CN101824059A - 一种低糖链高活性的新茶皂甙及其生物转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种低糖链高活性茶皂甙及其生物转化的方法，属于发酵与生物转化领域。通过对黑曲霉sp.48s菌产生的粗酶液进行分离纯化，采用正交试验设计，在最佳条件下酶解经树脂处理过的茶皂甙，采用薄层层析板和硅胶柱分离酶解后茶皂甙，采用HPLC-MS/MS方法对酶解前后的茶皂甙进行分析，确定酶解后有新皂甙产生。并将酶解前后的茶皂甙进行活性试验对比，性状得到明显改善，活性增高。
Description
技术领域
本发明属于发酵与生物转化领域，具体涉及一种生物转化油茶皂甙，并生产出新结构茶皂甙的方法。
背景技术
茶皂甙是从山茶科植物中提取的一种五环三萜类糖苷化合物，广泛存在于各种茶类植物中，随着现代分离分析技术的发展，人们对茶皂甙的结构进行了深入的研究。茶皂甙由于其特殊的化学结构，在乳化、分散、湿润、发泡、稳泡、去污等方面具有良好的活性，是一种性能优良的天然表面活性剂：广泛用于食品添加剂、杀菌剂。茶皂甙生物活性表现在抗菌、抗炎、溶血作用、鱼毒作用、抗溃疡、抗氧化、降血脂等多方面。
目前，人们对茶皂甙的研究主要集中在皂甙的组织分布和生理活性方面，对皂甙的分离提取工艺亦有所研究。但通过改变结构来提高茶皂甙的生物活性研究报道尚不多见。而且对茶皂甙的水解多采用酸、碱法，条件剧烈且污染严重。采用酶法水解茶皂甙，得到低糖链高活性的茶皂甙，将会大大提高茶皂甙的生物活性和药用价值。生物法条件温和、产物易于控制、降低污染排放，是一种绿色制造新工艺。尤其是采用生物转化法酶解茶皂甙，并研究酶解前后茶皂甙的结构以及生物活性变化还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种油茶皂甙的生物转化并生产出新结构茶皂甙的方法。
本发明提供的低糖链高活性的新茶皂甙，具有下述通式：
其中，取代基R代表半乳糖醛酸基、半乳糖基或氢，R1代表当归酸基或氢，R2代表氢或乙酰基，R3代表乙酰基或氢。
本发明中作为底物的茶皂甙为茶皂甙A2、茶皂甙A5、山茶皂甙D，以茶皂甙A2为底物所得的新茶皂甙，其化学名称为3-氧-[β-D-吡喃半乳糖醛酸基-(1-2)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基]-21-当归酸基-28-乙酰基-茶皂甙元A，分子量为981，分子式为C49O22H73，结构式为：
以茶皂甙A5为底物所得的新茶皂甙，其化学名称为3-氧-[-β-D-吡喃半乳糖基-(1-2)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基]-21-当归酸基-28-乙酰基-茶皂甙元A，分子量为967，分子式为C49O19H75，结构式为：
以山茶皂甙D为底物所得的新茶皂甙，其化学名称为3-氧-[β-D-吡喃葡萄糖醛酸基]-22-乙酰基-茶皂甙元A，分子量为724，分子式为C38H60O13，其结构为：
本发明所提供的一种低糖链高活性茶皂甙的生物转化方法，通过下述步骤完成：
第一步、利用AB-8大孔树脂对脱脂粗茶皂甙的纯化：
取一定量脱脂粗茶皂甙，用95％乙醇溶液浸泡，过滤得清液，蒸出酒精，得到油茶皂甙的清液，清液上柱，充分吸咐，用1.5BV去离子水冲洗，配制0.1％NaOH，以1.5BV/h速度冲洗，并用去离子水洗至中性，用80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，减压浓缩至干。
第二步、培养黑曲霉sp.48s菌，提取粗酶液：
将豆粕搅碎，过20目筛，分别称取豆粕和麦麸，使二者的重量比为1∶3，放入锥形瓶中，加入自来水使湿润，搅拌均匀，在121℃下灭菌15～20分钟，待冷却后，接菌，于30℃下培养2～3天，待扩配菌种长出大量孢子，向培养基中加入0.02mol/L pH值为5.0的NaAc-HAc缓冲液，缓冲液为前述自来水的5倍，浸泡1～2小时，用纱布过滤，滤液在9000转/分转速下离心15分钟，除去其中部分杂质，即得到粗酶液，在粗酶液中缓慢加入无水乙醇，使乙醇浓度为70％～75％，于2～8℃放置过夜，进行盐析，盐析后的酶液在9000转/分转速下离心15分钟，将沉淀用1mL上述缓冲液洗下，置于透析袋中用醋酸缓冲液于2～8℃透析24小时，之后再离心，所得上清液即为酶液。
第三步、茶皂甙的酶解：
取一定量5mg/ml的茶皂甙底物溶液和等体积的酶液，混匀后，pH值为6.0，50℃反应16小时，反应终止时，向反应体系中加入2倍体积的茶皂甙底物量的水饱合正丁醇摇晃多次，静止放置或高速离心，分层后，取上层液TLC点样，展开，10％硫酸显色后，分析酶反应结果。
第四步、酶解组分的分离：
采用1mm厚层析板，按照薄层层析的方法和要求分离酶解组分，展开剂是：氯仿∶甲醇∶水＝7∶3∶0.5，得到新皂甙单体，用刀片刮下后用适量甲醇溶解，用滤纸过滤后的液体用旋转蒸发器蒸发浓缩；得到酶解后的皂甙单体，用于HPLC-MS/MS分析。
样品胶的制备：称取一定量茶皂甙酶解产物放入瓷碗中，加入适量甲醇溶解，再加入氯仿和硅胶，搅拌均匀，置水浴锅上加热，待溶剂挥发净后即制得样品胶。
硅胶柱的预处理：在硅胶柱中加入适量300～400目的硅胶，保持上表面水平，抽真空使之细密均匀，再装入干燥好的样品胶。
梯度洗脱茶皂甙：硅胶柱装好后，先用纯氯仿通柱，再依次按氯仿∶甲醇＝9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5梯度洗脱茶皂甙，分别收集，即可得到茶皂甙纯品。
上述步骤中，第一步可以替换为：脱脂粗茶皂甙用95％乙醇溶液浸泡，0.1％NaOH，以1.5BV/h速度冲洗，用80％乙醇洗脱。
实验室操作时，上述步骤中第二步，取搅碎过20目筛的豆粕5g，麦麸15g，放入250mL锥形瓶中，加入20mL自来水，搅拌均匀，在121℃下灭菌15～20分钟，待冷却后，接菌，于30℃下培养2～3天，待扩配菌种长出大量孢子，向培养基中加入100mL 0.02mol/L pH值为5.0的NaAc-HAc缓冲液，浸泡1～2小时，用纱布过滤，滤液在9000转/分转速下离心15分钟，除去其中部分杂质，即得到粗酶液，取粗酶液80mL，向其中缓慢加入175mL无水乙醇，于2～8℃放置过夜，进行盐析，盐析后的酶液在9000转/分转速下离心15分钟，将沉淀用1mL上述缓冲液洗下，置于透析袋中用醋酸缓冲液于2～8℃透析24小时，期间每隔5～6小时更换缓冲液一次，之后再离心，所得上清液即为酶液。
本发明适用于各种茶皂甙单体及茶皂甙混合物的生物转化。
将得到的新茶皂甙活性进行试验对比，试验采用DPPH进行抗氧化性的测定。
DPPH测定原理：DPPH自由基是一种非常稳定并可长时间保存的自由基，常被用作测试抗氧化性试剂。当它遇到能释放质子的物质或者被还原时，自由基被消除，化合物溶液颜色发生显著变化.从紫色脱至淡黄色。通过测定加入样品前、后525nm处的吸光度的变化，求得样品对DPPH的清除率。
具体测定方法如下：
第一步、DPPH溶液的配制：准确称取0.03943gDPPH.用无水甲醇溶解并定容于100mL容量瓶中，则该DPPH溶液浓度为1mmol/L。避光保存(0～4℃)，用时稀释10倍，终浓度为100μmol/L。
第二步、皂甙清除DPPH自由基活性的测定：在装有5mL 100μmol/L DPPH的无水甲醇溶液的试管(10mL)中.加人5mL不同浓度的皂甙溶液，使总体积为10mL，震荡后黑暗中放置30min。以无水甲醇为空白，在波长525nm处测定其吸光度。计算其清除率，清除率＝(A0-A)/A0×100％，式中，A0-空白吸光度值(加DPPH，不加样品)；A-525nm处加入样品的DPPH的吸光度值。
本发明的优点在于：对油茶皂甙进行生物转化，使其活性较一般茶皂甙有所提高，对于茶皂甙的酶解方法，在国内外的资料中还未见报道。
我国是世界油茶产量最高，栽培面积最大，品种最丰富的国家，我国每年都有大量榨油后剩下的油茶饼，由于油茶饼味苦、有毒，目前基本上被废弃，这样就造成了一种很大的资源浪费。
因而，从油茶饼中提取这部份皂甙对综合利用资源，开发新产品，具有显著的经济效益和社会效益，也有很重要的创新意义。
以上技术方案可以结合本领域的基本知识根据生产需要进行调整确定，其均应该涵盖在本发明的权利要求范围内。
附图说明
图1、茶皂甙A2转化为新皂甙1的过程。
图2、茶皂甙A5转化为新皂甙2的过程。
图3、山茶皂甙D转化为新皂甙3的过程。
图4、抗氧化实验对比图。
图5、茶皂甙生物转化工艺流程图。
具体实施方式
第一步、利用AB-8大孔树脂对脱脂粗茶皂甙的纯化：
取一定量脱脂粗茶皂甙，用95％乙醇溶液浸泡，过滤得清液，用旋转蒸发器蒸出酒精，得到油茶皂甙的清液。将得到的油茶皂甙清液上柱，静置使充分吸咐，用1.5BV去离子水冲洗。配置0.1％NaOH，以1.5BV/h速度冲洗，并用去离子水洗至中性。用80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，减压浓缩至干。
第二步、培养黑曲霉sp.48s菌，提取粗酶液：
称取豆粕(20目搅碎)5g，麦麸15g，放入250mL锥形瓶中，加入20mL自来水，搅拌均匀，使培养基全部湿润且松散，无结块。在121℃下灭菌15～20分钟。待冷却后，接菌。接菌后，于30℃下培养两三天，中间每隔几个小时摇晃一次，使其保持疏松，有利于菌种均匀生长。待扩配菌种长出大量孢子，向培养基中加入100mL 0.02mol/L pH值为5.0的NaAc-HAc缓冲液，浸泡1～2小时，用纱布过滤，滤液在9000转/分转速下离心15分钟，除去其中部分杂质，即得到粗酶液，每锥形瓶得到大约80mL。在粗酶液中缓慢加入175mL无水乙醇，使其浓度为70％～75％，加入乙醇时速度要慢，边加边搅拌，防止过热。然后在2～8℃放置过夜，进行盐析。盐析后的酶液在9000转/分转速下离心15分钟，将沉淀用1mL上述缓冲液洗下，置于透析袋中于2～8℃用醋酸缓冲液透析24小时，期间隔5～6小时更换缓冲液一次。之后，再离心，所得上清液即为酶液。
第三步、茶皂甙的酶解：
取一定量5mg/ml的茶皂甙溶液和等体积的酶液，混匀后，pH值为6.0，50℃反应16小时。反应终止时，向反应体系中加入2倍体积的茶皂甙底物量的水饱合正丁醇摇晃多次，静止放置或高速离心，分层后，取上层液TLC点样，展开，10％硫酸显色后，分析酶反应结果。
第四步、酶解组分的分离：
采用德国Merck公司1mm厚层析板，按照薄层层析的方法和要求分离酶解组分。展开剂是：氯仿∶甲醇∶水＝7∶3∶0.5，得到新皂甙单体，用刀片刮下后用适量甲醇溶解，用滤纸过滤后的液体用旋转蒸发器蒸发浓缩。得到酶解后的皂甙单体，用于HPLC-MS/MS分析。
样品胶的制备：称取一定量茶皂甙酶解产物放入瓷碗中，加入适量甲醇溶解，再加入氯仿和硅胶，搅拌均匀，置水浴锅上加热，待溶剂挥发净后即制得样品胶。
硅胶柱的预处理：在硅胶柱中加入适量300～400目的硅胶(分离胶)，保持上表面水平，抽真空使之细密均匀，再装入干燥好的样品胶。
梯度洗脱茶皂甙：硅胶柱装好后，先用纯氯仿通柱，再依次按氯仿∶甲醇＝9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5梯度洗脱茶皂甙，分别收集，即可得到茶皂甙纯品。
第五步、茶皂甙活性试验对比：
抗氧化性的测定：
DPPH溶液的配制：准确称取0.03943gDPPH.用无水甲醇溶解并定容于100mL容量瓶中，则该DPPH溶液浓度为1mmol/L。避光保存(0～4℃)，用时稀释10倍，终浓度为100μmol/L。
皂甙清除DPPH自由基活性的测定：在装有5mL 100μmol/L DPPH的无水甲醇溶液的试管(10mL)中.加人5mL不同浓度的皂甙溶液，使总体积为10mL，震荡后黑暗中放置30min。以无水甲醇为空白，在波长525nm处测定其吸光度。计算其清除率。
清除率(％)＝(A0-A)/A0×100
式中，A0-空白吸光度值(加DPPH，不加样品)；
A-525nm处加入样品的DPPH的吸光度值。
酶解前后茶皂甙(分离前)对DPPH自由基清除率对比见表1和表2。
表1、酶解前后茶皂甙对DPPH自由基清除率对比表(30min)。
A0＝0.45857；DPPH：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼。
表2、酶解前后茶皂甙对DPPH自由基清除率对比表(60min)。
A0＝0.45857；DPPH：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼。
Claims (12)
1.一种低糖链高活性的新茶皂甙，其特征在于具有下述通式：
其中，取代基R代表半乳糖醛酸基、半乳糖基或氢，R1代表当归酸基或氢，R2代表氢或乙酰基，R3代表乙酰基或氢。
2.根据权利要求1所述的一种低糖链高活性的新茶皂甙，其特征在于化学名称为3-氧-[β-D-吡喃半乳糖醛酸基-(1-2)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基]-21-当归酸基-28-乙酰基-茶皂甙元A，分子量为981，分子式为C49O22H73，结构式为：
3.根据权利要求1所述的一种低糖链高活性的新茶皂甙，其特征在于化学名称为3-氧-[-β-D-吡喃半乳糖基-(1-2)-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基]-21-当归酸基-28-乙酰基-茶皂甙元A，分子量为967，分子式为C49O19H75，结构式为：
4.根据权利要求1所述的一种低糖链高活性的新茶皂甙，其特征在于化学名称为3-氧-[β-D-吡喃葡萄糖醛酸基]-22-乙酰基-茶皂甙元A，分子量为724，分子式为C38H60O13，其结构为：
5.权利要求1所述的一种低糖链高活性的新茶皂甙的生物转化方法，其特征在于通过下述步骤完成：
第一步、利用AB-8大孔树脂对脱脂粗茶皂甙的纯化：
取一定量脱脂粗茶皂甙，用95％乙醇溶液浸泡，过滤得清液，蒸出酒精，得到油茶皂甙的清液，清液上柱，静置使充分吸咐，用1.5BV去离子水冲洗，配制0.1％NaOH，以1.5BV/h速度冲洗，并用去离子水洗至中性，用80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，减压浓缩至干；
第二步、培养黑曲霉sp.48s菌，提取粗酶液：
将豆粕搅碎，过20目筛，分别称取豆粕和麦麸，使二者的重量比为1∶3，放入锥形瓶中，加入自来水使湿润，搅拌均匀，在121℃下灭菌15～20分钟，待冷却后，接菌，于30℃下培养2～3天，待扩配菌种长出大量孢子，向培养基中加入0.02mol/L pH值为5.0的NaAc-HAc缓冲液，缓冲液为前述自来水的5倍，浸泡1～2小时，用纱布过滤，滤液在9000转/分转速下离心15分钟，除去其中部分杂质，即得到粗酶液，在粗酶液中缓慢加入无水乙醇，使乙醇浓度为70％～75％，于2～8℃放置过夜，进行盐析，盐析后的酶液在9000转/分转速下离心15分钟，将沉淀用1mL上述缓冲液洗下，置于透析袋中用醋酸缓冲液于2～8℃透析24小时，之后再离心，所得上清液即为酶液；
第三步、茶皂甙的酶解：
取一定量5mg/ml的茶皂甙底物溶液和等体积的酶液，混匀后，pH值为6.0，50℃反应16小时，反应终止时，向反应体系中加入2倍体积的茶皂甙底物量的水饱合正丁醇摇晃多次，静置分层后，取上层液TLC点样，展开，10％硫酸显色后，分析酶反应结果；
第四步、酶解组分的分离：
采用1mm厚层析板，按照薄层层析的方法和要求分离酶解组分，展开剂是：氯仿∶甲醇∶水＝7∶3∶0.5，得到新皂甙单体，用刀片刮下后用适量甲醇溶解，用滤纸过滤后的液体用旋转蒸发器蒸发浓缩；得到酶解后的皂甙单体，用于HPLC-MS/MS分析；
样品胶的制备：称取一定量茶皂甙酶解产物放入瓷碗中，加入适量甲醇溶解，再加入氯仿和硅胶，搅拌均匀，置水浴锅上加热，待溶剂挥发净后即制得样品胶；
硅胶柱的预处理：在硅胶柱中加入适量300～400目的硅胶，保持上表面水平，抽真空使之细密均匀，再装入干燥好的样品胶；
梯度洗脱茶皂甙：硅胶柱装好后，先用纯氯仿通柱，再依次按氯仿∶甲醇＝9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5梯度洗脱茶皂甙，分别收集，即可得到茶皂甙纯品。
6.根据权利要求5所述的一种低糖链高活性的新茶皂甙的生物转化方法，其特征在于第一步中脱脂粗茶皂甙用95％乙醇溶液浸泡，0.1％NaOH，以1.5BV/h速度冲洗，用80％乙醇洗脱。
7.根据权利要求5所述的一种低糖链高活性的新茶皂甙的生物转化方法，其特征在于第二步中取搅碎过20目筛的豆粕5g，麦麸15g，放入250mL锥形瓶中，加入20mL自来水，搅拌均匀，在121℃下灭菌15～20分钟，待冷却后，接菌，于30℃下培养2～3天，待扩配菌种长出大量孢子，向培养基中加入100mL0.02mol/L pH值为5.0的NaAc-HAc缓冲液，浸泡1～2小时，用纱布过滤，滤液在9000转/分转速下离心15分钟，除去其中部分杂质，即得到粗酶液，取粗酶液80mL，向其中缓慢加入175mL无水乙醇，于2～8℃放置过夜，进行盐析，盐析后的酶液在9000转/分转速下离心15分钟，将沉淀用1mL上述缓冲液洗下，置于透析袋中用醋酸缓冲液于2～8℃透析24小时，期间每隔5～6小时更换缓冲液一次，之后再离心，所得上清液即为酶液。
8.根据权利要求5所述的一种低糖链高活性的新茶皂甙的生物转化方法，其特征在于第三步中加入2倍体积的茶皂甙底物量的水饱合正丁醇摇晃多次，高速离心，分层后，取上层液TLC点样，展开，10％硫酸显色后，分析酶反应结果。
9.根据权利要求5所述的一种低糖链高活性的新茶皂甙的生物转化方法，其特征在于第四步中采用1mm厚层析板，按照薄层层析的方法和要求分离酶解组分，展开剂是：氯仿∶甲醇∶水＝7∶3∶0.5。
10.根据权利要求5所述的一种低糖链高活性的新茶皂甙的生物转化方法，其特征在于第四步梯度洗脱茶皂甙：先用纯氯仿通柱，再依次按氯仿∶甲醇＝9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5梯度洗脱茶皂甙，分别收集，即可得到茶皂甙纯品。
11.根据权利要求5所述的一种低糖链高活性的新茶皂甙的生物转化方法，其特征在于底物为茶皂甙。
12.根据权利要求5所述的一种低糖链高活性的新茶皂甙的生物转化方法，其特征在于作为底物的茶皂甙为茶皂甙A2、茶皂甙A5、山茶皂甙D。
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