CN103099832A - 假丝酵母对三七的生物转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及酵母菌对中药三七之主要成分三七皂苷的生物转化方法，具体地说，本发明涉及利用假丝酵母，特别是利用朗比可假丝酵母对三七皂苷的生物学转化方法。经过酵母菌的转化后，三七总皂苷的含量，特别是人参皂苷Rg₃、Rh₂等稀有人参皂苷的含量得以显著增加。经过朗比可假丝酵母转化的三七皂苷可作为原料，用于医药、保健品或者化妆品的生产。

Description

假丝酵母对三七的生物转化方法

技术领域

本发明涉及酵母菌对中药三七之主要成分三七皂苷的生物转化方法，具体地说，本发明涉及利用假丝酵母，特别是利用朗比可假丝酵母对三七皂苷的生物学转化方法。经过酵母菌的转化后，三七总皂苷的含量，特别是人参皂苷Rg3、Rh2等稀有人参皂苷的含量得以显著增加。经过朗比可假丝酵母转化的三七皂苷可作为原料，用于医药、保健品或者化妆品的生产。

技术背景

三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)为五加科植物，以其干燥的根入药。三七又称为山膝、田三七、血参、人参三七。三七用于治疗疾病已有悠久的历史，是我国传统的中药。三七中皂苷成分是三七主要的生理活性成分。迄今为止，已从三七的不同部位分离得到60余种单体皂苷成分，这些单体皂苷成分大多数为达玛烷型的20(S)-原人参二醇型[20(S)-protopanaxadiol]和20-(S)原人参三醇型[20(S)-peotopanaxatriol]。

三七根中主要有效成分是达玛烷型人参皂苷Rb₁、Rg₁、Rd、Re和三七特有三七皂苷R₁，以及少量的稀有人参皂苷Rg₂、Rh₁。其中人参皂苷Rb₁和Rg₁在天然植物中含量较高，而稀有人参皂苷Rg₃、Rh₂等含量甚微。

现代化学和药理学研究发现，三七总皂苷(Panaxnotoginoside，PNS)在耐缺氧、抗衰老、提高机体免疫力等方面的药理作用显著优于人参总皂苷，且PNS和部分单体皂苷在血液系统、心脑血管系统、神经系统、物质代谢以及抗炎、抗肿瘤等方面均有较好活性。

三七皂苷可通过直接杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞生长或转移、诱导肿瘤细胞凋亡或诱导肿瘤细胞分化使其逆转、增强和刺激机体免疫功能等多种方式起到抗肿瘤的作用。

三七皂苷包括人参皂苷Rb₁、Rg₁等多种活性单体，具有营养局部皮肤、血管和毛囊组织等功能。有研究发现，人参皂苷Rg₁具有明显的抗氧化、抗衰老功能。已有报道，三七皂苷能促进皮肤胶原蛋白合成，具有明显的抗皮肤衰老作用(王丽红，吴铁，吴志华，等.人参皂苷抗皮肤衰老作用实验研究[J].广东药学院学报，2003，19(1)：25-27.)。

某些在三七中含量极低的三七皂苷被称为次级人参皂苷或稀有人参皂苷。天然的皂苷并不一定是生理活性最高的分子结构，药理学研究表明，稀有人参皂苷(如Rh₁、Rh₂、Rg₃等)药效尤为珍贵(李学哲，朴惠顺.人参皂苷Rh2含量测定方法及药理作用研究现状.延边大学医学学报，2009，32(2)：153-156.；Wang CZ，Xie JT，FishbeinA，et al.Antiproliferative effects of different plant parts of Panaxnotoginseng on SW480human colorectal cancer cells.Phytother Res，2009，23(1)6-13)。这些成分在某些难治性疾病如肿瘤治疗方面显示独特的疗效。对皂苷活性的研究还发现，人参皂苷的抗肿瘤活性与皂苷糖链结构的关系为：苷元＞单糖苷＞二糖苷＞三糖苷＞四糖苷(Dou DQ，Jin L，Chen YJ.Advances and prospectsof the study on chemical constituents and pharmacological activities of panaxginseng.J Shenyang Pharm Univ，1999，16(2)：151-156；窦德强，靳玲，陈英杰.人参的化学成分及药理活性的研究进展与展望.沈阳药科大学学报，1999，16(2)：151-156)。

稀有人参皂苷Rg₃是从红参(栽培人参经晒干或烘干再蒸制而成)中微量提取的，其提取率仅为0.003％，人参皂苷Rg₃可直接作用于癌细胞，诱导其凋亡，抑制肿瘤的生长或诱导其分化使其逆转。(余新建，20(R)-人参皂苷Rg₃抗肿瘤活性研究近况，世界中西医结合杂志2007年增刊，2007，235-236)。以人参皂苷Rg₃为主要成分的抗癌新药参一胶囊已获国家食品药品监督管理局颁发的中药一类新药证书。人参皂苷Rh ₂属微量成分，仅占人参总皂苷含量的万分之二。人参皂苷Rh ₂是一种抗肿瘤天然植物成分，也可由人参皂苷Rg₃降解得到。对小鼠的肺癌细胞、B₁₆黑色素瘤细胞、大鼠Morris肝癌细胞的增殖具有明显的特异性抑瘤作用，是配合放疗、化疗增效减毒的首选药物(陈业高，黄荣，桂世鸿，等，三七叶苷制备抗癌活性成分20(R)-人参皂苷-Rh₂和人参皂苷Rg ₃，化学研究与应用，2004，16(1)：69-70；蒋磊，赵寿经，梁彦龙，李军华，HPLC法测定酶转化生产人参皂苷Rh ₂的含量，特产研究，2004，1，41-44)。

由于次级人参皂苷含量极低，故很难通过传统的提取方法得到。但如果对天然皂苷的结构进行定向的改变，就会得到生理活性更高、应用价值更大稀有皂苷。通常是先从三七提取含量丰富的人参皂苷，然后再将提取得到的人参皂苷降解，由此获得稀有的次级人参皂苷。人参皂苷的降解就是将人参皂苷分子上的部分或全部糖基水解，得到含糖基较少的次级人参皂苷或皂苷元。常规使用的人参皂苷降解方法包括酸降解法、碱降解法和酶降解法等。

本发明提供了一种用于将三七中人参皂苷转化为次级人参皂苷或者稀有人参皂苷的微生物学转化技术，利用本发明的方法可以有效地改变皂苷的糖链结构，获得较大量的稀有人参皂苷，因此本发明的方法具有重要科研意义和产业上的巨大价值。

发明内容

本发明涉及利用酵母菌对中药三七之主要成分人参皂苷的生物转化，特别涉及利用朗比可假丝酵母对三七中人参皂苷的生物学转化方法。经过酵母菌的转化后，三七总皂苷的含量，特别是人参皂苷Rg₃等稀有人参皂苷的含量得以显著增加。

三七皂苷各种单体的分离纯化和药理活性的研究发现，许多稀有皂苷、特别是许多天然来源有限的人参皂苷，例如人参皂苷Rg₃等稀有人参皂苷生理活性更高、应用价值更大，具有很好的开发前景。对多种稀有皂苷获得方法的比较研究可以发现，微生物转化方法获得的稀有皂苷具有很多特有的优点。

本发明的目的是利用酵母菌对中药三七中的人参皂苷的生物学转化，以获得具有更高活性的稀有皂苷。其中所说的酵母菌是假丝酵母，特别是朗比可假丝酵母(AS2.1763，Candida lambica，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC，中国北京)。

一般说来，制备酵母菌转化三七中人参皂苷的转化物，通常采用粉碎技术将三七粉碎，过100目网筛，可使三七的转化浓度为转化总体积的2.5％～7.5％(重量/体积)。可以在已经粉碎的三七粉()100目)中加入适量饮用水，浸泡1～3小时后，然后于大约115～121℃灭菌40分钟，即得到继后用于酵母菌转化三七的底物。

当按上述方法制备的用于酵母菌转化的三七底物灭菌后，温度降至30℃左右时，接种预培养的朗比可假丝酵母菌液(占转化总体积的20％～50％，体积/体积)，于大约25℃～35℃培养2～6天。

三七加入朗比可假丝酵母转化的温度一般是25℃～35℃，摇床培养或者发酵罐好氧培养。

为了筛选出朗比可假丝酵母对三七中人参皂苷的最佳转化条件，我们利用正交试验(三因素三水平)方法，采用薄层色谱法(中国药典2010版一部附录VIB)以稀有人参皂苷Rg₃峰面积为指标，结果显示，三七浓度为转化总体积的5％(重量/体积)接种量占转化总体积的50％(体积/体积)、培养转化时间为96小时条件下，假丝酵母转化三七皂苷的稀有人参皂苷Rg₃含量最高。

朗比可假丝酵母对三七中人参皂苷的转化正交试验的薄层色谱图参见附图1。

利用分光光度法(保健食品检验与评价技术规范：保健食品中总皂苷的测定)检测了朗比可假丝酵母转化前后三七总皂苷的变化，其含量提高了66.10％。

假丝酵母转化前后三七总皂苷的变化薄层色谱图参见附图2。

我们的实验研究表明，经过利用本发明的方法生物转化的三七，明显地增加了三七总皂苷的含量，特别是人参皂苷Rg₃等稀有人参皂苷的含量。经过生物转化的三七可作为原料，用于医药、保健品或者化妆品的生产。某些在三七中含量极低的人参皂苷即次级人参皂苷或稀有人参皂苷，具有很强的药理活性。例如稀有人参皂苷Rg₃可直接作用于癌细胞，诱导其凋亡，抑制肿瘤的生长或诱导其分化使其逆转。人参皂苷Rg3还具有抑制肿瘤细胞增殖、抑制血管内皮细胞增殖和免疫调节作用(余新建，20(R)-人参皂苷Rg₃抗肿瘤活性研究近况，世界中西医结合杂志2007年增刊，2007，235-236)。

本发明的意义在于为中药三七的转化提供了一种新的、简便易行的微生物学方法，和用于转化的无害微生物。从而，为中药三七在更广泛的领域内更有效地利用提供了前提条件。

附图说明

附图1是实施例1的色谱图。显示中药三七在使用朗比可假丝酵母生物转化正交试验的结果。从图中可以看出，三七经过朗比可假丝酵母的转化后，稀有皂苷斑点明显增加。其中上面的图是日光下的观察结果；下面的图是365nm荧光下观察结果。图中0为发酵(转化)前的样品；1～9为发酵(转化)后的样品；S为Rb₁、Re、Rg₁、Rg₃、Rh₂对照样品。展开剂为氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)。

附图2是实施例2的色谱图。显示中药三七在使用朗比可假丝酵母生物转化(加朗比可假丝酵母发酵)前和后，三七皂苷薄层色谱图的变化。色谱图显示，三七中的稀有皂苷斑点明显增加。其中左边的图是日光下的观察结果；右边的图是365nm荧光下观察结果。图中0为发酵(转化)前的样品；1为发酵(转化)后的样品；S为Rb₁、Re、Rg₁、Rg₃、Rh₂对照样品。展开剂为氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)。

具体实施方式

实施例1：三七转化浓度、转化时间、接种量转化条件对转化效果的影响

利用正交试验，设计了三个因素包括发酵转化时间、三七的转化浓度和朗比可假丝酵母的接种量，每个因素取三个水平(具体参见表1)。取干燥的三七，粉碎后，过100目筛，根据正交试验的设计组合的9个样品，称量如表1所示不同重量的三七粉。各样品加适量饮用水浸泡3小时后，115℃、40分钟灭菌。得到不同浓度的三七转化底物，当温度降至30℃左右时，按照表1中的接种量，接入预培养的朗比可假丝酵母菌液，30℃摇床培养，转速10rpm。不同转化时间、不同的三七转化浓度和不同朗比可假丝酵母接种量的各实验样品稀有人参皂苷Rg₃峰面积的数值参见表2。

表1转化因素水平表

表2正交试验方案及其结果

利用薄层色谱法对各样品进行检测。

具体检测方法如下：

转化样品溶液制备：样品发酵转化完毕后，将每个样品中加入适量的饮用水，使各样品三七浓度一致，然后再加入各样品体积的1.5倍无水乙醇，充分摇匀，于70℃水浴浸提120分钟，取上清液作为供试品溶液(1-9)。

未转化样品溶液制备：取三七粉加饮用水配制相同浓度混悬液，浸泡3小时。然后加1.5倍体积无水乙醇，充分摇匀，于70℃水浴浸提120分钟，取上清液作为阴性对照溶液(0)。

对照品溶液制备：取人参皂苷Rb₁对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rg₁对照品、人参皂苷Rg₃对照品、人参皂苷Rh₂对照品，分别加甲醇制成相应浓度的溶液，作为对照品溶液(S)。

按照标准的薄层色谱法(中国药典2010版一部附录VIB)进行试验。将待试样品溶液和对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上。以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂。展开后，取出晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰(参见附图1)。

结果可见，供试样品(1-9)色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显示相同颜色的斑点；同时置紫外光灯(365nm)下检视，显示出相同的荧光斑点。与未转化样品(0)色谱对比，其中人参皂苷Rg₃、人参皂苷Rh₂等斑点明显增加，表明经过朗比可假丝酵母转化后，三七中稀有皂苷的含量明显增加(参见附图1)。利用薄层扫描仪，照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录VIB)进行扫描，波长：λ＝525nm，对色谱图中供试品与对照品相对应位置的人参皂苷Rg₃斑点分别进行扫描，得出各样品的人参皂苷Rg₃的峰面积(未转化样品溶液人参皂苷Rg₃的峰面积为702)，经过假丝酵母转化的各样品中的三七人参皂苷Rg₃的峰面积数值如表2所示。

从表2中所显示的极差R值可以看出，对转化率影响最大的因素是接种量(C)、其次是转化时间(A)、第三是三七浓度(B)。从试验结果中可以看出，其中最佳转化条件是A₂B₂C₃，即以5％三七为底物，按50％接种量，经96小时的假丝酵母转化后，其人参皂苷Rg₃含量是未转化样品的7.46倍。

实施例2：朗比克假丝酵母转化前后三七总皂苷的变化

利用分光光度法(保健食品检验与评价技术规范：保健食品中总皂苷的测定)检测了朗比可假丝酵母转化前后三七总皂苷的变化。结果可以看出，与未转化的总皂苷相比，其含量提高了66.10％。

称取干燥的三七，粉碎后，过100目筛，精密称取三七粉，使三七浓度为总转化体积的2.5％(重量/体积)。加适量饮用水浸泡3小时以后，高压121℃下灭菌40分钟。当温度冷却至30℃左右时，接入预培养的朗比可假丝酵母菌液，使转化液中朗比克假丝酵母菌液体积占总体积的35％。于30℃下、进行摇床培养(转速为10rpm/分钟)。培养96小时后，加1.5倍体积的无水乙醇，充分摇匀，于70℃水浴浸提120分钟，取上清液作为供试品溶液。以同浓度未转化三七样品相同条件提取，作为未转化的样品。

对照品溶液：以人参皂苷Rg₁(0.72mg/ml)为对照，取样100μl。

取供试品溶液1ml，60℃水浴蒸干，加水溶解定容至10ml，取0.6ml上柱(Amberlite-XAD-2大孔树脂)，先用25ml水洗柱后，弃去洗脱液，用25ml 70％乙醇洗脱。收集洗脱液于蒸发皿中，置于60℃水浴蒸干。在已挥干的蒸发皿中准确加入新配制的浓度5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml。转动蒸发皿，使残渣均被溶解后，再加高氯酸0.8ml，混匀。移入带塞的试管中，在60℃水浴中加热10分钟。然后立即置冰水中冷却，准确加入冰醋酸5.0ml摇匀，放置15分钟。以相应试剂作为空白对照，在最大吸收波长650nm处测定吸光度A。检测结果见表3。

表3假丝酵母转化后三七总皂苷的变化

检测结果显示，三七总皂苷较转化前提高了66.10％。

Claims (5)

1.利用假丝酵母对三七皂苷的进行生物学转化，以获得具有更高含量次级或稀有人参皂苷。

2.根据权利要求1的方法，该方法包括首先将三七粉碎，过100目网筛后，在已经粉碎的三七粉中加入适量的饮用水，浸泡1～3小时后，然后于大约115℃～121℃灭菌40分钟，即得到用于假丝酵母菌转化三七的底物，当三七底物的温度降至30℃左右时，接种预培养的假丝酵母菌转化三七中人参皂苷，于25℃～35℃下培养2～6天，以完成三七人参皂苷的生物学转化。

3.根据权利要求2的方法，其中所说的假丝酵母是朗比可假丝酵母菌。

4.根据权利要求2的方法，其中所说的发酵培养是摇床培养或者发酵罐好氧培养。

5.根据权利要求1或2的方法，其中所说的被转化的三七中稀有人参皂苷可用于生产医药、保健品和化妆品的原料。

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