329B

CN105012329B - 一种用于治疗二型糖尿病的药物

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Publication number: CN105012329B
Application number: CN201510446890.3A
Authority: CN
Inventors: 黄先菊; 李竣; 梅枝意
Original assignee: South Central University for Nationalities
Current assignee: South Central Minzu University
Priority date: 2015-07-27
Filing date: 2015-07-27
Publication date: 2018-12-21
Anticipated expiration: 2035-07-27
Also published as: CN105012329A

Abstract

本发明公开了一种用于治疗二型糖尿病的药物，其药效成分包括龙胆苦苷和/或獐芽菜苷，也可以是包括了上述两种成分的金不换总提取物。实验发现金不换总提取物，两种单体龙胆苦苷、獐芽菜苷及其混合物具有较好的抗二型糖尿病作用，可抑制二型糖尿病靶点PEPCK及Akt、Erk等的磷酸化。二者混合作用优于其他单体及两种单体单独作用。为治疗糖尿病开辟了一条新的研究渠道，同时也进一步开发了金不换的药用价值。

Description

一种用于治疗二型糖尿病的药物

技术领域

本发明涉及一种用于治疗二型糖尿病的药物。

背景技术

糖尿病发病在我国呈现持续的上升趋势，随着科技的进步，各类降糖西药相继用于临床，然而，多种副作用的出现及应用的局限性使得这些西药的临床疗效难以令人满意。如胰岛素虽然挽救了无数糖尿病患者的生命，但需一日内多次皮下注射，许多病人难以坚持。新近问世的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂(如艾塞那肽、利拉鲁肽)和二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂(如西格列汀)因有潜在的致癌或致急性胰腺炎风险，使得其推广备受争议。所以人们迫切需要寻求更多、更好的降糖新药。

糖尿病中医称为消渴病，最早见于《黄帝内经》。中医药治疗糖尿病及相关并发症有悠久的历史，具有效果较好且毒副作用小等特点。因此，从中药中寻找一种具有自主知识产权的、疗效较好的抗糖尿病药物，具有重要的临床意义。

糖尿病控制和并发症试验结果表明有效地控制血糖可以延缓糖尿病并发症如心血管疾病的发病与进程。肝脏在调控机体脂质和葡萄糖平衡中发挥着重要作用。在多种激素和营养素刺激下，肝脏通过调节肝糖和脂质体代谢相关基因的水平利用并产生葡萄糖。胰岛素通过诱导肝细胞糖酵解和脂肪形成，抑制葡萄糖异生而维持肝糖和脂质平衡，在其中起着关键作用。

肝糖异生中第一个限速酶由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)介导，催化以下反应：草酰乙酸盐+GTP＝磷酸烯醇式丙酮酸+GDP+CO₂。在肝、肾、脂肪组织及其他组织均有PEPCK的表达和活化。PEPCK有两种亚型，一种是细胞质型(PEPCK-C)，其表达与饮食及激素调节有关，另一种是持续表达的线粒体型(PEPCK-M)，因为缺乏异构调节，PEPCK-C活性最初受其肝内的基因(Pck1)表达控制。胰岛素主要控制肝内其他激素及营养物质诱导的Pck1表达。因此Pck1被广泛用于胰岛素调控的肝内表达基因模型。

胰岛素与细胞膜受体结合后，启动胰岛素受体底物磷酸化的信号级联反应。底物磷酸化激活磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3K)，促使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸转化为磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸盐。最终导致多种蛋白激酶活化。如3-磷酸肌醇依赖的蛋白激酶-1(PDK1)、AKT(也被称为蛋白激酶B)和细胞膜附近的非典型蛋白激酶C(aPKC)。胰岛素诱导的AKT磷酸化是这一反应的标志。胰岛素最大程度激活后，AKT被Thr308上PDK1及Ser473上的mTORC2磷酸化，AKT活化和aPKC活化可调节肝中糖脂代谢基因转录。在肝细胞中，AKT活化足以抑制Pck1表达，减少糖原异生。针对上述作用靶点的药物将有望成为有效的降糖药。

金不换(Veratrillabaillonii Franch)为龙胆科、黄秦艽属，多年生草本，又名黄秦艽(《云南省药品标准》)、滇黄芩(《云南中草药》)、丽江金不换、大苦参、黄龙胆(《全国中草药汇编》)等，始载于《中华本草》；本品以根入药，味苦，性寒，有毒，具有清热，消炎，解毒，杀虫，活络止痛之功效，可用于肺热咳嗽、扁桃体炎、胃炎、痢疾、慢性胆囊炎、肾炎、乳腺炎、蛔虫病、烧伤、跌打损伤、痈疮肿毒等病症。金不换一般生于海拔3000～4600m处的高山草地、灌丛中，或阴湿草地上，主要分布于西藏东南部、云南西北部与四川西部，印度阿萨姆及印度东北部也有部分分布。主产地为云南剑川、洱源、鹤庆和云龙等。在云南民间如大理、丽江、怒江等地均使用，也是一种极具开发利用前景的民族民间药。

经系统化学成分预试验证明金不换除含有生物碱外，还有含有如皂甙、内酯、油脂、强心苷等数种成分，具有多种疗效，在我国民族医药中应用广泛。如，在苗药中，有将金不换用作清热、消炎、保肝、利胆、解毒的良药，以及用来治疗胃痛、腹痛、菌痢、黄疸性肝炎等疾病；在藏药中，用金不换以清热、消炎、解毒、杀虫；在纳西药中用以清热解毒、消炎，以及治疗痢疾、肺热所致咳嗽、慢性支气管炎与拮抗乌头碱中毒等；在苗药中，用以止痛，清热解毒；在白药中，用以治疗急、慢性胃炎、肠炎等炎症，以及治疗胃脘胁痛、肺热所致咳嗽、烧伤等；在彝药中，用以治疗人畜中毒；在傈僳族用药中，用以治疗肺热所致咳嗽、阿米巴痢疾、黄疸型肝炎、蛔虫、痈疮肿毒等。金不换的众多相关药理作用仍具有相当大的研究价值。

发明内容

以糖尿病相关的关键基因为靶点，筛选民族药金不换总提取物及各个提取成分的抗糖尿病作用，并以阳性对照药胰岛素为对照，得到有确切作用的化学成分，是本专利申请的主要目的。

本发明的目的是提供一种用于治疗二型糖尿病的药物。

本发明提供的用于治疗二型糖尿病的药物，药效成分包括龙胆苦苷和/或獐芽菜苷。

优选地，药效成分包括龙胆苦苷与獐牙菜苷两种，其中，龙胆苦苷与獐芽菜苷的质量比例为10:1时具有较好的协同作用，其作用优于龙胆苦苷或獐牙菜苷单独使用的疗效。与金不换总提物相比，其对糖尿病靶点Pck1的作用更强。

优选地，所述龙胆苦苷和獐牙菜苷从金不换中提取，提取方法如下：

(1)金不换以甲醇提取，过滤，合并提取液，减压浓缩，得浸膏，即为总提物(VBFE)；

(2)将浸膏用水混悬，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取后分别蒸干得相应溶剂层萃取物浸膏；

(3)正相硅胶柱色谱纯化：取乙酸乙酯层萃取物过正相硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇梯度混合液洗脱，最后用甲醇洗脱，合并洗脱液，用TLC检测，取TLC检测样品斑点最多的组分进行下一轮纯化；重复该正相硅胶柱色谱纯化过程多次，取TLC检测样品斑点最清晰的组分，通过制备型高效液相色谱制备得龙胆苦苷和獐牙菜苷药效成分。

其中步骤(2)具体操作为：浸膏用水混悬，先用石油醚萃取，收集石油醚萃取液后剩余的产品再用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷萃取液后剩余的产品再用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液后的产品再用正丁醇萃取，收集正丁醇萃取液。所得的四种萃取液分别蒸干，得到石油醚萃取物浸膏、二氯甲烷萃取物浸膏、乙酸乙酯萃取物浸膏、正丁醇萃取物浸膏。

优选地，上述步骤(3)中所述乙酸乙酯层萃取物经过4次正相硅胶柱层析，而且从前至后的硅胶柱层析所用的硅胶目数依次大于前一次，二氯甲烷-甲醇梯度混合液中二氯甲烷与甲醇的体积比例范围为50:1～6:4，通过TLC检测合并洗脱液相同组分，通过TLC选择成分最简单的样品做半制备型高效液相色谱，用乙腈体积浓度35％的乙腈-水作为HPLC的色谱条件制备单体，得到龙胆苦苷和獐牙菜苷药效成分。

优选地，以上任一所述的用于治疗二型糖尿病的药物，药物通过抑制靶点PEPCK、Akt和/或Erk的磷酸化发挥作用。

本发明还提供一种治疗二型糖尿病的药物，药效成分包括按照以下提取步骤提取的金不换总提取物：金不换以甲醇提取，过滤，合并提取液，减压浓缩，得浸膏，即为金不换总提取物。实验发现金不换总提物也可以有效抑制P-Akt s473，P-Akt s308和P-Erk1/2蛋白表达，阻断二型糖尿病致病通路，具有抗糖尿病作用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首先从植物金不换中提取得到了5种环烯醚萜苷类单体，并发现金不换总提取物，两种单体龙胆苦苷、獐芽菜苷及其混合物具有较好的抗二型糖尿病作用，可抑制二型糖尿病靶点PEPCK及Akt、Erk的磷酸化。二者混合作用优于其他单体及两种单体单独作用。为治疗糖尿病开辟了一条新的研究渠道，同时也进一步开发了金不换的药用价值。

附图说明

图1是金不换中几种主要化学成分结构式。

图2是金不换总提取物HPLC指纹图谱(1)和9种化合物成分(2-10)谱图。

图3是龙胆苦苷与獐芽菜苷的混合物(质量比10:1)的液相图谱。

图4龙胆苦苷的液相图谱。

图5獐芽菜苷的液相图谱。

图6金不换总提物对HL1C细胞Pck1mRNA水平的影响。

图7金不换提物对HL1C细胞Pck1mRNA水平的影响。

图8龙胆苦苷与獐牙菜苷不同比例配伍对HL1C细胞Pck1mRNA水平的影响。

图9金不换总提物对HL1C细胞AKT、P-AKT、Erk1/2、P-Erk1/2蛋白表达的时间依赖关系。

图10金不换总提物与HL1C细胞孵育15min对AKT、P-AKT、Erk1/2、P-Erk1/2蛋白表达的影响。

图11金不换提取物对HL1C细胞AKT、P-AKT、ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表达的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1金不换提取物的制备过程及提取物成分检测，药效实验

1.提取流程：

金不换4.8kg以体积浓度95％的甲醇水溶液提取回流3次，每次4h，过滤，合并提取液，减压浓缩，得深棕色总提物浸膏1227.68g。

将浸膏以水混悬，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，四种萃取物分别蒸干得浸膏，其中获得石油醚萃取物74.21g、二氯甲烷层萃取物298.81g、乙酸乙酯层萃取物236.15g、正丁醇层萃取物401.79g、水层提取物193.29g。

取乙酸乙酯层萃取物50g过正相硅胶柱，分别以二氯甲烷-甲醇(其中二氯甲烷与甲醇的体积比依次为30:1、9:1、7:3、6:4)梯度洗脱及甲醇洗脱，TLC检测合并得四个混合组分，从前至后依次标记为A1～A4，其中组分A2(5.2g)斑点最多，A2再经正相硅胶柱色谱，依次用二氯甲烷-甲醇(其中二氯甲烷与甲醇的体积比依次为20:1、10:1、8:2、6:4)梯度洗脱，TLC检测合并得四个组分，从前至后依次标记为B1～B4，其中组分B2(4.55g)斑点最多，B2再经正相硅胶柱色谱，依次用二氯甲烷-甲醇(二氯甲烷与甲醇的体积比依次为50:1、40:1、8:2、6:4)梯度洗脱，TLC检测合并得四个组分，从前至后依次标记为C1～C4，其中组分C2(3.84g)斑点最多，C2再经正相硅胶柱色谱，依次用二氯甲烷-甲醇(二氯甲烷与甲醇的体积比依次为10:1、9:1、8:2、6:4)梯度洗脱，TLC检测合并相同组分，共得到7个流分，从前至后依次标记为D1～D7。其中D3(380mg)斑点最清晰，D3用乙腈体积浓度为35％的乙腈(TediaCompany，USA)-水经HPLC(Dionex Ultimate 3000 chromatograph)制备得化合物D301-2、D301-3、D301-4、D301-5、D301-6，这五种化合物从前至后依次鉴定为龙胆苦苷(gentiopicroside，21.6mg)，獐芽菜苷(sweroside，17.8mg)，金不换苷II(veratrilosideII、19.5mg)，金不换苷III(veratriloside III、6.0mg)，金不换苷I(veratrilosideI、10.2mg)。D301-1为混合物，经HPLC(Dionex Ultimate 3000 chromatograph)分析为龙胆苦苷和獐芽菜苷(质量比为10:1)。

D301-1即为龙胆苦苷和獐芽菜苷(质量比为10:1)的天然混合物，参见图2。龙胆苦苷和獐芽菜苷的液相图谱见图4和图5。

金不换中经鉴定的几种单体化合物结构如图1。金不换总提物HPLC指纹图谱(1)和9种化合物成分(2-10)谱图见图2，比较9种化合物的保留时间和紫外吸收光谱，鉴定其成分为：5号峰：番木鳖酸(6.040min)；6号峰：6’-O-β-D-葡萄糖龙胆苦苷(9.880min)；7号峰：獐牙菜苦苷(10.667min)；8号峰：龙胆苦苷(14.967min)；9号峰：獐芽菜苷(16.360min)；14号峰：金不换苷I(38.027min)；15号峰：金不换苷II(40.113min)；17号峰：金不换苷III(46.313min)；20号峰：金不换苷(55.433min)。

实施例2金不换总提物体外抗糖尿病的实验

(1)HL1C大鼠肝癌细胞(以下简称HL1C细胞)是大鼠肝瘤H4IIE细胞系的一种，含有稳定转染的Pck1启动子基因，可促进氯霉素乙酰转移酶的表达，适合用于抗糖尿病药物作用靶点Pck1基因的相关研究。体外培养HL1C细胞于含10％胎牛血清的高糖DMEM中(4.5g/L葡萄糖)。将其置于37℃、含5％CO₂、饱和湿度的培养箱孵育，24h换液，培养3～5天以备实验使用。

(2)HL1C细胞与不同浓度的总提物共孵育后，用Trizol提取总RNA，然后用逆转录试剂盒提取cDNA，SYBR Green荧光探针法检测Pck1mRNA水平，检测条件为50℃2min，95℃10min，然后95℃15s和60℃1min下40个循环。

(3)HL1C细胞与不同浓度的总提物共孵育后，胰酶消化，提取总蛋白。Westernblot检测Akt、Erk1/2、P-Akt和P-Erk1/2蛋白表达。利用BSA试剂盒测定标本中蛋白浓度。按25μL体系加样，电泳，转膜后用5％脱脂奶粉封闭1h。TBST洗膜后用相应靶点的抗体(1:1000)孵育，冰盒中震荡过夜，次日洗膜，再用羊抗兔IgG抗体孵育2h，显影成像拍照。以β-action为内参，对照组。

实验结果见图6和图7，图6是金不换总提物对HL1C细胞Pck1mRNA水平的影响。HL1C细胞用无血清DMEM培养后加总提物(0.1～100μg/ml)孵育6h。然后提取总RNA，实时荧光定量PCR检测Pck1.数据用ΔΔCt方法分析，结果以相对倍数形式表达，对照组Pck1转录水平设为1。数据用平均值±标准差表示，n＝6，(与对照组相比*P<0.01)。

图7是金不换总提物对HL1C细胞Pck1mRNA水平的影响。HL1C细胞用无血清DMEM培养后加药孵育6h。金不换甲醇提物(VBFE)100μg/mL或各个提取部位(龙胆苦苷；獐芽菜苷；金不换苷I；金不换苷II；金不换苷III；金不换苷)30μg/mL分别与细胞共孵育6h。然后提取总RNA，实时荧光定量PCR检测Pck1.数据用ΔΔCt方法分析，结果以相对倍数形式表达，对照组Pck1转录水平设为1。数据用平均值±标准差表示，n＝6，(与对照组相比，*P<0.05,**P<0.01)。图中，D2：龙胆苦苷；D3：獐芽菜苷；VI：金不换苷I；VII：金不换苷II；V III：金不换苷III；VIV：金不换苷IV。D2+D3为龙胆苦苷和獐芽菜苷(10:1)混合物。

图9显示了金不换总提物对HL1C细胞AKT、P-AKT、Erk1/2和P-Erk1/2蛋白表达的时间依赖关系。HL1C细胞用无血清DMEM培养后加金不换总提物30μg/mL孵育5～60min。然后提取总蛋白，于SDS/PAGE电泳分离(40μg/lane)，相应一抗检测显影。以胰岛素(Ins)100nM作为阳性对照。图中数据用三批样品的平均值±标准差表示，n＝3，(与对照组相比，*P<0.05,**P<0.01)。

图10显示了金不换总提物与HL1C细胞孵育15min后对AKT、P-AKT、Erk1/2和P-Erk1/2蛋白表达的影响。HL1C细胞用无血清DMEM培养后加金不换总提物30μg/mL孵育15min。然后提取总蛋白，于SDS/PAGE电泳分离(40μg/lane)，相应一抗检测显影。图中数据用三批样品的平均值±标准差表示，n＝3，(与对照组相比，*P<0.05,**P<0.01)。

结果显示，金不换总提物(0.3～100μg/mL)孵育6h均能抑制肝癌细胞Pck1mRNA水平，30μg/mL总提物与肝癌细胞共孵育10～60min可以显著诱导P-Akt s473，P-Akt s308和P-Erk1/2蛋白表达，阻断二型糖尿病致病通路，表明具有抗二型糖尿病作用。

实施例3龙胆苦苷和/或獐牙菜苷体外抗二型糖尿病的实验

(1)体外培养HL1C大鼠肝癌细胞于含10％胎牛血清的DMEM中。将其置于37℃，含5％CO₂，饱和湿度的培养箱孵育，24h换液，培养3～5天以备实验使用。

(2)HL1C细胞与30μg/mL龙胆苦苷共孵育6h后，Trizol提取总RNA，然后用逆转录试剂盒提取cDNA，SYBR Green荧光探针法检测Pck1mRNA水平，检测条件为50℃2min，95℃10min，然后95℃15s和60℃1min下40个循环。

(3)HL1C细胞分别与龙胆苦苷、獐芽菜苷，以及不同浓度的龙胆苦苷和獐芽菜苷(二者质量比分别为2:1、5:1、10:1、1:10、1:5和1:2)混合物，共孵育15min后，胰酶消化，提取总蛋白。Western blot检测P-Akt和P-Erk1/2蛋白表达。利用BSA试剂盒测定标本中蛋白浓度。按25μL体系加样，电泳，转膜后用5％脱脂奶粉封闭1h。TBST洗膜后用相应抗体(1:1000)孵育，冰盒中震荡过夜，次日洗膜，羊抗兔IgG抗体孵育2h，显影成像拍照。以β-action为内参，对照组。

图11显示了金不换提取物对HL1C细胞AKT、P-AKT、ERK1/2和P-ERK1/2蛋白表达的影响。HL1C细胞用无血清DMEM培养后加金不换提物30μg/mL孵育15min。然后提取总蛋白，于SDS/PAGE电泳分离(40μg/lane)，相应靶点抗体检测显影。胰岛素(Ins)100nM为阳性对照。图中数据用三批样品的平均值±标准差表示，n＝3，(与对照组相比，*P<0.05,**P<0.01)。D2：龙胆苦苷；D3：獐芽菜苷；VI：金不换苷I；V II：金不换苷II；VIII：金不换苷III；VIV：金不换苷IV。D2+D3为龙胆苦苷和獐芽菜苷(质量比10:1)混合物。

结果见图8，显示了龙胆苦苷与獐牙菜苷不同比例配伍对HL1C细胞Pck1mRNA水平的影响。HL1C细胞用无血清DMEM培养后加药孵育6h。金不换总提物100μg/mL或各个混合物30μg/mL分别与细胞共孵育6h。龙胆苦苷和獐芽菜苷混合物比例如图所示。然后提取总RNA，实时荧光定量PCR检测Pck1。数据用ΔΔCt方法分析，结果以相对倍数形式表达，对照组Pck1转录水平设为1。数据用平均值±标准差表示，n＝6，(与对照组相比，*P<0.05,**P<0.01)。

獐芽菜苷30μg/mL孵育6h可以抑制HL1C细胞Pck1mRNA水平，30μg/mL獐芽菜苷与HL1C细胞共孵育15min可以显著诱导P-Akt和P-Erk1/2蛋白表达，阻断二型糖尿病致病通路，表明具有抗二型糖尿病作用。

龙胆苦苷30μg/mL孵育6h可以抑制肝癌细胞Pck1mRNA水平，30μg/mL龙胆苦苷与HL1C细胞共孵育15min可以显著诱导P-Akt和P-Erk1/2蛋白表达，阻断二型糖尿病致病通路，表明其具有抗二型糖尿病作用。

在龙胆苦苷和獐芽菜苷六个比例(2:1,5:1,10:1,1:10,1:5,1:2)的混合物中，龙胆苦苷、獐芽菜苷混合物(10:1)作用最优，30μg/mL能抑制Pck1mRNA水平，诱导磷酸化Akt及Erk的蛋白表达，且其作用优于金不换总提物及两个单体的单独作用。

为了检验其他来源的龙胆苦苷和獐牙菜苷是否也同样具备抗二型糖尿病作用个，我们购买了市售的龙胆苦苷和獐牙菜苷(均购自南京泽朗生物科技有限公司)进行试验，发现其结果与上述十分接近，与由金不换提取得到的该两种物质无明显差异，这表明该两种物质确实能够阻断二型糖尿病致病通路，具有抗二型糖尿病作用。

实施例4抗糖尿病研究

体外培养大鼠HL1C大鼠肝癌细胞，q-PCR技术筛选金不换总提物及单体给药6h后细胞Pck1mRNA水平的影响。结果如图7所示，龙胆苦苷与獐芽菜苷混合物(10:1)作用最优，优于甲醇总提物(VBFE)及龙胆苦苷或獐芽菜苷单独使用。Western blot检测细胞磷酸化Akt及Erk的蛋白表达作用，结果表明，混合物、龙胆苦苷及獐芽菜苷均能诱导磷酸化Akt及Erk的蛋白表达，其中龙胆苦苷与獐芽菜苷混合物(10:1)作用最强。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims

1.龙胆苦苷和獐芽菜苷在制备治疗二型糖尿病的药物中的应用，其特征在于，所述药物中药效成分为龙胆苦苷与獐芽菜苷。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中龙胆苦苷与獐芽菜苷的质量比例为10:1。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述治疗二型糖尿病的药物通过抑制靶点PEPCK、Akt和/或Erk的磷酸化发挥作用。