CN102676627B - 三七总皂苷的微生物发酵提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三七总皂苷的微生物发酵提取方法，包括以下步骤：1）微生物固态发酵：将三七根粉与麸皮按1.5~4:1的重量比混合后作为发酵基质，在灭菌后发酵基质中加入灭菌后磷酸盐缓冲溶液，得发酵底物；在发酵底物中加入枯草芽孢杆菌的菌液，培养，得发酵曲；2）三七总皂苷的提取：将发酵曲用乙醇溶液回流提取，所得的残渣重复用乙醇溶液回流提取；合并两次回流提取所得的上清，得三七总皂苷提取液。本发明的三七总皂苷的微生物发酵提取方法，具有反应条件温和、提取效率高、能增加稀有皂苷成分提取量的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种三七总皂苷的微生物发酵提取法。
背景技术
三七是五加科人参属植物，拉丁学名为Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen，具有散瘀止血、消肿定痛之功效，是传统的名贵中药材。三七根中主要的有效成分是达玛烷型人参皂苷 Rb1 、Rg1、Rd、Re 和三七特有皂苷R1，以及少量的人参皂苷Rg2 、Rh1等20多种皂苷成分。现代药理学研究发现，三七总皂苷和其中的部分单体皂苷在血液、心脑血管及神经系统、物质代谢、抗炎、抗氧化及抗肿瘤等方面均有较好的活性。
大量研究表明，人参皂苷经口服后，在体内逐级代谢为次级苷，最后代谢为苷元，这些次级苷和苷元由于脱去糖基，极性减小，脂溶性增加，作为稀有皂苷才是在体内真正发挥药理作用的物质。而人参皂苷抗肿瘤活性的构效关系研究也表明：低糖链的皂苷及苷元具有较强的抗肿瘤作用。因此探究有效的方法从植物中提取出活性成分，并研究合适的方法实现稀有人参皂苷的生物转化具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种反应条件温和、提取效率高、能增加稀有皂苷成分提取量的三七总皂苷的微生物发酵提取方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种三七总皂苷的微生物发酵提取方法，包括以下步骤：
1）、微生物固态发酵：
将三七根粉与作为营养辅料的麸皮按1.5~4:1的重量比混合后作为发酵基质，将发酵基质进行灭菌，得灭菌后发酵基质；
将pH=7~8、且浓度为0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液进行灭菌，得灭菌后磷酸盐缓冲溶液；
按照每g发酵基质配用1~1.4ml的pH=7~8、且浓度为0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液的比例；在灭菌后发酵基质中加入灭菌后磷酸盐缓冲溶液，得发酵底物；
然后在无菌条件下进行以下操作：
按照每g发酵基质配用0.1~0.2 mL枯草芽孢杆菌的菌液的接种量，在发酵底物中加入枯草芽孢杆菌的菌液，搅拌均匀后，于34.8~35.2℃培养90~100h（最佳为35℃培养96h），得发酵曲；
2）、三七总皂苷的提取：
将发酵曲用体积浓度为68~72%的乙醇溶液回流提取，乙醇溶液与步骤1）中的发酵基质的用量比为：7.5~8.5ml（最佳为8ml）的乙醇溶液/g发酵基质；回流提取时间为1.2~1.8h（最佳为1.5h）；回流提取结束后，离心，分别得首次上清和残渣；
将残渣用体积浓度为68~72%的乙醇溶液回流提取，乙醇溶液与步骤1）中的发酵基质的用量比为：4.5~5.5ml（最佳为5ml）的乙醇溶液/g发酵基质；回流提取时间为1.2~1.8h（最佳为1.5h）；回流提取结束后，离心，得二次上清；
合并首次上清和二次上清，得三七总皂苷提取液。
作为本发明的三七总皂苷的微生物发酵提取方法的改进：三七根粉为三七根粉碎至能过40目筛。三七根为市售的已经经过常规干燥处理后的三七根，亦称为三七根生药，其含水率≤7%。
作为本发明的三七总皂苷的微生物发酵提取方法的进一步改进：枯草芽孢杆菌的菌液的制备方法为包括如下步骤：
①、将1 g豆粕渣与pH=7~8（最佳为 pH=7.5）、且浓度为0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液28~32mL（最佳为30mL）混合，得液体种子发酵培养基，灭菌，得灭菌后液体种子发酵培养基；
②、在无菌条件下，在步骤①所得的灭菌后液体种子发酵培养基中接种1~2环的枯草芽孢杆菌，于140~160rpm、36.8~37.2℃的条件下培养22~26 h（最佳培养条件为：于150rpm、37℃的条件下培养24 h）；得枯草芽孢杆菌的菌液（即，枯草芽孢杆菌菌的悬液）。
经检测，每ml该枯草芽孢杆菌的菌液中约含有107个的枯草芽孢杆菌细胞。
作为本发明的三七总皂苷的微生物发酵提取方法的进一步改进：步骤1）中：
将三七根粉与作为营养辅料的麸皮按7:3的重量比混合；
按照每g发酵基质配用1.2ml的pH=7.5、且浓度为0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液的比例；在灭菌后发酵基质中加入灭菌后磷酸盐缓冲溶液，得发酵底物；
按照每g发酵基质配用0.15 mL枯草芽孢杆菌的菌液的接种量，在发酵底物中加入枯草芽孢杆菌的菌液。
备注说明：本发明中所述的灭菌均为常规的灭菌方式，即于120~122℃灭菌18~22min。
在本发明中，乙醇溶液的最佳体积浓度为70%。
在本发明中，枯草芽孢杆菌例如可购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）的菌株保藏编号为20627的枯草芽孢杆菌（属名：Bacillus，种名加词：subtilis）
发明人在发明过程中发现：三七根的组织细胞壁由纤维素及果胶等物质构成，此外，还含有大量淀粉，而微生物能利用这些大分子物质为碳源生长，产生出丰富酶系，在纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等的协同作用下，破坏植物组织细胞壁的致密结构，使三七皂苷溶出增加，在有效成分暴露后，糖苷酶进一步水解皂苷配基上的糖链，达到生物转化的效果，反应条件温和。应用微生物发酵法提取三七皂苷既能使有效成分溶出增加，同时又能转化生成活性更高的稀有皂苷，相比单纯提取具有附加的价值，且目前未见应用微生物发酵法提取三七总皂苷的相关报道。
本发明采用微生物固体发酵辅助提取三七总皂苷。该方法在常规醇提工艺的基础上，增加了发酵处理步骤，通过微生物产生丰富酶系协同作用，破坏三七根组织细胞壁致密结构，使三七皂苷溶出增加，在有效成分暴露后，糖苷酶进一步水解皂苷配基上的糖链，达到生物转化的效果，反应条件温和。利用微生物发酵法提取三七总皂苷，既能提高有效成分的提取率，同时还能转化生成活性更高的稀有皂苷，相比常规乙醇回流提取具有附加价值。
具体实施方式
实施例1、一种三七总皂苷的微生物发酵提取方法，依次进行以下步骤：
1）、微生物固态发酵：
依次进行以下步骤：
①、制备枯草芽孢杆菌的菌液（即菌悬液）：
将1 g豆粕渣与30mL磷酸盐缓冲液（pH=7.5，C=0.05mol/L）混合，得液体种子发酵培养基，灭菌（121℃灭菌20min）后，得灭菌后液体种子发酵培养基；
无菌操作下接种1环的枯草芽孢杆菌入上述灭菌后液体种子发酵培养基中，于150rpm、37℃的条件下培养24 h后，得枯草芽孢杆菌的菌液。
每ml该枯草芽孢杆菌的菌液中约含有107个的枯草芽孢杆菌细胞。
②、将干燥（含水率≤7%）的三七根（作为三七生药材）粉碎成能过40目筛的三七根粉，取3g三七根粉和2g麸皮（作为营养辅料，含水率≤7%）混匀后作为发酵基质，将发酵基质于121℃灭菌20min；
将5mL的 pH=7.0磷酸盐缓冲液（C=0.2mol/mL）于121℃灭菌20min，得已灭菌的pH=7.0磷酸盐缓冲液（C=0.2mol/mL）
然后无菌条件下进行以下操作：
在灭菌后发酵基质中加入已灭菌的pH=7.0磷酸盐缓冲液（C=0.2mol/mL），即，控制料液比为1:1；得发酵底物；该发酵底物的初始pH为7.0。
在发酵底物中按无菌操作接种0.75ml枯草芽孢杆菌的菌液，搅拌均匀后，于35℃培养96h，得发酵曲。
2）、三七总皂苷的提取：
在步骤1）所得的全部的发酵曲中加入40mL体积浓度为70%的乙醇溶液回流提取，回流提取的温度约为80℃，回流提取时间为1.5h。回流提取结束后，离心（3000转/分，10分钟），分别得首次上清和残渣。
在残渣中中加入25mL体积浓度为70%的乙醇溶液回流提取，回流提取的温度约为80℃，回流提取时间为1.5h。回流提取结束后，离心（3000转/分，10分钟），得二次上清。
合并首次上清和二次上清，得约60ml的上清作为三七总皂苷提取物；为了便于测量相应的成分含量的数据，在上述三七总皂苷提取物中加入体积浓度为70%的乙醇溶液定容至100mL，得待测三七总皂苷提取物。
上述待测三七总皂苷提取物经分光光度法（《中国药典》 2005 年版一部附录 V）及高效液相色谱法（Aik-Jiang Lau, Bee-HongSeo et al. High-performance liquid chromatographic method with quantitative comparisons of whole chromatograms of raw and steamed Panax notoginseng[J].Journal ofChromatography A,2004:141-149.）测定：提取所得三七总皂苷含量为10.33%（即，每g三七根粉含有相当10.33% g的三七总皂苷），其中稀有人参皂苷组分Rh1、F1、Rg3含量分别为6.32mg/g（即，每g三七根粉中含有相当Rh1的质量为6.32mg）、2.54mg/g、3.26mg/g。
实施例2、一种三七总皂苷的微生物发酵提取方法，依次进行以下步骤：
1）、微生物固态发酵：
依次进行以下步骤：
①、制备枯草芽孢杆菌的菌液：同实施例1。
②、将干燥（含水率≤7%）的三七根粉碎成能过40目筛的三七根粉，取3.5g三七根粉和1.5g麸皮（作为营养辅料，含水率≤7%）混匀后作为发酵基质，将发酵基质于121℃灭菌20min。
然后无菌条件下进行以下操作：
在灭菌后发酵基质中加入6mL已灭菌的pH=7.5磷酸盐缓冲液（C=0.2mol/mL），即，控制料液比为1:1.2；得发酵底物；该发酵底物的初始pH为7.5。
在发酵底物中按无菌操作接种0.75ml的枯草芽孢杆菌的菌液，搅拌均匀后，于35℃培养96h，得发酵曲。
2）、三七总皂苷的提取：
同实施例1。
同理，在所得的三七总皂苷提取物中加入体积浓度为70%的乙醇溶液定容至100mL，得待测三七总皂苷提取物。
经测定上述待测三七总皂苷提取物中三七总皂苷含量为12.25% ，其中稀有人参皂苷组分Rh1、F1、Rg3含量分别为7.52mg/g、3.00mg/g、3.91mg/g。
实施例3、一种三七总皂苷的微生物发酵提取方法，依次进行以下步骤：
1）、微生物固态发酵：
依次进行以下步骤：
①、制备枯草芽孢杆菌的菌液：同实施例1。
②、将干燥（含水率≤7%）的三七根粉碎成能过40目筛的三七根粉，取4g三七根粉和1g麸皮（作为营养辅料，含水率≤7%）混匀后作为发酵基质，将发酵基质于121℃灭菌20min；然后无菌条件下进行以下操作：
在灭菌后发酵基质中加入6mL已灭菌的pH=8.0磷酸盐缓冲液（C=0.2mol/mL），即，控制料液比为1:1.2；得发酵底物；该发酵底物的初始pH为8.0。
在发酵底物中按无菌操作接种0.75ml的枯草芽孢杆菌的菌液，搅拌均匀后，于35℃培养96h，得发酵曲。
2）、三七总皂苷的提取：
同实施例1。
同理，在所得的三七总皂苷提取物中加入体积浓度为70%的乙醇溶液定容至100mL，得待测三七总皂苷提取物。
经测定上述待测三七总皂苷提取物中三七总皂苷含量为10.24% ，其中稀有人参皂苷组分Rh1、F1、Rg3含量分别为6.27mg/g、2.44mg/g、3.32mg/g。
对比实验：为证明按照本发明方法提取的优越所在，发明人还进行了如下的对比实验：
对比实验1-1、相对于实施例1作如下更改：
取消步骤1）；
在步骤2）中：以5g三七根粉末（过40目筛）替代发酵曲，其余同实施例1。
同理，在所得的三七总皂苷提取物中加入体积浓度为70%的乙醇溶液定容至100mL，得待测三七总皂苷提取物。
经测定上述待测三七总皂苷提取物中三七总皂苷含量为9.05% ，其中稀有人参皂苷组分Rh1、Rg3含量分别为2.07mg/g、0.85mg/g，F1未检测到。
对比实验1-2、相对于实施例1作如下更改：
取消步骤1）；
在步骤2）中：以3 g三七根粉末（过40目筛）+2g麸皮替代发酵曲，其余同实施例1。
同理，在所得的三七总皂苷提取物中加入体积浓度为70%的乙醇溶液定容至100mL，得待测三七总皂苷提取物。
经测定上述待测三七总皂苷提取物中三七总皂苷含量为9.12% ，其中稀有人参皂苷组分Rh1、Rg3含量分别为2.25mg/g、0.91mg/g，F1 未检测到。
对比实验1-3、相对于实施例1作如下更改：
取消步骤1）；
在步骤2）中：以3.5 g三七根粉末（过40目筛）+1.5g麸皮替代发酵曲，其余同实施例1。
同理，在所得的三七总皂苷提取物中加入体积浓度为70%的乙醇溶液定容至100mL，得待测三七总皂苷提取物。
经测定上述待测三七总皂苷提取物中三七总皂苷含量为8.94% ，其中稀有人参皂苷组分Rh1、Rg3含量分别为2.05mg/g、0.87mg/g，F1未检测到。
对比实验1-4、相对于实施例1作如下更改：
取消步骤1）；
在步骤2）中：以4g三七根粉末（过40目筛）+1g麸皮替代发酵曲，其余同实施例1。
同理，在所得的三七总皂苷提取物中加入体积浓度为70%的乙醇溶液定容至100mL，得待测三七总皂苷提取物。
经测定上述待测三七总皂苷提取物中三七总皂苷含量为8.67% ，其中稀有人参皂苷组分Rh1、Rg3含量分别为2.29mg/g、0.88mg/g，F1未检测到。
对比实验2-1、相对于实施例2作如下更改：
将步骤1）中的接种量改成10%（即，接种0.5ml的枯草芽孢杆菌的菌液），其余同实施例2。
同理，在所得的三七总皂苷提取物中加入体积浓度为70%的乙醇溶液定容至100mL，得待测三七总皂苷提取物。
经测定上述待测三七总皂苷提取物中三七总皂苷含量为10.11% ，其中稀有人参皂苷组分Rh1、Rg3含量分别为6.28mg/g、3.85mg/g，F1为2.87mg/g。
对比实验2-2、相对于实施例2作如下更改：
将步骤1）中的接种量改成20%（即，接种1.0ml的枯草芽孢杆菌的菌液），其余同实施例2。
同理，在所得的三七总皂苷提取物中加入体积浓度为70%的乙醇溶液定容至100mL，得待测三七总皂苷提取物。
经测定上述待测三七总皂苷提取物中三七总皂苷含量为9.94% ，其中稀有人参皂苷组分Rh1、Rg3含量分别为6.18mg/g、3.79mg/g，F1 为2.97mg/g。
从上述实施例和对比例可看出，经本发明的微生物发酵处理可以提高所得三七总皂苷的含量，实现稀有人参皂苷的生物转化。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1.三七总皂苷的微生物发酵提取方法，其特征是包括以下步骤：
1）、微生物固态发酵：
将三七根粉与作为营养辅料的麸皮按1.5～4:1的重量比混合后作为发酵基质，将发酵基质进行灭菌，得灭菌后发酵基质；
将pH=7～8、且浓度为0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液进行灭菌，得灭菌后磷酸盐缓冲溶液；
按照每g发酵基质配用1～1.4ml的pH=7～8、且浓度为0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液的比例；在灭菌后发酵基质中加入灭菌后磷酸盐缓冲溶液，得发酵底物；
然后在无菌条件下进行以下操作：
按照每g发酵基质配用0.1～0.2mL枯草芽孢杆菌的菌液的接种量，在发酵底物中加入枯草芽孢杆菌的菌液，搅拌均匀后，于34.8～35.2℃培养90～100h，得发酵曲；
所述枯草芽孢杆菌的菌液的制备方法为包括如下步骤：
①、将1g豆粕渣与pH=7～8、且浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液28～32mL混合，得液体种子发酵培养基，灭菌，得灭菌后液体种子发酵培养基；
②、在无菌条件下，在步骤①所得的灭菌后液体种子发酵培养基中接种1～2环的枯草芽孢杆菌，于140～160rpm、36.8～37.2℃的条件下培养22～26h；得枯草芽孢杆菌的菌液；
2）、三七总皂苷的提取：
将发酵曲用体积浓度为68～72%的乙醇溶液回流提取，所述乙醇溶液与步骤1）中的发酵基质的用量比为：7.5～8.5ml的乙醇溶液/g发酵基质；回流提取时间为1.2～1.8h；回流提取结束后，离心，分别得首次上清和残渣；
将残渣用体积浓度为68～72%的乙醇溶液回流提取，所述乙醇溶液与步骤1）中的发酵基质的用量比为：4.5～5.5ml的乙醇溶液/g发酵基质；回流提取时间为1.2～1.8h；回流提取结束后，离心，得二次上清；
合并首次上清和二次上清，得三七总皂苷提取液。
2.根据权利要求1所述的三七总皂苷的微生物发酵提取方法，其特征是：所述三七根粉为三七根粉碎至能过40目筛。
3.根据权利要求2所述的三七总皂苷的微生物发酵提取方法，其特征是：
所述步骤1）中：
将三七根粉与作为营养辅料的麸皮按7:3的重量比混合；
按照每g发酵基质配用1.2ml的pH=7.5、且浓度为0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液的比例；在灭菌后发酵基质中加入灭菌后磷酸盐缓冲溶液，得发酵底物；
按照每g发酵基质配用0.15mL枯草芽孢杆菌的菌液的接种量，在发酵底物中加入枯草芽孢杆菌的菌液。
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