CN112451558A - 牛大力醇提物在制备降糖或降脂药物、保健品中的应用 - Google Patents
牛大力醇提物在制备降糖或降脂药物、保健品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及牛大力醇提物在制备降糖或降脂药物、保健品中的应用。本发明研究结果显示，牛大力醇提物含有黄酮类化合物、生物碱类化合物等多种活性成分，可以显著降低糖尿病模型小鼠的血糖值、口服耐糖量、胰岛素抵抗指数，改善糖尿病模型小鼠的脂代谢紊乱，调节糖尿病模型小鼠HPA轴相关激素紊乱，改善糖尿病对肝脏、胰腺、肾脏造成的病理损伤；其效果与阳性对照组二甲双胍相当，疗效确切，并且牛大力醇提物成分明确，安全性高，药物开发基础好。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及牛大力醇提物在制备降糖或降脂药物、保健品中的应用。
背景技术
2型糖尿病(T2DM)是以高血糖症为主要特征的内分泌代谢性疾病，体内胰岛素分泌相对缺乏，引起机体糖脂代谢紊乱，使动物或人体内的肝脏、脂肪、骨骼肌等组织中产生胰岛素抵抗。其主要表现为肝脏及其外周组织(肌肉、脂肪组织)对葡萄糖的摄取产生障碍，以及肝脏葡萄糖输出增多，使血液中的葡萄糖无法正常进入细胞，导致人体血糖升高。随着社会经济的发展和居民生活水平的提高，糖尿病的发病率及患病率呈现逐年升高的趋势，2型糖尿病的发生，在国外占整个糖尿病比例的85～95％以上，而国内则更高，报道在98％以上。
目前常用于治疗糖尿病的药物有二甲双胍、罗格列酮、吡格列酮、氨氯地平等，但上述药物均为化药，存在不同程度的副作用，而患者需要长期服用，容易造成肝、肾等的损伤。为了避免治疗中化学药物的副作用，研究人员开始关注安全性较高的中药，试图寻找一种价格低廉、副作用小的中药类药物。如中国专利申请CN102631595A公开了一种治疗2型糖尿病的药物，该药物主要由黄芪、生地、苡仁、白术、葛根、丹参、三七、肉桂等中药组分经提取制备得到，具有强胰固本，降糖调脂等功效，但是其成分混杂，较难进行相关的药代动力学的研究，降糖原理尚未明确也难有定论，并且药物质量也较难统一，不适用于大规模产业化生产及大范围使用。而随着病情的发展，糖尿病患者的微血管并发症和大血管并发症逐渐出现，给患者及其家庭带来巨大的经济负担，因此迫切需要提供一种价格低廉，药效明确，副作用小安全性高的治疗糖尿病的药物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有化药长期服用具有不同程度的副作用，中药组合物成分混杂、药效不明确的缺陷和不足，提供一种牛大力醇提物在制备降糖或降脂药物、保健品中的应用。
本发明的目的是提供一种牛大力醇提物在制备降血糖或降血脂药物、调节血糖或血脂保健品中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
中药牛大力是豆科崖豆藤属美丽崖豆藤的干燥根，主要种植在中国的华南地区和东南部地区。牛大力作为传统的药食两用中药材，在我国南方地区被广泛用于制作药膳、药酒、煲汤等。早期临床已证明其可治疗腰痛、肾虚、风湿性关节炎、腰肌劳损、慢性肝炎、病后体虚等多种慢性疾病；现代药理研究也发现牛大力具有提高免疫、祛痰、镇咳、平喘、保肝等作用。
发明人经动物实验证明，牛大力醇提物含有黄酮类化合物、生物碱类化合物等多种活性成分，可以显著降低糖尿病模型小鼠的血糖值、口服耐糖量、胰岛素抵抗指数，改善糖尿病模型小鼠的脂代谢紊乱，调节糖尿病模型小鼠HPA轴相关激素紊乱，改善糖尿病对肝脏、胰腺、肾脏造成的病理损伤。基于上述成果，本发明要求保护牛大力醇提物在制备降血糖或降血脂药物、调节血糖或血脂保健品中的应用。
进一步地，所述牛大力醇提物的制备方法包括以下步骤：
将牛大力干燥、粉碎，加入质量体积比为5～50g/ml的乙醇溶液，浸泡15～45min，50～70℃提取2～4次，每次提取1～3h，过滤，合并滤液，浓缩干燥，即得。
更进一步地，所述乙醇溶液为50～100％乙醇溶液。优选地，所述乙醇溶液为80～100％乙醇溶液；更优选地，所述乙醇溶液为95％乙醇溶液。
进一步地，所得牛大力醇提物的生药量为10～20kg/g。
更进一步地，所述牛大力醇提物含有酚酸及酸类化合物、黄酮类化合物、生物碱类化合物、糖及糖苷类化合物、萜类及甾体类化合物、氨基酸类化合物、酯类化合物、吲哚类、醌类、木脂素类化合物。
优选地，所述牛大力醇提物中黄酮类化合物占比为8～15％。
优选地，所述牛大力醇提物中生物碱类化合物占比为10～20％。
进一步地，所述牛大力醇提物可以降低胰岛素抵抗指数。
更进一步地，所述牛大力醇提物可以改善糖尿病引起的HPA轴功能紊乱。
下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)轴是神经内分泌免疫调节的重要轴，与机体的健康状况密切相关；其中，下丘脑分泌促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)促进垂体分泌促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)，进而作用于肾上腺分泌糖皮质激素(glucocorticoid,GC)，调节HPA轴的功能。研究表明，在T2DM中伴随HPA轴亢奋，即血清中促肾上腺皮质激素释放激素和促肾上腺皮质激素分泌紊乱及糖皮质激素分泌过多，这可能是T2DM发生的原因之一。所以本申请测试了HPA轴上的相关激素(小鼠促肾上腺皮质激素释放激素CRH、促肾上腺皮质激素ACTH和皮质酮CORT)，结果表明，牛大力醇提物可以显著降低糖尿病模型小鼠血清中的CRH水平，升高ACTH水平(P<0.05或P<0.01)，具有调节T2DM小鼠HPA轴相关激素紊乱的作用。
进一步地，所述牛大力醇提物可以提高IRS2、PI3K、Akt和GLUT4的表达。
机体在葡萄糖的维持下能够正常新陈代谢的主要原因是靠胰岛素促进肌肉、脂肪组织、肝脏摄取葡萄糖，对糖异生和糖原分解加以抑制，因此，肝脏、脂肪和骨骼肌在调节葡萄糖动态平衡方面起着重要作用，参与葡萄糖代谢。PI3K/Akt通路是最重要的信号通路之一，被认为是胰岛素抵抗的主要机制。胰岛素的作用主要通过胰岛素受体底物(IRS)-磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)途径介导。本发明利用RT-PCR法检测肝脏、脂肪、骨骼肌中IRS2、PI3K、Akt、GLUT4的mRNA水平，Western-Blot法检测肝脏、脂肪、骨骼肌中PI3K、Akt、GLUT4的蛋白水平，结果发现，牛大力可以增加肝脏、脂肪和骨骼肌中IRS2、PI3K、Akt和GLUT4的表达，调节机体糖代谢紊乱。
本发明具有以下有益效果：
本发明研究结果显示，牛大力醇提物含有黄酮类化合物、生物碱类化合物等多种活性成分，可以显著降低糖尿病模型小鼠的血糖值、口服耐糖量、胰岛素抵抗指数，改善糖尿病模型小鼠的脂代谢紊乱，调节糖尿病模型小鼠HPA轴相关激素紊乱，改善糖尿病对肝脏、胰腺、肾脏造成的病理损伤；其效果与阳性对照组二甲双胍相当，疗效确切，并且牛大力醇提物成分明确，安全性高，药物开发基础好。
附图说明
图1为牛大力醇提物的HPLC-Q-TOF/MS正离子模式色谱图。
图2为牛大力醇提物对T2DM小鼠体重的影响(n＝10)数据统计柱状图。
图3为牛大力醇提物对T2DM小鼠口服糖耐量的影响(n＝6)数据统计柱状图。
图4为牛大力醇提物对T2DM小鼠口服糖耐量AUC的影响(n＝6)数据统计柱状图。
图5为牛大力醇提物对糖尿病小鼠肝脏病理状态影响的HE染色(400×)图。
图6为牛大力醇提物对糖尿病小鼠肾脏病理状态影响的HE染色(400×)图。
图7为牛大力醇提物对糖尿病小鼠胰腺病理状态影响的HE染色(400×)图。
图8为牛大力醇提物对糖尿病小鼠肝脏中IRS2、PI3K、Akt、GLUT4基因表达情况(n＝6)影响数据统计柱状图。
图9为牛大力醇提物对糖尿病小鼠肝脏中PI3K、Akt、GLUT4蛋白表达情况(n＝3)影响数据统计柱状图。
图10为牛大力醇提物对糖尿病小鼠脂肪中IRS2、PI3K、Akt、GLUT4基因表达情况(n＝6)影响数据统计柱状图。
图11为牛大力醇提物对糖尿病小鼠脂肪中PI3K、Akt、GLUT4蛋白表达情况(n＝3)影响数据统计柱状图。
图12为牛大力醇提物对糖尿病小鼠骨骼肌中IRS2、PI3K、Akt、GLUT4基因表达情况(n＝6)影响数据统计柱状图。
图13为牛大力醇提物对糖尿病小鼠骨骼肌中PI3K、Akt、GLUT4蛋白表达情况(n＝3)影响数据统计柱状图。
图中，*表示与模型组相比，P<0.05，**表示与模型组相比，P<0.01；#表示与正常组相比，P<0.05，##表示与正常组相比，P<0.01。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
盐酸二甲双胍片(批号：国药准字H20023370；中美上海施贵宝制药有限公司)；链脲佐菌素(批号：S0130-1G；Singma)；TC测定试剂盒(产品号：A111-1；南京建成生物工程研究所)；TG测定试剂盒(产品号：A110-1-1；南京建成生物工程研究所)；HDL-C测定试剂盒(产品号：A112-1-1；南京建成生物工程研究所)；LDL-C测定试剂盒(产品号：A113-1-1；南京建成生物工程研究所)；葡萄糖试剂盒(产品号：20182400033；上海荣盛生物药业有限公司)；小鼠胰岛素酶联免疫检测试剂盒(产品号：MM-0579M1；酶免生物技术有限公司)；小鼠皮质醇酶联免疫检测试剂盒(产品号：MM-0565M1；酶免生物技术有限公司)；小鼠促肾上皮质激素释放激素酶联免疫试剂盒(产品号：MM-0509M1；酶免生物技术有限公司)；
Trizol(产品批号：1941204；广州瑞舒生物科技有限公司)；逆转录试剂盒(产品批号：AJ11541A；TaKaRa)；SYBR荧光染料(产品批号：BD11541A；TAKARA)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(产品批号：P0011-1；碧云天生物技术研究所)。
高脂饲料采用的是D12492(产品批号：19061202HS2.5；Research Diets，NewBrunswick，NJ，USA)，高脂饲料配方为：20％蛋白质、20％碳水化合物和60％脂肪。包装为SPF级(60Co辐照灭菌)。
其中，STZ注射液：避光低温下操作，称取STZ粉末1g，取配制好的柠檬酸钠缓冲溶液(pH＝4.4)100mL，于烧杯中溶解稀释成1％的STZ溶液，微孔滤膜0.22μm滤过除菌，待用。STZ不稳定，需低温避光操作，现配现用，用前震荡混匀，必须要在10min内注射完。
二甲双胍溶液：取5片二甲双胍片研磨成粉，按照标示量称取含药量为2.5g的药粉溶于100mL生理盐水，制成25mg/mL的二甲双胍溶液，微孔滤膜滤过除菌后于4℃保存，待用。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1牛大力醇提物的制备
所述牛大力醇提物的制备方法包括以下步骤：
将粉碎好的牛大力药材5.2kg放入回流装置中，量取10倍量95％乙醇，倒入回流装置中，浸泡半小时，在60℃下提取4次，每次3小时，过滤，合并滤液，用旋转蒸发仪回收乙醇得到浸膏，浸膏用真空干燥器干燥得到总浸膏(MSC)420g。
实施例2牛大力醇提物的制备
所述牛大力醇提物的制备方法包括以下步骤：
将粉碎好的牛大力药材5.0kg放入回流装置中，量取15倍量75％乙醇，倒入回流装置中，浸泡半小时，在50℃下提取4次，每次3小时，过滤，合并滤液，用旋转蒸发仪回收乙醇得到浸膏，浸膏用真空干燥器干燥得到总浸膏(MSC)398g。
实施例3牛大力醇提物的制备
所述牛大力醇提物的制备方法包括以下步骤：
将粉碎好的牛大力药材5.1kg放入回流装置中，量取5倍量60％乙醇，倒入回流装置中，浸泡半小时，在70℃下提取4次，每次2小时，过滤，合并滤液，用旋转蒸发仪回收乙醇得到浸膏，浸膏用真空干燥器干燥得到总浸膏(MSC)405g。
应用例1牛大力醇提物成分鉴定
1、实验材料：
供试品：牛大力经粉碎机粉碎，过80目筛，制成牛大力根粉末，精密称取原药材粉末2.0000g，放置50mL具塞锥形瓶中；精密量取20.00mL的95％乙醇到具塞锥形瓶中，浸泡12小时，水浴加热到55℃超声提取4小时；离心，取上清液，用0.22μm微孔滤膜滤过置进样小瓶中，待测。
2、实验方法：采用HPLC-Q-TOF/MS快速分析牛大力醇提物的化学成分
2.1HPLC色谱条件
色谱柱：色谱柱：Diamonsil(钻石)C18(5μm×250×4.6nm)，柱温为30℃，进样量为5uL，洗脱剂流速为0.8mL/min；流动相为乙腈和0.1％甲酸水按照表1洗脱条件进行梯度洗脱。
表1梯度洗脱条件
2.2质谱条件
质谱分析由Q/TOF-MS完成，采用电喷雾离子源(ESI)，离子扫描方式是正正离子全扫描模式，离子喷雾电压：1500V，氮气(N2)作为干燥气和雾化气，正离子模式干燥气温度550℃；离子源雾化气压力：150pis；干燥气流速：6.0L/min；碰撞电压：8pis，质量扫描范围m/z 100-1200。数据通过Data Acquisition数据采集，由Agilent MasshunterQualitative Analysis数据处理软件处理。
3、实验结果：
图1为牛大力醇提物的HPLC-Q-TOF/MS正离子模式色谱图。不同分子的二级质谱碎片呈现出不同的裂解途径。结合化合物分子量、保留时间、分子离子峰及元素分析，并与相关文献数据比较，共推定出86个化合物，其中包括酚酸类化合物15个、黄酮及黄酮苷类化合物23个，生物碱类化合物19个、甾体及萜类化合物9个以及氨基酸类化合物3个、糖及糖苷类化合物4个、酯类化合物9个、吲哚类2个、醌类1个、木脂素类1个。分子离子的质量误差在±5ppm以内。具体结果参见表2。
表2牛大力醇提物中各类化合物组成
表2给出了详细的质谱数据，由表可知，牛大力中主要的黄酮类化合物和生物碱类化合物所占比例分别为11.93％和17.45％，为进一步明确其药效物质基础和质量控制提供了充足的依据。
应用例2牛大力醇提物对糖尿病小鼠模型的影响
1、试验动物：从广东省医学实验动物中心订购60只4周龄健康雄性C57BL/6J小鼠。实验动物的质量合格证书为：No.44007200058430，许可证号为：SCXK(粤)2018-0002。
2、实验操作：
2.1 2型糖尿病小鼠模型建立：
小鼠饲养于广东药科大学实验动物中心，SPF级动物房，12小时交替照明，温度26～27℃，湿度35～65％，饲养室与外界差≥10Pa。适应性喂养1周，称小鼠体重。将60只鼠按体重随机分为正常组10只，高脂组50只；正常组给予普通饲料，高脂组给予高脂饲料，2天换一次垫料，给足水与食物，每笼5只。连续饲养4周，第五周小鼠禁食12h，高脂饲养组小鼠腹腔注射STZ 40mg/kg连续3天，正常组注射等体积的柠檬酸钠缓冲液，注射体积为0.1mL/10g。注射后每日监测高脂组小鼠饮食饮水量、尿量、体重(注射STZ后，小鼠饮水量和尿量会明显增加，注意给足水，勤换垫料)。停止注射第3天和第7天禁食不禁水12h测高脂组小鼠的空腹血糖，血糖值均≥11.1mmol/L的为血糖达标。若有血糖不达标的小鼠，再次注射STZ，至空腹血糖值稳定≥11.1mmol/L。
2.2实验动物的分组和给药
血糖达标后继续喂养2周。每周称量小鼠体重并测定血糖，注意观察2型糖尿病小鼠精神状态，运动状态，以及多饮多食多尿症状，勤换垫料给足水。根据血糖值与体重再次随机分组(使每组平均血糖值与体重相当)：模型组(DC)10只，二甲双胍阳性对照组(MET)10只，牛大力高剂量组(MSC-H)10只，牛大力中剂量组(MSC-M)10只，牛大力低剂量组(MSC-L)10只。分组后，除正常组(NC)外，各个治疗组与模型组的血糖值和体重均无显著性差异。2型糖尿病小鼠继续给予高脂饲料，正常组小鼠继续给予普通饲料喂养。给药期间，每天上午9点准时进行灌胃，正常组与模型组给予蒸馏水，二甲双胍阳性对照组给药剂量为250mg/kg。牛大力折合生药量为高剂量13.65g/kg、中剂量9.1g/kg、低剂量为4.55g/kg，各实验药物用水溶至相等体积后，每组按0.1mL/10g体重的剂量进行灌胃，持续60天。
2.3指标观察与检测方法
糖尿病小鼠给药期间每周检测大鼠的空腹血糖，在处死小鼠的前2天进行口服葡萄糖耐量实验。待小鼠恢复状态后，麻醉小鼠，小鼠眼球取血；取部分肝脏、脂肪、骨骼肌等组织液氮速冻后-80℃保存。取部分胰腺、肾脏和肝脏固定在4％的中性多聚甲醛中，石蜡切片，HE染色观察肝脏、肾脏和胰腺的形态。检测TC、TG、LDL-C、HDL-C、FBG等生化指标，ELISA法检测Insulin、CRH、ACTH、CORT等激素的含量。
2.3.1 2型糖尿病小鼠空腹血糖和体重的检测
所有小鼠禁食不禁水12h，称得其体重后用细针尾尖取第一滴血滴于血糖试纸上，将血糖试纸插于血糖仪上测定其血糖浓度。
2.3.2 2型糖尿病小鼠口服糖耐量(OGTT)的检测
在处死前两天，禁食不禁水12h，换垫料，防止垫料中存在残余食物。葡萄糖含量按照2g/kg灌胃，灌胃体积为0.1mL/10g，灌胃后分别在0、15、30、60、90、120min等时间点用血糖仪测定小鼠的血糖值。以时间为横坐标，血糖值为纵坐标作图，比较各曲线下面积(AUC)，使用下面的公式计算AUC，其中，BG为血糖值。
AUC＝(0h BG)×0.25+(0.5h BG)×0.5+(1h BG)×0.75+(2h BG)×0.5
2.3.3 2型糖尿病小鼠血清中葡萄糖(FBG)的检测
检测方法：在96孔酶标板上设立空白孔、校准孔、样品孔。每孔加入200μL的工作液，在空白孔加入2μL的蒸馏水，在校准孔加入2μL浓度为5.55mmol/L的校准品，在样品孔加入2μL的血清样本。混匀后37℃孵育5分钟，在酶标仪上设定505nm处测定各孔吸光度值，葡萄糖的计算公式如下：
葡萄糖(Glu)含量(mmol/l)＝(样本OD-空白OD)/(校准OD-空白OD)×校准品浓度(5.55mmol/L)
2.3.4 2型糖尿病小鼠血清中的胰岛素水平的检测
将血清从-80℃冰箱中的取出来放在冰上溶解，将胰岛素试剂盒从4℃冰箱中取出来，然后根据试剂盒说明书进行操作。在450nm波长下测量每孔的OD值。将标准品浓度设为横轴，各孔吸光度值设为纵轴，计算线性回归方程，计算含量，其中FBI为空腹胰岛素浓度。胰岛素抵抗指数公式为：
IRI＝FBG(mmol/L)×FBI(mIU/mL)/22.5
2.3.5 2型糖尿病小鼠血脂四项的检测
(1)COD-PAP法检测小鼠血清中的总胆固醇，在96孔酶标板上设立空白孔、校准孔、样品孔。每孔加入200μL的工作液，在空白孔加入2μL的蒸馏水，在校准孔加入2μL5.17mmol/L的校准品，在样品孔加入2μL的样本。混匀后37℃孵育10min，在酶标仪上于510nm处测定各孔吸光度值，胆固醇的计算公式：
总胆固醇含量(mmol/L)＝(样本OD-空白OD)/(校准OD-空白OD)×校准品浓度(5.17mmol/L)
(2)GPO-PAP酶法检测小鼠血清中的甘油三酯，在96孔酶标板上设立空白孔、校准孔、样品孔。每孔先加入200μL的工作液，然后依次在空白孔加入2μL的蒸馏水，在校准孔加入2μL浓度为2.26mmol/L的校准品，在样品孔加入2μL的样本。混匀后37℃孵育10min，在酶标仪上于500nm处测定各孔吸光度值，按公式计算甘油三酯的含量。甘油三酯的计算公式：
甘油三酯含量(mmol/L)＝(样本OD-空白OD)/(校准OD-空白OD)×校准品浓度(2.26mmol/L)
(3)直接法检测小鼠血清中的高、低密度脂蛋白，在96孔酶标板上设立空白孔、校准孔、样品孔。每孔先加入180μL的工作液R1，然后依次在空白孔加入2.5μL的蒸馏水，在校准孔加入2.5μL浓度为1.8mmol/L的校准品，在样品孔加入2.5μL的样本。混匀后37℃孵育5min，在酶标仪上于546nm处测定各孔吸光度值A1，然后每孔加入60μL的工作液R2，混匀后37℃孵育5min，在酶标仪上于546nm处测定各孔吸光度值A2。高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)计算公式如下：
HDL-C含量(mmol/L)＝[(样本A2-样本A1)/(空白A2-空白A1)]/[(标准A2-标准A1)/(空白A2-空白A1)]×校准品浓度(1.8mmol/L)
LDL-C含量(mmol/L)＝[(样本A2-样本A1)/(空白A2-空白A1)]/[(标准A2-标准A1)/(空白A2-空白A1)]×校准品浓度(4.3mmol/L)
2.3.6HPA轴相关激素的检测
(1)酶联免疫检法检测小鼠促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)和促肾上腺皮质激素(ACTH)。在96孔酶标板上设立空白孔、校准品孔、样品孔。先将标准品配置成6个浓度，分别为0、31.25、62.5、125、250、500ng/mL，然后将其加入到标准品孔中50μL；在待测样品孔中加入样品稀释液体积80μL，再在待测样品孔中每孔加入对应编号小鼠的血清样本20μL。每孔加入酶标试剂100μL，空白组不加。37℃孵育60min，清洗、干燥后，在板上面各孔中依次加入显色剂A和B各50μL。在37℃暗房中反应15min。中止反应，等到溶液的颜色变成淡黄色，反应终止，10min内使用酶标仪在450nm波长下读取各孔吸光度值。以标准品浓度为X轴，450nm下读取的各检测孔吸光度值为Y轴，依据方程式绘制出标准曲线。方程式及标准曲线如下：
logit＝ln(B/B0)/(1－B/B0)
y＝a+bx+cx2
(2)酶联免疫法检测大鼠血清中的皮质酮(CORT)。将血清从-80℃冰箱中的取出来放在冰上溶解，将胰岛素试剂盒从4℃冰箱中取出来，然后根据试剂盒说明书进行操作，使用酶标仪在450nm波长下读取各孔吸光度值。以标准品浓度为X轴，450nm下读取的各检测孔吸光度值为Y轴，依据方程式绘制出标准曲线。方程式及标准曲线如下：
logit＝ln(B/B0)/(1－B/B0)
y＝a+bx+cx2
2.3.7病理切片的观察
小鼠解剖取出胰腺、肝脏、肾脏，用PBS冲洗干净后用滤纸吸干水分。取所有未损伤的组织标本，切成0.5cm×0.5cm×0.3cm的小块，制成切片在光学显微镜放大400倍，观察各组小鼠的肝脏、胰腺和肾脏的病理状态。
2.3.8统计分析
采用GraphPad Prism 7绘图统计软件进行数据统计分析。实验数据用平均值±标准差(mean±SD)表示，各组间差异性采用SPSS19.0进行比较。P<0.05表示有统计学意义。
3、实验结果与分析
3.1牛大力在给药期间对小鼠血糖和体重的影响
表3牛大力对糖尿病小鼠血糖的影响(n＝8)
注：*表示与模型组相比，P<0.05；**表示与模型组相比，P<0.01；##表示与正常组相比，P<0.01。
由表3可见，与正常组比较，模型组的空腹血糖值显著升高，具有统计学差异(P<0.05)，表明糖尿病小鼠模型造模成功；给药三周后，与模型组比，二甲双胍给药组和牛大力给药组的血糖值显著降低(P<0.05)。表明牛大力可显著降低T2DM小鼠的空腹血糖值，药效显著。
由图2可见，在42天后，二甲双胍给药组和牛大力给药组小鼠的体重显著增加，而模型组小鼠的体重逐渐下降(P<0.01或P<0.05)。
3.2牛大力对T2DM小鼠口服糖耐量的影响
由图3～4可见，各组小鼠在口服葡萄糖30min时，血糖值达到最高点。曲线下面积(AUC)计算结果显示，与模型组相比，牛大力高剂量和二甲双胍均能显著降低T2DM的AUC值(P<0.01或P<0.05)。这表明牛大力可显著提高糖尿病小鼠的糖耐量。
3.3牛大力对T2DM小鼠血糖(FBG)、胰岛素(FINS)、胰岛抵抗指数(HOMA-IRI)的影响
表4牛大力对T2DM小鼠血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数的影响(n＝6)
注：*表示与模型组相比，P<0.05；**表示与模型组相比，P<0.01；##表示与正常组相比，P<0.01。
由表4可见，模型组的血糖水平显著高于正常组(P<0.01)，与模型组相比，二甲双胍给药组、牛大力高剂量组和牛大力中剂量组的空腹血糖值显著降低(P<0.01)；给药组与模型组胰岛素水平无显著性差异；与模型组相比，二甲双胍、牛大力高中剂量可显著降低T2DM小鼠的胰岛素抵抗指数(P<0.01或P<0.05)。以上结果表明牛大力可提高T2DM的胰岛素敏感性，从而改善T2DM的糖代谢。
3.4牛大力对T2DM小鼠血脂四项的影响
表5牛大力对T2DM小鼠血脂代谢的影响(n＝6)
注：*表示与模型组相比，P<0.05；**表示与模型组相比，P<0.01；##表示与正常组相比，P<0.01。
由表5可见，与正常组相比，模型组的TC和LDL-C水平显著升高(P<0.05或P<0.01)；TG水平高于正常组，HDL-C水平低于正常组，但二者均无显著性差异。给药干预后，与模型组相比，牛大力给药组均可显著降低T2DM小鼠的TC、TG、LDL-C水平，显著提高HDL-C水平。这表明，牛大力可显著改善T2DM小鼠的脂代谢紊乱。
3.5牛大力对糖尿病小鼠HPA轴相关激素的影响
表6牛大力对糖尿病小鼠血清中HPA轴相关激素的影响(n＝6)
| 组别 | 剂量(g/kg) | CRH(pg/mL) | ACTH(mmol/L) | CORT(mmol/L) |
| NC | — | 4.56±0.54<sup>**</sup> | 1.24±0.06 | 1.611±0.31 |
| DC | — | 6.684±0.59<sup>##</sup> | 1.523±0.24 | 3.121±0.63<sup>#</sup> |
| MET | 250 mg/kg | 5.056±0.52<sup>**</sup> | 1.39±0.12 | 1.454±0.79<sup>*</sup> |
| MSC-H | 13.65 g/kg | 5.361±0.45<sup>**</sup> | 0.74±0.18<sup>**</sup> | 1.34±0.19<sup>**</sup> |
| MSC-M | 9.1 g/kg | 5.661±0.24<sup>**</sup> | 0.88±0.34<sup>*</sup> | 1.591±0.14<sup>*</sup> |
| MSC-L | 4.55 g/kg | 5.548±0.81<sup>*</sup> | 1.027±0.43 | 2.209±0.41 |
注：*表示与模型组相比，P<0.05；**表示与模型组相比，P<0.01；##表示与正常组相比，P<0.01。
由表6可见，与正常组相比，模型组血清中CRH含量显著升高，ACTH含量显著降低，CORT含量无明显变化，表明模型组小鼠体内HPA轴相关激素代谢紊乱。与模型组相比，二甲双胍和牛大力可显著降低小鼠血清中的CRH水平，升高ACTH水平(P<0.05或P<0.01)，表明牛大力具有调节T2DM小鼠HPA轴相关激素紊乱的作用。
3.6牛大力对糖尿病小鼠肝脏、胰腺、肾脏的病理状态的影响
各组肝脏的病理检查如图5所示，可见正常组小鼠的肝细胞形态正常，排列有序，是正常的肝组织结构。T2DM小鼠在STZ诱导后有严重的病理变化，结构中出现大量的脂滴空泡、肝细胞广泛水肿和脂肪变性。与模型组小鼠相比，牛大力可减少小鼠肝脏组织中的脂滴空泡，肝组织中仅伴有少量细胞炎性浸润，改善脂肪变性。
各组肾脏的病理检查如图6所示，可见与正常组相比，模型组小鼠肾脏发生严重损伤，其肾小球肿大，基底膜增厚，出现空泡样病变。给药牛大力后，牛大力中低剂量组小鼠的肾小球没有肿大，基底膜也没有增厚，能显著地缓解造成的病理学损伤。
各组胰腺病理检查如图7所示，可见正常组胰腺结构清晰，形态正常。与正常组小鼠相比，模型组小鼠出现腺泡细胞局灶性坏死、胰岛面积变小。通过给药牛大力和二甲双胍后，胰腺的腺泡增多，胰岛面积得到修复。
应用例3牛大力醇提物对糖尿病小鼠模型影响的机理研究
PI3K/Akt通路是最重要的信号通路之一，被认为是胰岛素抵抗的主要机制。胰岛素的作用主要通过胰岛素受体底物(IRS)-磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)途径介导，Akt被磷酸化后将含有葡萄糖转运蛋白4(GLUT-4)的细胞内囊泡运输到质膜，这促进了葡萄糖在组织中的利用。在胰岛素抵抗中，包括肝脏在内的几个组织中的PI3K/Akt/GLUT4信号通路是抑制的。本应用例运用RT-PCR法检测肝脏、脂肪、骨骼肌中IRS2、PI3K、Akt、GLUT4的mRNA水平；Western-Blot法检测肝脏、脂肪、骨骼肌中PI3K、Akt、GLUT4的蛋白水平，探讨醇提物对糖尿病小鼠模型影响的机理。
1、实验材料：应用例2中各组小鼠解剖后，迅速分离取出小鼠肝组织、皮下脂肪、骨骼肌；用已经预冷好的PBS缓冲液洗掉取材组织中的血液后，用少量滤纸将溶液吸干，取部分样本迅速置于冻存管中放入液氮，转移到-80℃冰箱长期保存，待用。
2、实验方法：
2.1引物的设计：参考表7中IRS2、PI3K、AKT、GLUT4 mRNA引物序列，合成上下游引物，选取三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参，各个基因表达与其对比。
表7引物序列(小鼠)
2.2总RNA的提取
将各组的肝脏、脂肪、骨骼肌从-80℃冰箱拿出，迅速称取约10mg左右，经提取、沉淀、清洗、复溶等常规RNA提取操作，使用超微量紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，纯度符合要求的样品统一标准化到1000ng/μL，然后保存在-80℃。
2.3逆转录反应(cDNA第一链的合成)
按照逆转录试剂盒要求，进行cDNA合成，以用于基因的扩增。
2.4实时荧光定量聚合酶链式反应
按照PCR扩增试剂盒说明书操作，将2.3所得到的样品反应进行PCR的扩增。采用2-ΔΔCt的相对定量表达法进行组间基因表达分析，各组数据与正常组作比较，得出各组的相对表达量。
2.5Western-Blot实验
2.5.1实验溶液的准备
准备5×还原型SDS上样缓冲液(5×SDS Loading Buffer)、10％SDS溶液、10％过硫酸铵(APS)溶液、3％脱脂奶粉封闭液(现配现用)、30％Acr-Bis溶液、10×电泳缓冲液、10×转移缓冲液。
2.5.2组织总蛋白提取及蛋白样品前处理
从-80℃冰箱拿出冻存的肝组织、脂肪组织、骨骼肌迅速称取约50-100mg左右，经提取、分离后按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行蛋白定量。以浓度最低的蛋白浓度为标准，使用PBS将剩余的其他样品蛋白调到相同浓度。蛋白样品：Loading Buffer＝4：1混合均匀，在100℃水浴锅内煮沸10min，根据实验需要分装后-20℃保存。
2.5.3聚丙烯胺凝胶电泳及转膜
制胶：
10％分离胶的配方：超纯水5.9mL，30％Acr-Bic 5.0mL，1.5mol/L Tris.HCL(pH＝8.8)3.8mL，10％SDS 150μL，10％APS 150μL，TEMED 6μL。
5％浓缩胶的配方：超纯水2.7mL，30％Acr-Bic 0.67mL，1.5mol/L Tris.HCL(pH＝8.8)0.5mL，10％SDS 40μL，10％APS 40μL，TEMED 4μL。
经上样、电泳、转膜后待测。
2.5.4免疫反应及化学发光
将2.5.3样品经洗膜、封闭、洗膜、一抗孵育(参照说明书操作)、洗膜、二抗孵育(参照说明书操作)、洗膜等操作后，进行蛋白检测：等体积混合适量Thermo ScientificTM ECLA液和B液，现配现用。把膜从孵育盒中取出，放于滤纸上吸去过多的液体，然后将膜的蛋白面朝上放于一张干净的保鲜膜上。将ECL工作混合液均匀覆盖在膜上，避光放置1分钟。然后将膜放在化学发光成像仪中拍摄照片，然后将目的条带进行灰度扫描后进行数据分析。
2.5.5统计分析
采用Image J对Western Blot的灰度进行分析；采用GraphPad Prism 7绘图统计软件进行数据统计分析。实验数据用平均值±标准差(mean±SD)表示，各组间采用One wayAVOVA进行比较。P<0.05表示有统计学意义。
3、实验结果：
3.1牛大力醇提物对T2DM小鼠肝脏IRS2、PI3K、Akt、GLUT4mRNA和蛋白表达的影响
结果参见图8～9；由图可见，与模型组相比，牛大力醇提物和二甲双胍可显著上调T2DM小鼠肝脏中IRS2 mRNA和GLUT4 mRNA的表达水平，表明牛大力通过调节IRS2/PI3K/Akt/GLUT4通路，改善T2DM小鼠的血糖代谢；与正常组相比，高脂饮食联合小剂量STZ诱导的T2DM小鼠肝脏中PI3K/Akt/GLUT4信号通路中相关信号分子的表达水平降低(P<0.05或P<0.01)，表明T2DM小鼠肝脏组织PI3K/Akt/GLUT4信号通路被抑制。与模型组相比，牛大力和二甲双胍可显著上调PI3K/Akt/GLUT4信号通路中PI3K、Akt和GLUT4蛋白的表达量(P<0.05或P<0.01)。
3.2牛大力对T2DM小鼠脂肪IRS2、PI3K、Akt、GLUT4mRNA和蛋白表达的影响
结果参见图10～11，由图可见，与模型组相比，牛大力高剂量和二甲双胍显著上调T2DM小鼠脂肪中IRS2mRNA、PI3KmRNA、AktmRNA和GLUT4mRNA的表达水平，表明牛大力可以通过调节脂肪中IRS2/PI3K/Akt/GLUT4通路，改善T2DM小鼠的血糖；与正常组相比，模型组小鼠脂肪PI3K/Akt/GLUT4信号通路中相关信号分子的表达水平降低(P<0.05或P<0.01)，表明T2DM小鼠脂肪组织中PI3K/Akt/GLUT4信号通路被抑制，与模型组相比，牛大力高、中剂量和二甲双胍均能显著上调PI3K/Akt/GLUT4信号通路中PI3K和GLUT4蛋白的表达量(P<0.05或P<0.01)。
3.3牛大力对T2DM小鼠骨骼肌IRS2、PI3K、Akt、GLUT4mRNA和蛋白表达的影响
结果参见图12～13，由图可见，与模型组相比，牛大力高、中剂量和二甲双胍显著上调T2DM小鼠骨骼肌中AktmRNA和GLUT4mRNA的表达水平，表明牛大力通过调节骨骼肌中PI3K/Akt/GLUT4通路，改善T2DM小鼠的血糖水平；与正常组相比，模型组小鼠骨骼肌中PI3K/Akt/GLUT4信号通路中相关信号分子的表达水降低(P<0.05或P<0.01)，表明T2DM小鼠骨骼肌组织PI3K/Akt/GLUT4信号通路被抑制，与模型组相比，牛大力高剂量和二甲双胍均能显著上调PI3K/Akt/GLUT4信号通路中Akt和GLUT4蛋白的表达量增加(P<0.05或P<0.01)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.牛大力醇提物在制备降血糖或降血脂药物、调节血糖或血脂保健品中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述牛大力醇提物的制备方法包括以下步骤：
将牛大力干燥、粉碎，加入质量体积比为5～50g/ml的乙醇溶液，浸泡15～45min，50～70℃提取2～4次，每次提取1～3h，过滤，合并滤液，浓缩干燥，即得。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述乙醇溶液为50～100％乙醇溶液。
4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所得牛大力醇提物的生药量为10～20kg/g。
5.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述牛大力醇提物含有酚酸及酸类化合物、黄酮类化合物、生物碱类化合物、糖及糖苷类化合物、萜类及甾体类化合物、氨基酸类化合物、酯类化合物、吲哚类、醌类、木脂素类化合物。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述牛大力醇提物中黄酮类化合物占比为8～15％。
7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述牛大力醇提物中生物碱类化合物占比为10～20％。
8.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述牛大力醇提物可以降低胰岛素抵抗指数。
9.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述牛大力醇提物可以改善糖尿病引起的HPA轴功能紊乱。
10.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述牛大力醇提物可以提高IRS2、PI3K、Akt和GLUT4的表达。
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|---|---|---|---|---|
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| CN105727022A (zh) * | 2016-03-07 | 2016-07-06 | 李鹏程 | 一种含有中草药的药酒 |
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