CN105255984A

CN105255984A - 一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法

Info

Publication number: CN105255984A
Application number: CN201510848529.3A
Authority: CN
Inventors: 尹成日; 陈贺; 尹振浩; 宋晓琳; 金英今
Original assignee: Yanbian University
Current assignee: Yanbian University
Priority date: 2015-11-30
Filing date: 2015-11-30
Publication date: 2016-01-20

Abstract

本发明公开了一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法，包括以下步骤：将干人参研磨成粉末，低温灭菌，然后冷却至室温；将经灭菌的人参粉末与植物复合酶混匀，用无菌LL液体培养基和蒸馏水调节水分，充分混匀后密封，置于恒温培养箱中发酵得到人参发酵产物；用80%甲醇水溶液超声提取，过滤，滤液减压浓缩，得人参皂苷粗提物；加入去离子水溶解后，用饱和正丁醇溶液萃取，减压浓缩，得到人参皂苷提取物，其中含有低糖链稀有人参皂苷或无糖链的抗肿瘤活性物质原人参二醇（PPD）。本发明工艺简单，操作方便，产品干燥容易，最重要的是在固体发酵的过程中实现人参皂苷的转化，得到稀有人参皂苷或抗肿瘤活性物质原人参二醇（PPD）。

Description

一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法

技术领域

本发明属于天然产物生物转化领域，具体涉及一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法。

背景技术

人参为五加科人参属植物（PanaxginsengC.A.Mayer），由于其根部肥大，带有分叉，形态长得像人，故称为人参。人参的干燥根和根茎，具有补脾益肺、除邪、大补元气、安精神、止惊悸和明目益智等功效，享有"中药之王"的美称，是闻名遐迩的"东北三宝"之一。我国历史上第一部药学典籍-《神农本草经》上将人参称为"主养命以应天，无毒，多服久服不伤人，欲轻身益气不老延年"的"君"药上品之一。人参在我国主要分布于辽宁省、吉林省和黑龙江地区，吉林省的长白山地区是作为我国人参的主产区，其产量占全国人参产量的85%，世界人参产量的70%。人参皂苷作为人参的主要活性成分，约占人参总质量的4%，是一种固醇类化合物，属于三萜皂苷。根据苷元结构的不同，分为齐墩果酸型（如如Ro等），人参二醇型（如Rb1、Rb2、Rg3、Rd、Rh2），人参三醇型（如Re、Rg1、Rh1），其中Rg3、Rh2等存在于野山参和红参中，并且含量极低，因此称为稀有人参皂苷。人参中人参二醇型皂苷占总皂苷的45-60%，人参三醇型皂苷占人参皂苷总量的12-20%，齐墩果酸型皂苷占人参皂苷总量7-10%。现代药理研究发现，皂苷的抗肿瘤活性与皂苷分子侧链糖基的结合位置和数量有关，并且抗肿瘤活性随着糖基数量的减少而增加。因此，在人参皂苷中低糖链或无糖链的稀有人参皂苷如Rg3（2个糖基）、Rh2（1个糖基）、C-K（1个糖基）和PPD（无糖基）等具有很强的抗肿瘤活性。

目前，制备稀有人参皂苷的方法有化学法和生物转化法。化学法如酸水解、碱水解和Smith降解法等，虽然操作简单，但专一性差，难以得到某种特定结构的单体皂苷，并且收率很低，同时造成环境污染，不适宜工业化生产。生物转化法是利用生物体内产生的酶的降解作用来，选择性地水解皂苷分子C-20位和C-3位上的侧链糖基转化为稀有人参皂苷，具有高专一性、高效性和无污染等特点，成为近年来研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法，工艺简单，操作方便，产品干燥容易，最重要的是在固体发酵的过程中实现人参皂苷的转化，得到稀有人参皂苷或抗肿瘤活性物质原人参二醇（PPD）。

本发明的目的通过采用以下技术方案实现：

一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法，包括以下步骤：

a、将干人参研磨成粉末，低温灭菌，然后冷却至室温；

b、将经灭菌的人参粉末与植物复合酶混匀，植物复合酶添加量为10-70%，用无菌LL液体培养基和蒸馏水调节水分，充分混匀后密封，置于恒温培养箱中发酵得到人参发酵产物；

c、将人参发酵产物用80%甲醇水溶液超声提取，过滤，滤液减压浓缩，得人参皂苷粗提物；

d、在人参皂苷粗提物加入去离子水溶解后，用饱和正丁醇溶液萃取，减压浓缩，得到人参皂苷提取物，其中含有低糖链稀有人参皂苷或无糖链的抗肿瘤活性物质原人参二醇（PPD）。

进一步地，所述的植物复合酶来自于蔬果、海藻类或谷类植物，其复合酶成分包含淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶中的两种以上酶类。

进一步地，所述的a步骤中人参粉末灭菌温度为50-90℃。

进一步地，所述的b步骤中固体发酵体系的水分为50-80%，发酵时间为5-25h，发酵温度为20-70℃。

进一步地，所述的b步骤中无菌LL液体培养基由0.5gNH₄Cl，1.0gK₂HPO₄，0.5gKH₂PO₄，0.25gMgSO₄和1.0g酵母粉，水1000ml，pH值7.0构成。

进一步地，所述的c步骤中在人参发酵产物中，加入80%甲醇水溶液50-200mL，在50℃超声提取10-50min。

进一步地，所述发酵过程中，植物复合酶水解多糖链人参主皂苷的C-3和C-20位的糖基，生成低糖链稀有人参皂苷或无糖链的抗肿瘤活性物质原人参二醇（PPD）。

本发明人参皂苷的固体发酵是将人参等中药材作为营养基质，通过微生物或酶的生化反应过程对人参皂苷进行结构修饰，产生新的生物活性成分。该方法工艺简单，操作方便，产品干燥容易，成本低廉，适宜于工业化生产。特别是在固体发酵的过程中实现人参皂苷的转化，产生稀有人参皂苷或抗肿瘤活性物质原人参二醇（PPD）。

附图说明

图1为本发明实验人参皂苷提取物中稀有人参皂苷PPD标准曲线，图中X轴表示峰面积，Y轴表原人参二醇PPD的浓度，单位为mg/mL。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，下面通过具体的实施例进一步做详细描述。这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。

实施例1

配置LL液体培养基（0.5gNH₄Cl，1.0gK₂HPO₄，0.5gKH₂PO₄，0.25gMgSO₄和1.0g酵母粉，水1000ml，pH值7.0），121℃灭菌15min，冷却至室温；人参研磨成粉末，低温灭菌，灭菌温度为50-90℃，然后冷却至室温；将4.8g灭菌后的人参粉末与1.2g植物复合酶混匀；加入LL液体培养基和蒸馏水调节水分，固体发酵体系的水分为50-80%；充分混匀后密封，置于30℃恒温培养箱中发酵7d得到人参发酵产物；发酵产物用80%甲醇水溶液50-200mL，在50℃超声提取10-50min超声提取，过滤，滤液减压浓缩得人参皂苷粗取物；在人参皂苷粗取物加入去离子水溶解后，用饱和正丁醇溶液萃取，减压浓缩，得到人参皂苷提取物。经HPLC分析结果，人参发酵物中人参皂苷Rg1含量为3.53mg/g，Re含量为3.16mg/g，Rb1含量为8.49mg/g，Rc含量为3.35mg/g，Rb2含量为2.32mg/g，Rd含量为1.63mg/g，PPD含量为7.01mg/g。

实施例2

配置LL液体培养基（0.5gNH₄Cl，1.0gK₂HPO₄，0.5gKH₂PO₄，0.25gMgSO₄和1.0g酵母粉，水1000ml，pH值7.0），121℃灭菌15min，冷却至室温；人参研磨成粉末，低温灭菌，灭菌温度为50-90℃，然后冷却至室温；将4.8g灭菌后的人参粉末与1.2g植物复合酶混匀；加入LL液体培养基和蒸馏水调节水分，固体发酵体系的水分为50-80%；；充分混匀后密封，置于40℃恒温培养箱中发酵8d得到人参发酵产物；发酵产物用80%甲醇水溶液50-200mL，在50℃超声提取10-50min超声提取，过滤，滤液减压浓缩；加入去离子水溶解后，用饱和正丁醇溶液萃取，减压浓缩，得到固体发酵后的人参皂苷提取物。经HPLC分析结果，人参发酵物中人参皂苷Rg1含量为3.02mg/g，Re含量为2.98mg/g，Rb1含量为7.32mg/g，Rc含量为4.45mg/g，Rb2含量为4.65mg/g，Rd含量为1.07mg/g，PPD含量为6.84mg/g。

实施例3

配置LL液体培养基（0.5gNH₄Cl，1.0gK₂HPO₄，0.5gKH₂PO₄，0.25gMgSO₄和1.0g酵母粉，水1000ml，pH值7.0），121℃灭菌15min，冷却至室温；人参研磨成粉末，低温灭菌，灭菌温度为50-90℃，然后冷却至室温；将3.6g灭菌后的人参粉末与2.4g植物复合酶混匀；加入LL液体培养基和蒸馏水调节水分，固体发酵体系的水分为50-80%；充分混匀后密封，置于50℃恒温培养箱中发酵9d得到人参发酵产物；发酵产物用80%甲醇水溶液50-200mL，在50℃超声提取10-50min超声提取，过滤，滤液减压浓缩；加入去离子水溶解后，用饱和正丁醇溶液萃取，减压浓缩，得到固体发酵后的人参皂苷提取物。经HPLC分析结果，人参发酵物中人参皂苷Rg1含量为2.74mg/g，Re含量为2.55mg/g，Rb1含量为7.20mg/g，Rc含量为4.20mg/g，Rb2含量为4.06mg/g，Rd含量为1.37mg/g，PPD含量为6.69mg/g。

在实施例1、2、3中，所述的植物复合酶来自于蔬果、海藻类或谷类植物，其复合酶成分包含淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶中的两种（含两种）以上酶类。本发明所采用的植物复合酶可以市售直接获得，如北京盛世嘉明科技开发有限公司供应的植物复合酶。也可以分别购得再配制成植物复合酶，如淀粉酶购自延边康德生物技术有限公司、蛋白酶购自陕西昊辰生物科技有限公司、纤维素酶购自山东奥迪尔生物工程有限公司。

在实施例1、2、3的实施过程中，调节固体发酵条件可以得到不同比例人参皂苷的人参发酵产物，并且得到抗肿瘤活性物质原人参二醇（PPD），其含量达到7.73mg/g。

测试实施例

准确称取一定量人参，分别按照实施例1-3提供的方法提取人参皂苷，同时将未发酵的人参作为对照组提取人参皂苷，利用高效液相色谱（HPLC）测定人参皂苷含量。高效液相色谱法测定人参皂苷的具体步骤为：

a、精密准确称取人参皂苷标准品，色谱级甲醇溶解，利用峰面积绘制标准曲线，如图1所示，x：峰面积；y：浓度(mg/ml)；

b、色谱条件为：流动相：水(A)-乙腈(B)，洗脱梯度如表1所示；流速：1mL/min；检测波长：203nm；柱温：30℃；进样体积：10μL。

表1为高效液相色谱流动相梯度表：

。

Claims

1.一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法，包括以下步骤：

a、将干人参研磨成粉末，低温灭菌，然后冷却至室温；

2.根据权利要求1所述的一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法，其特征在于所述的植物复合酶来自于蔬果、海藻类或谷类植物，其复合酶成分包含淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶中的两种以上酶类。

3.根据权利要求1所述的一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法，其特征在于所述的a步骤中人参粉末灭菌温度为50-90℃。

4.根据权利要求1所述的一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法，其特征在于所述的b步骤中固体发酵体系的水分为50-80%，发酵时间为5-25h，发酵温度为20-70℃。

5.根据权利要求1所述的一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法，其特征在于所述的b步骤中无菌LL液体培养基由0.5gNH₄Cl，1.0gK₂HPO₄，0.5gKH₂PO₄，0.25gMgSO₄和1.0g酵母粉，水1000ml，pH值7.0构成。

6.根据权利要求1所述的一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法，其特征在于所述的c步骤中在人参发酵产物中，加入80%甲醇水溶液50-200mL，在50℃超声提取10-50min。

7.根据权利要求1所述的一种利用植物复合酶转化人参皂苷的方法，其特征在于所述发酵过程中，植物复合酶水解多糖链人参主皂苷的C-3和C-20位的糖基，生成低糖链稀有人参皂苷或无糖链的抗肿瘤活性物质原人参二醇（PPD）。