CN108272831A

CN108272831A - 红松松针多酚类化合物的提取方法及其应用

Info

Publication number: CN108272831A
Application number: CN201810213804.8A
Authority: CN
Inventors: 王占; 王占一
Original assignee: Zaozhuang University
Current assignee: Zaozhuang University
Priority date: 2018-03-15
Filing date: 2018-03-15
Publication date: 2018-07-13

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及红松松针多酚类化合物的提取方法及其应用；其提取方法包括制备脱脂松针材料，制备松针多酚提取液，回收离子液体，纯化松针多酚共四个步骤；本发明采用离子液体辅助提取松针中多酚类化合物，得率较高，将其应用于制备抑制α‑葡萄糖苷酶活性制剂，效果较好。

Description

红松松针多酚类化合物的提取方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及红松松针多酚类化合物的提取方法及其应用。

背景技术

松针是裸子植物松科松属植物的叶，在我国资源极其丰富，松属植物的叶很少被开发利用，造成资源的大量浪费。国内松针茶开发较晚，工艺简单，以初加工后的松针干燥品直接泡茶饮用为主，长期饮用松针茶能够起到一定的降血压、降血糖的保健作用。国内学者认为，松针中功效成分为酚酸性成分，以松针多酚为主。对于松针多酚的提取工艺，国内文献大多以一定体积分数的乙醇作为提取溶剂，得率较低。

如中国发明专利申请201610520518.7，提供了一种天然本草提取物，其中樟子松多酚的质量百分比为10％-80％；其提取方法为包括如下步骤：步骤1、向樟子松树皮中加入10-20倍体积倍率的溶媒，提取2-10次，每次1.5-3h，得到提取液；步骤2、混合每次提取的提取液，得混合提取液，所述混合提取液经减压浓缩得到浓缩液，所述浓缩液即为所述樟子松树皮提取物。实施例中公开步骤1中所述溶媒为去离子水、甲醇水溶液、乙醇水溶液中的任意一种或几种组合。

离子液体(或称离子性液体)是指全部由离子组成的液体，如高温下的KCI, KOH呈液体状态，此时它们就是离子液体。在室温或室温附近温度下呈液态的由离子构成的物质，称为室温离子液体、室温熔融盐(室温离子液体常伴有氢键的存在，定义为室温熔融盐有点勉强)、有机离子液体等，目前尚无统一的名称，但倾向于简称离子液体。由于离子液体具有其独特的理化性能，非常适合于用作分离提纯的溶剂。在此方面已有大量的报道，如利用离子液体从发酵液中提取回收丁醇；利用超临界CO₂从离子液体中提取非挥发性有机物等等。

1-丁基-3-甲基咪唑氯盐（离子液体）具有稳定的理化性质，较强的溶解能力和很低的挥发度，而且可以循环利用，能够辅助其它提取溶媒，明显提高提取产物得率，体现了广泛的应用前景。如中国发明专利CN201310073714.0提供了一种用咪唑类离子液体提取木质纤维素类生物质纤维素的方法，其将木质纤维素类生物质的固体废弃物粉碎后溶解于离子液体混合液中，70-120℃下搅拌溶解2-6小时，溶解完成后将滤液与沉淀剂混合后搅拌1-5小时，过滤后得到的沉淀物经干燥即为目标产品纤维素；将回收的滤液经旋转蒸发仪80℃水浴条件下减压蒸馏回收离子液体混合液和沉淀剂并可重复循环利用。本发明的优点和有益效果是：该方法工艺简单、易于实施、可大幅度缩短反应时间，提高反应产率，降低应用成本，制备的纤维素纯度高，可大于99%。所述离子液体混合液由1-烯丙基3-甲基咪唑氯盐、1-丁基-3-甲基咪唑氯盐、1-烯丙基-3-甲基咪唑醋酸盐和1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐四种离子液体混合组成，所述沉淀剂为水、乙醇和丙酮的混合液。

上述专利技术的缺陷在于：1，全部采用离子液体的混合液对木质纤维素类生物质的固体废弃物进行溶解提取，离子液体的用量较大，费用较高；2，沉淀剂中含有丙酮，其有较大的毒性和挥发性，不利于保护操作人员的健康。

纤维素(cellulose)是由葡萄糖组成的大分子多糖。不溶于水及一般有机溶剂。是植物细胞壁的主要成分。纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，占植物界碳含量的50%以上。棉花的纤维素含量接近100%，为天然的最纯纤维素来源。一般木材中，纤维素占40~50%，还有10~30%的半纤维素和20~30%的木质素。现有技术能够使用离子液体提取木质纤维素，纯度较高，与木质纤维素在植物中含量较高有关，而据相关研究表明每克松针中多酚类化合物的含量不足50mg，即不足5%。

现有技术中还未见应用1-丁基-3-甲基咪唑氯盐辅助提取松针中多酚类成分的研究报道。现有技术中还未见将从松针中提取的总多酚类化合物用于抑制α-葡萄糖苷酶活性制剂的报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供红松松针多酚类化合物的提取方法，其采用离子液体辅助提取松针中多酚类化合物，得率较高；本发明的另一目的在于提供红松松针中多酚类化合物的应用，将其应用于制备抑制α-葡萄糖苷酶活性制剂，效果较好。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：红松松针多酚类化合物的提取方法，包括如下步骤：

步骤一，制备脱脂松针材料：将红松松针净选、洗净，干燥，粉碎，加入索氏提取器加料管中，采用石油醚脱脂，得到脱脂松针材料；

步骤二，制备松针多酚提取液：将离子液体的乙醇溶液、脱脂松针材料加入容器中，在80-95℃条件下提取，提取液减压抽滤后，收集滤液即为松针多酚提取液；

步骤三，回收离子液体：将松针多酚提取液浓缩，得到含有离子液体的膏状物；用无水乙醇溶解，滴加石油醚，离子液体析出完全，离心分离，上清液浓缩，得到除去离子液体的膏状物；用蒸馏水溶解，得到松针多酚水溶液；

步骤四，纯化松针多酚：将松针多酚水溶液，调pH值至6，添加蒸馏水后，全部加入到大孔吸附树脂材料中，充分搅拌，并静置使多酚在树脂上吸附完全，减压抽滤后，将树脂采用乙醇洗脱，抽滤，洗脱液浓缩，得到松针多酚类化合物。

优化的，步骤一中所述离子液体采用1-丁基-3-甲基咪唑氯盐，溶剂采用体积浓度为60%的乙醇，离子液体的乙醇溶液的浓度为0.1～0.2 mol/L。

优化的，步骤一中粉碎至通过40目药典筛，脱脂用的石油醚沸程为60-90℃；步骤三中析出离子液体用的石油醚沸程为60-90℃；步骤四中大孔吸附树脂采用AB-8型，吸附树脂的洗脱剂采用体积分数为60%的乙醇。

优化的，步骤一的具体操作包括：制备脱脂松针材料：将红松松针净选、洗净，于恒温鼓风干燥箱中，在60℃条件下，恒温干燥72 h，干燥完全后，用小型万能粉碎机粉碎，过40目药典筛后，转移至索氏提取器加料管中，加入石油醚，连续回流提取2次，从第一次虹吸时开始计时，时间分别为1.5 h和1 h，得到脱脂松针材料。

优化的，步骤二的具体操作包括：制备松针多酚提取液：将离子液体溶于乙醇，制备成离子液体的乙醇溶液，连同脱脂松针材料加入到容器中，在提取温度为80-95℃条件下，回流提取2次，时间分别为2 h和1.5 h，提取液减压抽滤后，合并收集滤液即为松针多酚提取液。

优化的，步骤三的具体操作包括：回收离子液体：将松针多酚提取液用旋转蒸发仪，减压浓缩回收溶剂，得到含有离子液体的膏状物；用无水乙醇溶解，滴加石油醚，离子液体析出完全，转速为2500～3000 r/min离心15 min，上清液用旋转蒸发仪，减压蒸干溶剂后，得到除去离子液体的膏状物；用蒸馏水溶解，得到松针多酚水溶液。

优化的，步骤四的具体操作包括：纯化松针多酚：将松针多酚水溶液，用质量分数为5%的NaOH水溶液调pH值至6，添加蒸馏水后，全部加入到AB-8大孔吸附树脂材料中，充分搅拌，并静置60～90 min使多酚在树脂上吸附完全，减压抽滤后，将树脂置于容器中，加入体积分数为60%的乙醇洗脱，采用超声波振荡5 min，抽滤，洗脱液用旋转蒸发仪，减压浓缩，得到松针多酚类化合物。

采用上述提取方法得到的红松松针多酚类化合物的应用为：所述松针多酚类化合物配制成抑制α-葡萄糖苷酶活性的药物制剂。

优化的，所述药物制剂中红松松针多酚类化合物的质量浓度为1.0 mg/mL。

本发明中乙醇的含量为体积分数，80%乙醇指乙醇的体积含量为80%，水的体积含量为20%。AB-8型大孔吸附树脂是苯乙烯型弱极性共聚体，使用前的处理方法为现有技术中通用的树脂方法，具体包括将市售的树脂依次用水浸泡24h、酸洗、碱洗、乙醇洗、水洗等处理方法。红松松针多酚类化合物是指红松松针中含有的总多酚类化合物。

本发明的有益效果在于：

1，本发明首次应用离子液体辅助提取松针中多酚类化合物，其通过首先对红松松针进行脱脂操作，以除去材料中大量的色素类脂溶性成分，更有利于后续的提取纯化工艺，然后再采用离子液体辅助提取松针中多酚类化合物，得率较高，同时采用石油醚析出离子液体、树脂吸附纯化结合的工艺，将松针多酚化合物产物纯度提高，采用本发明提供的方法提取得到的松针多酚类化合物，在后期生物活性检测及相应剂型制备过程中，由于纯度较高，减少了杂质的引入，使松针多酚开发的制剂在服用后，功效确切，能够抑制α-葡萄糖苷酶活性，效果较好，并减少了不良反应的发生。

2，本发明提供的制备方法中采用离子液体的乙醇溶液，降低了离子液体的用量，减少了提取费用；采用的溶剂全部为水、乙醇、石油醚、毒性小，价格低廉，减少因操作不当而给机体带来的潜在伤害，极大降低了对环境的污染。

3，本发明通过在各个步骤中采用合适的溶剂、浓度、树脂、提取次数、温度、时间等参数，提取得到的松针多酚得率达到7.3%，高于现有技术中的得率5.0%左右，产物得率提高了46%左右；纯度提高到72.5%，明显高于纯化前的纯度13.8%。

4，本发明以红松松针为材料，连续回流法脱脂后，应用0.1～0.2 mol/L的1-丁基-3-甲基咪唑氯盐60%乙醇溶液提取松针中多酚类成分，采用AB-8大孔吸附树脂静态吸附分离技术获得纯化后的松针多酚产物，一定质量浓度的松针多酚具有较好的抑制α-葡萄糖苷酶活性。为松针多酚的工业化生产及降血糖保健药品的研发提供参考。

5，本发明能够使1-丁基-3-甲基咪唑氯盐在使用后析出完全，可以循环使用，节约了成本。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

本实施例提供的红松松针多酚类化合物的提取方法，包括如下步骤：

步骤一，制备脱脂松针材料：将红松松针净选、洗净，于恒温鼓风干燥箱中，在60℃条件下，恒温干燥72 h，干燥完全后，用小型万能粉碎机粉碎，过40目药典筛后备用。取20g至索氏提取器加料管中，第一次加入石油醚150 mL，从第一次虹吸时开始计时（70℃），回流提取时间为1.5 h；第二次加入石油醚150 mL，从第一次虹吸时开始计时（70℃），回流提取时间为1 h，得到脱脂松针材料（约19.7g）。

步骤二，制备松针多酚提取液：将1-丁基-3-甲基咪唑氯盐（离子液体）溶于60%乙醇，制备成0.1～0.2 mol/L的1-丁基-3-甲基咪唑氯盐60%乙醇溶液，将脱脂松针材料（约19.7g）至500 mL平底烧瓶中，第一次加入1-丁基-3-甲基咪唑氯盐60%乙醇溶液250 mL，在提取温度为85 ℃条件下，回流提取时间为2 h；第二次加入1-丁基-3-甲基咪唑氯盐60%乙醇溶液250 mL，在提取温度为85 ℃条件下，回流提取时间为1.5 h，提取液减压抽滤后，合并，得到松针多酚提取液。

步骤三，回收离子液体：松针多酚提取液用旋转蒸发仪，减压浓缩回收乙醇和水，得到膏状物（9.5～18.45 g，包含离子液体），用150 mL无水乙醇溶解，缓慢滴加石油醚（60～90沸程，30～50 mL），1-丁基-3-甲基咪唑氯盐析出完全，（2500～3000 r/min）离心15min，上清液用旋转蒸发仪，减压蒸干溶剂后，膏状物用50 mL蒸馏水溶解，得到松针多酚水溶液；

步骤四，纯化松针多酚：将松针多酚水溶液，用5%NaOH调pH值至6，蒸馏水定容至100mL，全部加入到（250～350 g，湿重）处理好的AB-8大孔吸附树脂材料中，充分搅拌，并静置使多酚在树脂上吸附完全（60～90 min），减压抽滤后，将树脂置于1000 mL三角瓶中，加入（500～700mL）体积分数为60%乙醇洗脱（超声波振荡5 min），抽滤，洗脱液用旋转蒸发仪，减压浓缩，得到松针多酚类化合物1.46g。

本实施例提供的红松松针多酚类化合物的应用为：将提取的松针多酚类化合物配制成抑制α-葡萄糖苷酶活性的药物制剂，所述药物制剂中红松松针多酚类化合物的质量浓度为1.0 mg/mL。

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于：步骤三中，以乙腈和乙醚为回收1-丁基-3-甲基咪唑氯盐的试剂，具体操作包括：步骤三，回收离子液体：松针多酚提取液用旋转蒸发仪，减压浓缩回收乙醇和水，得到膏状物（9.5～18.45 g，包含离子液体），用120 mL乙腈溶解，缓慢滴加乙醚，1-丁基-3-甲基咪唑氯盐析出完全，（2500～3000 r/min）离心15 min，上清液用旋转蒸发仪，减压蒸干溶剂后，膏状物用50 mL蒸馏水溶解，得到松针多酚水溶液。

对比例2

称取20 g干燥后的(与实施例同一批）红松松针材料，按照传统工艺，不经过脱脂，应用60%乙醇回流提取松针材料，得到松针多酚粗提取物，旋转蒸发仪真空浓缩得到棕色膏状物，即为松针多酚类化合物。

检测以上三种方法得到的松针多酚化合物的得率和纯度，进行对比。对比结果见表1。

表1 得率和纯度对比表

组别	松针多酚得率/%	松针多酚纯度/%
			对比例2	4.9	13.8
对比例1	7.2	71.4
			实施例1	7.3	72.5

由上表的对比可知：本发明提供的方法得到的松针多酚化合物得率及纯度最高，远远高于对比例2，即现有技术中不经过脱脂，仅仅醇提的方法；同时本发明提供的方法也优于对比例1，即回收1-丁基-3-甲基咪唑氯盐工艺中，应用无水乙醇和石油醚代替乙腈和乙醚两种毒性试剂，并不影响多酚的得率和纯度，相反，两者均有所提高，综上所述，本发明提供的提取方法的得率和纯度优于对比例。

体外抑制α-葡萄糖苷酶活性试验

将以上三种方法（实施例1和对比例1-2）得到的松针多酚化合物进行松针多酚体外抑制α-葡萄糖苷酶活性试验：首先将三种方法得到的松针多酚化合物分别与蒸馏水，通过含量换算依次配制成质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL的松针多酚化合物水溶液，用于样品组抑制α-葡萄糖苷酶活性测定，同时，将阿卡波糖依次配制成相同质量浓度的对照溶液，用于阿卡波糖组。

松针多酚体外抑制α-葡萄糖苷酶活性试验的具体方法为：将试验分成5组，每组3个平行。1)样品组：依次加入80 µLPBS缓冲液（pH6.8），10 µLα-葡萄糖苷酶溶液（0.12 mg/mL）和10 µL松针多酚化合物水溶液，充分混匀，在37 ℃温度下温育15 min，加入0.2mLPNPG溶液（2.4 mmol/L），在37 ℃温度下温育10 min。温育结束后，加入0.4 mLNa₂CO₃溶液（1mol/L）中止反应，用紫外-可见光分光光度计在405 nm波长下测定吸光度。由于PNPG在α-葡萄糖苷酶的作用下能水解产生葡萄糖和PNP，因此，可以根据测得的吸光度值，计算出产物PNP的产量。2)样品空白组：以PBS缓冲液代替酶液，其它试剂同样品组；3)阴性对照组：以PBS缓冲液代替样品溶液，其它试剂同样品组；4)空白组：以PBS缓冲液代替酶液和样品溶液，其它试剂同样品组；5)阿卡波糖组：以阿卡波糖代替样品溶液，其它试剂的加入顺序同样品组。试验结果见表2。

表2 体外抑制α-葡萄糖苷酶活性试验结果对比

抑制率浓度	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0	1.2	1.4
								对比例1	7.2	9.8	12.4	18.6	20.6	21.3	21.7
对比例2	14.9	25.3	34.5	42.8	49.1	49.5	49.8
								实施例1	18.5	28.7	39.2	47.9	55.8	56.1	56.6

表2中抑制率的单位为%，浓度的单位为mg/mL。

上表试验结果表明：采用本发明提供的方法提取的松针多酚化合物对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制作用，优于对比例，且当质量浓度为1.0 mg/mL时，抑制率达到55.8%，而此后，再增加多酚质量浓度，抑制率几乎不再增加，抑制率达到饱和。在0.2～1.0 mg/mL范围内，松针多酚的质量浓度与对α-葡萄糖苷酶的抑制率之间存在着一正相关性。

综上所述，本发明应用1-丁基-3-甲基咪唑氯盐辅助60%乙醇提取红松松针多酚，能明显增加其得率，采用AB-8大孔吸附树脂静态吸附分离技术获得纯化后的松针多酚产物纯度较高，应用无水乙醇和石油醚代替乙腈和乙醚两种毒性试剂，工艺稳定可靠。采用本发明提供的方法提取的松针多酚化合物对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制作用，且无毒副作用，适于推广应用。

Claims

1.红松松针多酚类化合物的提取方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的红松松针多酚类化合物的提取方法，其特征在于：步骤一中所述离子液体采用1-丁基-3-甲基咪唑氯盐，溶剂采用体积浓度为60%的乙醇，离子液体的乙醇溶液的浓度为0.1～0.2 mol/L。

3.根据权利要求1所述的红松松针多酚类化合物的提取方法，其特征在于：步骤一中粉碎至通过40目药典筛，脱脂用的石油醚沸程为60-90℃；步骤三中析出离子液体用的石油醚沸程为60-90℃；步骤四中大孔吸附树脂采用AB-8型，吸附树脂的洗脱剂采用体积分数为60%的乙醇。

4.根据权利要求1所述的红松松针多酚类化合物的提取方法，其特征在于：步骤一的具体操作包括：制备脱脂松针材料：将红松松针净选、洗净，于恒温鼓风干燥箱中，在60℃条件下，恒温干燥72 h，干燥完全后，用小型万能粉碎机粉碎，过40目药典筛后，转移至索氏提取器加料管中，加入石油醚，连续回流提取2次，从第一次虹吸时开始计时，时间分别为1.5 h和1 h，得到脱脂松针材料。

5.根据权利要求1所述的红松松针多酚类化合物的提取方法，其特征在于：步骤二的具体操作包括：制备松针多酚提取液：将离子液体溶于乙醇，制备成离子液体的乙醇溶液，连同脱脂松针材料加入到容器中，在提取温度为80-95℃条件下，回流提取2次，时间分别为2h和1.5 h，提取液减压抽滤后，合并收集滤液即为松针多酚提取液。

6.根据权利要求1所述的红松松针多酚类化合物的提取方法，其特征在于：步骤三的具体操作包括：回收离子液体：将松针多酚提取液用旋转蒸发仪，减压浓缩回收溶剂，得到含有离子液体的膏状物；用无水乙醇溶解，滴加石油醚，离子液体析出完全，转速为2500～3000 r/min离心15 min，上清液用旋转蒸发仪，减压蒸干溶剂后，得到除去离子液体的膏状物；用蒸馏水溶解，得到松针多酚水溶液。

7.根据权利要求1所述的红松松针多酚类化合物的提取方法，其特征在于：步骤四的具体操作包括：纯化松针多酚：将松针多酚水溶液，用质量分数为5%的NaOH水溶液调pH值至6，添加蒸馏水后，全部加入到AB-8大孔吸附树脂材料中，充分搅拌，并静置60～90 min使多酚在树脂上吸附完全，减压抽滤后，将树脂置于容器中，加入体积分数为60%的乙醇洗脱，采用超声波振荡5 min，抽滤，洗脱液用旋转蒸发仪，减压浓缩，得到松针多酚类化合物。

8.采用权利要求1-7任意一项所述的提取方法得到的红松松针多酚类化合物的应用，其特征在于：所述松针多酚类化合物配制成抑制α-葡萄糖苷酶活性的药物制剂。

9.根据权利要求8所述的红松松针多酚类化合物的应用，其特征在于：所述药物制剂中红松松针多酚类化合物的质量浓度为1.0 mg/mL。