CN101095710A - 一种发酵改善三七主要功效成份的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵改善三七主要功效成份的方法，包括：(1)将芽孢杆菌LB斜面种子培养24小时后转接到LB液体培养基，培养得到培养液；(2)将三七与蒸馏水混合，灭菌处理得到三七转化培养基；(3)将步骤(1)得到的培养液无菌接入三七转化培养基，对三七进行培养转化(4)将转化后的三七干燥至恒重，得到经过发酵改善的三七。本发明采用微生物方法对三七进行生物转化，比转化前三七中主要功效成份含量提高了4～6倍，提取率液提高了将近两倍。为传统中药材的深度开发和利用提供更好的方法和平台。

Description

一种发酵改善三七主要功效成份的方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其是设涉及一种采用微生物方法改善三七药材主要功效成份(总皂苷)的方法。

技术背景

我国中药历史悠久，中药资源丰富，为保证广大人民的身体健康起到巨大作用，国际上正越来越意识到中药在治疗和预防疾病中的重要作用。但近几十年来，我国在中药现代化方面进展缓慢，主要原因是中药加工技术陈旧，中药中的有效成份不清楚等。近年来新兴发展中药发酵制药技术是促使中药资源和微生物资源有效结合的一个新型研究领域。中药发酵制药技术是继承中药炮制学发酵法的基础上，吸取了微生态学研究成果，结合现代生物工程的发酵技术和目前热点益生菌研究技术而形成的高科技中药制药新技术，是从天然的中药中寻找药物的新疗效，具有很大的研究价值和市场开发意义。越来越多的研究表明，大部分中药的有效成份是经过人肠道内益生菌代谢后才发挥药效的，而且研究还发现部分中药在肠道内转化后反而能促进人体胃肠道内有益菌群的增殖，抑制了有害菌的繁殖。该项目开发出的益生菌中草药制剂或含中草药成份的复合益生菌产品不仅在人类疾病的预防和治疗上有着很好的应用意义，在促进动物的生长和预防动物疾病上也有着显著的作用，微生物发酵中药以其独特的生物多样性，为发现新的活性成份和开发新药提供了极大的可能和研究价值。

中药发酵研究开始于20世纪80年代，但大部分研究仅仅限于真菌类自身发酵，而且是单一的菌发酵，虽有报道加入中药，但也仅是将中药作为菌丝体发酵的基质。90年代初，日本学者小桥恭一发现中草药成份如番泻叶甙，可借助肠道细菌转化为致泄有效成份而起到治疗作用的。也有报道，在中药有效成份与细菌的相互作用过程中，许多苷类、黄酮类、黄酮醇、香豆素类等均经过肠道菌进行了化学修饰。另外，哈巴苷是玄参的主要环烯醚萜成份之一，经人体肠道细菌生物转化产生三个主要产物，其中包括一个已知的化合物和两个新的化合物。因此，细菌尤其是人体胃肠道中益生菌群对中药活性成份的转化机理、生理活性及其自身生长代谢规律等都有待进一步深入研究。

越来越多的实践证明中草药和益生菌在防病促生长方面是相辅相成的。田碧云研究表明阿胶、五味子、枸杞和刺五加等中药对双歧杆菌的生长具有促进作用，主要是因为这些中草药中均含有被双歧因子作用的多糖，从而促进双歧杆菌的生长。英荣等在培养基中添加一定浓度的木瓜、括楼、女贞子、郁金等中草药的浸提液，可明显地促进光合细菌的生长，主要是因为这些中草药中含有某些有机酸(苹果酸、酒石酸等)，均能被光合细菌的一种或几种利用，为其提供营养成份。此外，中草药中的有机酸均为弱酸，在培养液中起缓冲作用，加入中草药浸提液，可使培养液pH值相对稳定，有利于光合细菌的生长。科宝中草药生物饲料是以细菌、放线菌、酵母和丝状真菌共4类21种微生物为主，将好氧、厌氧和兼性厌氧菌按一定正交比例组合成的发酵菌体系，辅以中草药(主要成份为血竭)。其理论依据就是利用中草药的活血化疚、益气养血、滋补强壮、增强营养等功能，为益生菌提供良好的生存环境，以利于益生菌更好地发挥作用。

中药发酵技术是现代生物技术发酵工程和传统中药炮制加工和益生菌理论的完美结合，是以生物技术生产中药的一个崭新领域和研究课题。中草药发酵制药具有突出的优势，主要体现在以下几点：一是药物的有效组分及活性物质得到最大限度的提取和利用；二是药物前体进入人体后不能直接被利用的有效活性组分在微生物的降解下而转化成被直接利用的小分子活性物质；三是优选的人体有益菌-益生菌系本身具有成为或增强原有药物的功能；四是中药发酵制药与原有药物相比产生了新的活性物质，从而具有新的保健、预防或治疗功能；五是中药发酵制药能很好地节约药源，有利于资源保护和可持续发展；六是微生物的分解作用有可能将中药中的有毒物质进行分解，从而降低药物的毒副作用；七是该领域是实现中药现代化水平的关键，同时也是研究中药成份在人体肠道内实现生物转化的基础研究领域。

现代医学研究发现三七含有三七总皂苷、黄酮、多糖、三七索等多种有效成份，其中总皂苷为三七中的主要功效成份，其在血液系统、血管系统、神经系统、免疫系统、代谢系统以及抗炎、抗衰老、抗肿瘤等方面都具有生理活性，特别是在心脑血管系统疾病方面的独特作用，为三七作为医疗和保健用品的开发利用提供了重要的科学依据。三七虽然作为开发和使用历史悠久的名贵药材，但由于开发应用程度还较低，因此，三七的研究应用大有可为。尤其是开展三七的综合利用和纵深加工是发展三七产业的必然之路。三七中的主要功效成份并没有得到充分利用，此外三七中还存在潜在的有毒或难以分解的成份，这些给三七主要功能成份提取或人体利用造成极大问题，因此有必要采用微生物方法改善和提高三七中主要成份的提取率，修饰其中主要活性成份，提高其生物利用度。目前国内外并无开展三七的微生物转化及其生物利用度研究的报道。

发明内容

本发明提供一种微生物法转化提高三七中主要功效成份的提取率和生物利用度的方法。

本发明所述的三七为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的根、叶或茎。

一种发酵改善三七主要功效成份的方法，包括：

(1)将芽孢杆菌LB斜面种子培养24小时后转接到LB液体培养基，在37℃、180r/min摇床中培养18～24小时得到培养液；

(2)按每克三七添加0.2～5毫升蒸馏水，将三七与蒸馏水混合，于115℃下灭菌处理15分钟，得到三七转化培养基；

(3)将步骤(1)得到的培养液无菌接入三七转化培养基，在37℃下对三七进行培养转化48～72小时

(4)将转化后的三七置入干燥箱，60℃干燥至恒重，得到经过发酵转化的三七。

所述的芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或纳豆芽孢杆菌。

所述的三七的根、叶或茎使用时要经过粉碎，一般粉碎至40～60目。

步骤(1)中，培养液内菌种细胞的密度为1×10⁸～1×10⁹cfu/ml。

步骤(3)中，培养液与三七转化培养基的用量比为：培养液的毫升数：三七转化培养基中三七的克数＝1∶2～10；优选1∶5。

步骤(3)中，培养转化的时间优选72小时。

经过发酵改善的三七按照常规溶剂提取法取样进行总皂苷的提取与测定，以比较和监测其主要功效成份的变化。

所述的三七总皂苷提取方法为醇提法，主要步骤为：取5g经过发酵改善的三七，选用30～50％的乙醇浓度在提取温度60～80℃和料液比为1∶10～20下提取120～144分钟，收集滤过液。将滤液在水浴上挥至近干，残渣用50ml甲醇分次溶解至所需刻度，并放置过夜，精密吸取上清液50μl于具塞试管中，挥去溶剂，按照改进的分光光度法测定其总皂苷含量变化。

所述的改进分光光度法主要包括：最大吸收波长的选择：精密称取于60℃干燥恒重的三七皂苷R16mg，溶解于5ml甲醇中，摇匀。用微量移液器吸取上述溶液20、40、60、80、100、120、140μl，分置具塞试管中，于60℃水浴中挥去溶剂，加入新配制的5％香草醛～冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，于60℃水浴中加热15min，冰水冷却，加冰醋酸5ml，摇匀，放置15min，在波长400～600nm处测定吸收曲线，甲醇溶液随行空白对照，发现在波长408～410nm处存在溶剂的干扰峰，因此选择500～600进行波谱扫描，结果在540nm处有最大吸收。故选择540nm测定吸光度。以吸收度为纵坐标，三七皂苷R1的含量为横坐标，绘制标准曲线，经统计处理求得回归方程为：y＝0.0055x～0.0269(r＝0.9969)。

本发明采用微生物方法对三七进行生物转化，比转化前三七中主要功效成份含量提高了4～6倍，提取率液提高了将近两倍。

本发明的操作流程简单，微生物细胞培养容易，生物转化易于控制，微生物转化对中药材主要功效成份的提取具有较大提高作用，本发明的研究思路和结果为开发利用中药材功能成份提供借鉴，为传统中药材的深度开发和利用提供更好的方法和平台。

附图说明

图1为本发明方法的流程示意图；

具体实施方式：

实施例1  不同菌种对三七叶的转化效果试验

参见附图1的流程，采用地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌为菌种分别对三七的叶进行转化，对和转化后的三七叶进行总皂苷含量测定和提取，条件及结果如下：

各菌种分别在LB培养基中斜面保存，37℃活化24小时，再接种到液体种子培养基上。液体种子培养基为LB，无琼脂，pH7，液体种子培养在250毫升的摇瓶装液为25～30毫升，发酵温度37℃，摇床转速为180～200r/min，培养12～24小时得到培养液。

三七叶粉碎按每克三七添加2毫升蒸馏水后于115℃下灭菌处理15分钟，得到三七转化培养基；按每克三七转化培养基接入0.2毫升培养液，将培养液无菌接入三七转化培养，在37℃下对三七进行培养转化72小时。

对转化后的三七进行总皂苷提取和含量测定，结果见表1，

表1不同菌种转化对三七叶总皂苷含量、提取率的影响及其比较

微生物菌株	干皂得率％	总皂苷含量(mg/ml)	总皂苷提取率％(mg/100g三七叶)
				地衣芽孢杆菌	45	13	9.8
枯草芽孢杆菌	49	19	11.4
				纳豆芽孢杆菌	51	15	8.2
对照	35	3	7

表1中的对照组为未经转化的三七叶，可见通过生物发酵转化可以明显提高三七叶总皂苷的含量，其中以枯草芽孢杆菌的转化能力最为显著，总皂苷含量达到19毫克/毫升。与对照组相比，通过生物发酵转化后三七中总皂苷含量提高4～6倍，而总皂苷提取率也明显高于对照组。

实施例2不同菌种对三七根的转化效果试验

按照实施例1方法，以三七的根为转化对象，进行转化，对转化后的三七叶进行总皂苷含量测定和提取，结果见表2，

表2不同菌种转化对三七根总皂苷含量、提取率的影响及其比较

微生物菌株	干皂得率％	总皂苷含量(mg/ml)	总皂苷提取率％(mg/100g三七叶)
				地衣芽孢杆菌	35	6.9	7.8

枯草芽孢杆菌	32	4.5	5.9
				纳豆芽孢杆菌	29	5.1	6.2
对照	26	1.6	3.6

表2中的对照组为未经转化的三七根，可见通过生物发酵转化可以明显提高三七根总皂苷的含量，其中以地衣芽孢杆菌的转化能力最为显著，总皂苷含量达到5.9毫克/毫升。与对照组相比，三种微生物72小时转化后总皂苷含量提高3～4倍，而总皂苷提取率也明显高于对照组，比较实施例1不难发现，无论是否转化三七根中的总皂苷含量要显著低于三七叶。

实施例3不同转化时间对三七叶的转化效果试验

按照实施例1方法，只采用枯草芽孢杆菌为菌种，以三七的叶为转化对象，进行转化，对转化不同时间后的三七叶进行总皂苷含量测定和提取，结果见表3，

表3不同转化时间对三七叶总皂苷含量、提取率的影响

转化时间(小时)	干皂得率％	总皂苷含量(mg/ml)	总皂苷提取率％(mg/100g三七叶)
				48	21	10.5	5.8
72	49	18.6	11.4
				96	51	19.1	12.1
120	46	19.6	13.2

表3中的比较分析发现采用不同转化时间可以明显影响三七根总皂苷的含量，其中以72小时转化对总皂苷含量、总皂苷提取率的提高影响最为显著，而72小时后变化不是很大。

实施例4不同接种比例对三七叶的转化效果试验

按照实施例1的方法培养获得细胞，采用枯草芽孢杆菌为催化的微生物，以三七叶为转化对象，按照不同接种比例将培养液接入三七转化培养基中进行转化，对转化后的三七叶进行总皂苷含量测定和提取，结果见表4，

表4不同接种比例对三七叶总皂苷含量、提取率的影响

培养液体积(毫升)：三七叶重量(克)	干皂得率％	总皂苷含量(mg/ml)	总皂苷提取率％(mg/100g三七叶)
				1∶2	42.1	16.1	9.2
1∶4	49.6	17.6	10.4
				1∶5	54.2	21.4	13.1
1∶8	51	18.8	13.9
				1∶10	45.7	18.1	13.2

每毫升培养液中含有菌种细胞1×10⁸cfu

表4中可以看出采用1∶5的接种比例对于三七叶的转化极为有效，其中总皂苷含量和干皂得率要显著好于其它组，总皂苷提取率也是1∶5的的接种比例时升高更快速，因此选取1∶5接种比例进行转化更有利于三七叶中总皂苷的提取和含量提高。

Claims (8)

1、一种发酵改善三七主要功效成份的方法，其特征在于，包括：

(1)将芽孢杆菌LB斜面种子培养24小时后转接到LB液体培养基，在37℃、180r/min摇床中培养18～24小时得到培养液；

(2)按每克三七添加0.2～5毫升蒸馏水，将三七与蒸馏水混合，于115℃下灭菌处理15分钟，得到三七转化培养基；

(3)将步骤(1)得到的培养液无菌接入三七转化培养基，在37℃下对三七进行培养转化48～72小时；

(4)将转化后的三七置入干燥箱，60℃干燥至恒重，得到经过发酵改善的三七。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或纳豆芽孢杆菌。

3、如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的三七为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的根、叶或茎。

4、如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的三七的根、叶或茎使用前经过粉碎至40～60目。

5、如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，培养液内菌种细胞的密度为1×10⁸～1×10⁹cfu/ml。

6、如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，培养液与三七转化培养基的用量比为：培养液的毫升数∶三七转化培养基中三七的克数＝1∶2～10。

7、如权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，培养液与三七转化培养基的用量比为：培养液的毫升数∶三七转化培养基中三七的克数＝1∶5。

8、如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，培养转化的时间为72小时。