CN102153615B

CN102153615B - 一种从桔核中提取活性成分的方法

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Publication number: CN102153615B
Application number: CN201110004630A
Authority: CN
Inventors: 荣龙; 刘灿; 刘静; 荣永海; 黄国伦
Original assignee: Beihang University
Current assignee: Beihang University
Priority date: 2011-01-11
Filing date: 2011-01-11
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2031-01-11
Also published as: CN102153615A

Abstract

本发明提出一种从桔核中提取活性成分的方法，具体包括桔核粉碎后超临界萃取桔油、去油桔核残渣进行浸泡及匀浆处理、将匀浆液进行离心分离处理、对上清液A进行超滤处理和将滤液进行亲和层析等步骤，最终达到从废弃的桔核中提取纯度高的柠檬苦素，以及柠檬苦素酸性甙元、诺米林和柠檬苦素中性甙元(不包含柠檬苦素和诺米林)等其他活性成分，实现了桔核资源的综合利用。该方法产率高，并在提取过程中大大减少有机溶剂的使用，规避了有机溶剂提取时造成的易燃易爆问题，降低了生产成本，减少了环境的污染。

Description

一种从桔核中提取活性成分的方法

技术领域

本发明属于天然产物活性成分的提取分离技术领域，具体涉及一种从桔核中提取活性成分的方法。

背景技术

柠檬苦素类似物是桔核中一类生物活性成分，主要包括柠檬苦素酸性甙元、柠檬苦素、诺米林、柠檬苦素中性甙元(不包括柠檬苦素、诺米林)，均属于三萜类物质，在促进癌细胞凋亡、调控低密度脂蛋白、治疗结肠癌、抗菌以及杀虫等方面具有显著的功效，因此柠檬苦素类似物的应用开发具有巨大医用价值和广阔的市场前景。

目前，柠檬苦素及其类似物的提取分离工艺对有机溶剂用量大，产率低，加上成本因素，我国还无法实现柠檬苦素及其类似物规模化生产，造成大量桔核作为废弃物丢弃，十分可惜。柑桔的深度加工，尤其是以桔核作为原料提取生物活性物质并加以利用，是提高柑桔产业效益重要途径。

从桔核中提取活性成分的技术主要存在三种问题：首先，提取的柠檬苦素或产率较低，或纯度不高，且提取和纯化的工艺有待完善；其次，提取过程中需采用大量有机溶剂如石油醚、丙酮、乙酸乙酯和乙醇等作为脱脂或提取溶剂，这些有机溶剂污染环境，且易燃易爆，不易保存；再次，目前的方法仅对桔核的单一成分进行了提取分离，未能将桔核中多种活性成分的提取分离进行有机结合，从而增加了生产成本。如公开号为CN 101580513A的专利：工业层析法制备柠檬苦素单体的工艺中记载了反复采用石油醚进行脱脂处理，然后采用醇类进行提取，环境污染严重，成本高，且没有记载柠檬苦素的产率。如公开号为CN 101531666A的专利：一种从柚核中提取柠檬苦素的工艺中记载了以醇类有机溶剂作为提取溶剂，通过层析和结晶得到纯度为92％，产率为0.25％的柠檬苦素，柠檬苦素产率和纯度均较低，且有机溶剂用量大。如公开号为CN101367823A的专利：从吴茱萸中分离柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法中记载：通过有机溶剂萃取、柱层析、高效制备液相分离得到纯度为99％的柠檬苦素，该提取工艺存在的问题：产率较低，仅为0.1％，且成本太高，只适合实验制备，不能实现产业化。如公开号为CN101781355A的专利：柠檬苦素的制备方法及组合物和其应用，该工艺得到柠檬苦素产率为1.68％，纯度为98.5％，看似产率纯度都较好，但提取方法是明显有违背客观事实之处，因为柠檬苦素为中低极性分子，在酸性条件下柠檬苦素是闭环不溶解于水的，也不溶解于冰醋酸，用冰醋酸不可能提取出柠檬苦素，通过溶解实验能够证明柠檬苦素不溶解于醋酸。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提出一种从桔核中提取活性成分的方法，该方法以废弃桔核为原料，对其进行综合利用，从中提取出活性成分即高纯度的柠檬苦素，同时还可以获得柠檬苦素酸性甙元、诺米林和柠檬苦素中性甙元等多种活性成分，该方法充分利用了桔核资源，具有产率高、安全、环保的特点。采用超临界二氧化碳萃取的方法提取桔油，以及采用弱碱溶液取代有机溶剂作为提取溶剂，减少有机溶剂的使用，规避了有机溶剂提取时造成的易燃易爆问题，降低了生产成本，减少了环境的污染。在层析前进行超滤处理，清除了植物大分子蛋白，减轻了后续层析时压力，减少树脂用量。

本发明提出的一种从桔核中提取活性成分的方法，具体包括以下步骤：

第一步：桔核粉碎后提取桔油：

将桔核粉碎至60目以上后加入至超临界二氧化碳提取器内提取桔油，设置二氧化碳气体压力为30～32MPa，提取温度为45～48℃，提取时间为1.5～2小时，得到桔油和去油桔核残渣。

第二步：去油桔核残渣进行浸泡及匀浆处理：

按照液固比为10～20ml/g的比例，利用蒸馏水浸泡去油桔核残渣，并用碱溶液A调整pH值为8～11.5，在温度为60～80℃下浸泡0.5～2h后，采用闪式提取器进行匀浆处理，转速为3500～5500r/min搅拌破碎1～3min后，得到匀浆液。所述的浸泡的目的是使柠檬苦素及中性甙元在碱性条件下转型为水溶性分子。所述的碱溶液A优选为浓度3～5M的NaOH溶液。

第三步：将匀浆液进行离心分离处理：

将匀浆液放置于离心机中，在转速4000～5000r/min下离心分离10～20min，得到上清液A。

第四步：对上清液A进行超滤处理：

将上清液A利用超滤器进行超滤处理，使用的滤膜的截留分子量为6000～10000，收集得到滤液。

所述的超滤处理的目的为去除上清液A中大分子蛋白，避免了层析过程中，蛋白质对树脂竞争性吸附。

第五步：将滤液进行层析：

利用浓度为0.5～2M的盐酸调整滤液的pH值为3.8～4.4，并利用层析柱对该滤液中的活性成分进行吸附，用去离子水冲洗层析柱至下柱液为无色，得到吸附有活性成分的层析柱。所述的层析柱的填料为非极性大孔树脂，优选为XAD16型大孔吸附树脂。

第六步：层析柱进行洗脱处理：

用浓度为60％～85％的乙醇溶液对吸附有活性成分的层析柱进行洗脱处理，洗脱用量为：乙醇溶液与吸附有活性成分的层析柱的体积比为3∶1～5∶1的比例。收集得到乙醇洗脱液，将乙醇洗脱液蒸发回收乙醇，剩余残余液体，并将残余液体在50～60℃下浓缩干燥，得到固体混合物。

第七步：将固体混合物进行酶解：

按照液固比为10～15ml/g的比例，将水加入到所述的固体混合物中，并采用浓度为0.5M～2M的盐酸调节pH值为5～5.5，再向其中加入浓度为5～7％复合酶，搅拌，在温度为45～50℃下保温8～15h后，加热至沸腾(一股为95～100℃)3～10min后离心处理，得到上清液B。

所述的复合酶优选为β-葡聚糖酶(100U/mg)、糖化酶(20U/mg)和α-淀粉酶(20U/mg)的混合物，其混合的质量比为1∶1∶1。

第八步：上清液B酸沉：

用浓度为4M～6M的盐酸调节上清液B的pH值小于等于2，室温静置20～40min，上清液B中出现悬浮物。将上清液B放入离心机，在转速为4000～5000r/min下离心分离10～20min后，得到上清液C和沉淀物。所述的悬浮物为离心处理后得到的沉淀物。

第九步：制备柠檬苦素：

将得到的沉淀物用水洗至pH＝6.5～7.0，在真空干燥箱中真空干燥，压力0.08～0.09MPa，温度45℃～55℃，得到干燥物。按照液固比为8～10ml/g的比例，向干燥物中加入二氯甲烷(分析纯)将干燥物溶解，得到二氯甲烷溶解液，再向二氯甲烷溶解液中加入异丙醇(分析纯)，-20～-10℃放置0.5～2小时，4000～5000r/min离心10～15min，得到沉淀为晶体A，上清液为母液A，所述的二氯甲烷溶解液与异丙醇的体积比为1∶2～1∶4。所述的晶体A在真空干燥箱中真空干燥，压力0.08～0.09MPa，温度45℃～55℃真空干燥得到柠檬苦素粗品。所述的柠檬苦素粗品先使用碱溶液B洗去色素，再用蒸馏水洗将柠檬苦素粗品洗至其pH值为6.5～7.0，得到柠檬苦素。所述的碱溶液B优选为pH值为10～12的NaOH溶液。

本发明还提出的一种从桔核中提取柠檬苦素酸性甙元的方法，具体为：

将第八步中离心得到的上清液C进行减压干燥，减压干燥条件为压力为0.08～0.09MPa、温度为60℃～80℃，得到柠檬苦素酸性甙元粗品，再利用甲醇(分析纯)萃取后，将萃取液于40～45℃蒸发收集甲醇，得到柠檬苦素酸性甙元。

本发明还提出的一种从桔核中提取诺米林和柠檬苦素中性甙元(不包含诺米林和柠檬苦素)的方法，具体为：

将第九步的母液A蒸干得到干燥物，按照液固比为15～20ml/g的比例，向干燥物中加入甲醇(分析纯)，然后于-20～-10℃静置0.5～2h，4000～5000r/min离心10～15min，得到的沉淀为晶体B，上清液为母液B，所述的晶体B为诺米林。

将母液B蒸发干燥后，得到柠檬苦素中性甙元粗品，按照液固比为8～12ml/g的比例将碱溶液B加入柠檬苦素中性甙元粗品中，并加温至50～60℃使柠檬苦素中性甙元粗品溶解于碱溶液中，再利用浓度为4～6M的盐酸调节该溶液的pH为酸性(一股为pH值小于等于2)后，离心处理，将得到的沉淀水洗至pH值为6.5～7.0，干燥得到柠檬苦素中性甙元(不包含诺米林和柠檬苦素)。所述的碱溶液B优选为pH值为10～12的NaOH溶液。

本发明具有的优点在于：

1、本发明提出的一种从桔核中提取活性成分的方法，通过采用超临界二氧化碳萃取的方法提取桔油，获得高质量的桔油。

2、本发明提出的一种从桔核中提取活性成分的方法，通过闪式提取器进行匀浆处理，与传统提取方法相比，该方法提取条件温和，提取时间短，仅1～3分钟，溶剂用量少，提取效率高。

3、本发明提出的一种从桔核中提取活性成分的方法，以弱碱溶液取代有机溶剂作为提取溶剂，规避了有机溶剂提取造成的易燃易爆问题，同时大大降低了生产成本，减少了环境的污染。

4、本发明提出的一种从桔核中提取活性成分的方法，在层析前，对上清液A进行超滤处理，清除了植物大分子蛋白，减轻了后续吸附时压力，使树脂的用量减少60％。

5、本发明提出的一种从桔核中提取多种活性成分的方法，在层析时选用大孔树脂XAD16作为填料进行吸附，该树脂吸附的特异性强，用量少，保证了产品的纯度和产率。

6、本发明提出的一种从桔核中提取活性成分的方法，从废弃的桔核中提取柠檬苦素、柠檬苦素酸性甙元、诺米林和柠檬苦素中性甙元(不包含柠檬苦素和诺米林)的纯度高，产率高，综合利用桔核，避免资源的浪费，降低了成本，提高了桔农和果汁生产企业的经济效益。

附图说明

图1：本发明提出的一种从桔核中提取活性成分的方法的工艺流程图；

图2：柠檬苦素标准品的高效液相色谱图；

图3：利用本发明提出的一种从桔核中提取活性成分的方法得到的柠檬苦素高效液相色谱图。

具体实施方式

本发明提出的一种从桔核中提取活性成分的方法，如图1所示，具体包括以下步骤：

第一步：桔核粉碎后提取桔油：

第二步：去油桔核残渣进行浸泡及匀浆处理：

第三步：将匀浆液进行离心分离处理：

第四步：对上清液A进行超滤处理：

将上清液A利用超滤器进行超滤处理，收集得到滤液，使用的滤膜的截留分子量为6000～10000。

第五步：将滤液进行层析：

第六步：层析柱进行洗脱处理：

第七步：将固体混合物进行酶解：

按照液固比为10～15ml/g的比例，将水加入到所述的固体混合物中，并采用浓度为0.5M～2M的盐酸调节pH值为5～5.5，再向其中加入浓度为5～7％复合酶，搅拌，在温度为45-50℃下保温8～15h后，加热至沸腾(一股为95～100℃)3～10min后离心处理，得到上清液B。

第八步：上清液B酸沉：

用浓度为4M～6M的盐酸调节上清液B的pH值小于等于2，室温静置20～40min，上清液B中出现悬浮物。将含有悬浮物的上清液B放入离心机，在转速为4000～5000r/min下离心分离10～20min后，得到上清液C和沉淀物。所述的悬浮物为离心处理后得到的沉淀物。

第九步：制备柠檬苦素：

将第八步中离心得到的沉淀物用水洗至pH＝6.5～7.0，在真空干燥箱中真空干燥，压力0.08～0.09MPa，温度45℃～55℃，得到干燥物。按照液固比为8～10ml/g的比例，向干燥物中加入二氯甲烷(分析纯)将干燥物溶解，得到二氯甲烷溶解液，再向二氯甲烷溶解液中加入异丙醇(分析纯)，-20～-10℃放置0.5～2小时，析出晶体A，剩余母液A，所述的二氯甲烷溶解液与异丙醇的体积比为1∶2～1∶4。所述的晶体A在真空干燥箱中真空干燥，压力0.08～0.09MPa，温度45℃～55℃真空干燥得到柠檬苦素粗品。所述的柠檬苦素粗品先使用碱溶液B洗去色素，再用蒸馏水洗将柠檬苦素粗品洗至其pH值为6.5～7.0，得到柠檬苦素。所述的碱溶液B优选为pH值为10～12的NaOH溶液。

本发明提出的一种从桔核中提取柠檬苦素酸性甙元的方法，具体为：

本发明提出的一种从桔核中提取诺米林和制柠檬苦素中性甙元(所述的柠檬苦素中性甙元不包含柠檬苦素和诺米林)的方法，具体为：

将母液B蒸发干燥后，得到柠檬苦素中性甙元粗品，按照液固比为8～12ml/g的比例将碱溶液B加入柠檬苦素中性甙元粗品中，并加温至50～60℃使柠檬苦素中性甙元粗品溶解于碱溶液中，再利用浓度为4～6M的盐酸调节该溶液的pH为酸性(一股为pH值小于等于2)后，离心处理，将得到的沉淀水洗至pH值为6.5～7.0，干燥后得到柠檬苦素中性甙元(不包含柠檬苦素和诺米林)。所述的碱溶液B优选为pH值为10～12的NaOH溶液。

利用本发明提出的一种从桔核中提取活性成分的方法所得到的桔油的产率为41～45％；获得的活性成分柠檬苦素的产率为0.62～0.65％，纯度为98～100％；柠檬苦素酸性甙元的产率为0.49～0.53％，纯度为35～37％；诺米林的产率为0.085～0.11％，纯度94～97％；柠檬苦素中性甙元(不包括柠檬苦素和诺米林)的产率为0.42～0.46％，纯度为83～86％。

利用本发明提出的一种从桔核中提取活性成分的方法，所得到的柠檬苦素的样品的高效液相色谱图如图3所示，样品中主峰的保留时间为7.2min，与柠檬苦素标准品(标准品的高效液相色谱图如图2)中的主峰保留时间一致，可以确定本发明第十步所获得的产品为柠檬苦素。

实施例1：

一种从桔核中提取有效成分的方法，具体包括以下步骤：

第一步：桔核粉碎后提取桔油：

将42.74g桔核粉碎至60目后加入至超临界二氧化碳提取器内提取桔油，设置二氧化碳气体压力为30MPa，提取温度为48℃，提取时间为1.5小时，得到桔油17.74g和去油桔核残渣24.98g。

第二步：去油桔核残渣进行浸泡及匀浆处理：

按照液固比为10ml/g的比例，利用蒸馏水浸泡去油桔核残渣，并用浓度为3M的NaOH溶液调整pH值为8，在温度为80℃下浸泡0.5h后，采用闪式提取器进行匀浆处理，转速为3500r/min搅拌破碎3min后，得到匀浆液。

第三步：将匀浆液进行离心分离处理：

将匀浆液放置于离心机中，在转速5000r/min下离心分离10min，得到上清液A。

第四步：对上清液A进行超滤处理：

将上清液A利用超滤器进行超滤处理，使用的滤膜的截留分子量为6000，收集得到滤液。

第五步：将滤液进行层析：

利用浓度为0.5M的盐酸调整滤液的pH值为3.8，并利用层析柱对该滤液中的活性成分进行吸附，用去离子水冲洗层析柱至下柱液为无色，得到吸附有活性成分的层析柱。所述的层析柱的填料为XAD16型大孔吸附树脂。

第六步：层析柱进行洗脱处理：

用浓度为60％的乙醇溶液对吸附有活性成分的层析柱进行洗脱处理，洗脱用量为：乙醇溶液与吸附有活性成分的层析柱的体积比为5∶1的比例。收集得到乙醇洗脱液，将乙醇洗脱液蒸发回收乙醇，剩余残余液体，并将残余液体在60℃下浓缩干燥，得到固体混合物。

第七步：将固体混合物进行酶解：

按照液固比为10ml/g的比例，将水加入到所述的固体混合物中，并采用浓度为0.5M的盐酸调节pH值为5，再向其中加入浓度为5％复合酶，搅拌，在温度为45℃下保温15h后，加热至沸腾(100℃)3min后离心处理，得到上清液B。

所述的复合酶为β-葡聚糖酶(100U/mg)、糖化酶(20U/mg)和α-淀粉酶(20U/mg)的混合物，其混合的质量比为1∶1∶1。

第八步：上清液B酸沉：

用浓度为6M的盐酸调节上清液B的pH值为0.5，室温静置20min，上清液B中出现悬浮物。将上清液B放入离心机，在转速为4000r/min下离心分离10min后，得到上清液C和沉淀物。所述的悬浮物为离心处理后得到的沉淀物。

第九步：制备柠檬苦素：

将第八步中离心得到的沉淀物用水洗至pH值为6.5，在真空干燥箱中真空干燥，压力0.08MPa，温度45℃，得到干燥物。按照液固比为8ml/g的比例，向干燥物中加入二氯甲烷将干燥物溶解，得到二氯甲烷溶解液，再向二氯甲烷溶解液中加入异丙醇，其中二氯甲烷溶解液与异丙醇的体积比为1∶2，-20℃放置0.5小时，析出晶体A，剩余母液A。所述的晶体A在真空干燥箱中真空干燥，压力0.08MPa，温度45℃真空干燥得到柠檬苦素粗品。所述的柠檬苦素粗品先使用pH值为10的NaOH溶液洗去色素，再用蒸馏水洗将柠檬苦素粗品洗至其pH值为7.0，得到柠檬苦素0.27g。

实施例2：

本实施例与实施例1的区别在于：包括制备柠檬苦素酸性甙元的过程，具体为：

将第八步离心得到的上清液C进行减压干燥，减压干燥条件为压力为0.08MPa，温度为80℃，得到柠檬苦素酸性甙元粗品，再利用甲醇萃取后，于40℃蒸发回收甲醇，得萃取物即柠檬苦素酸性甙元0.21g。

实施例3：

本实施例与实施例2的区别在于：还包括制备诺米林和柠檬苦素中性甙元的步骤，具体为：

将第九步的母液A蒸干得到干燥物，按照液固比为15ml/g的比例，向干燥物中加入甲醇(分析纯)，然后于-20℃静置0.5h，4000r/min离心10min，得到的沉淀为晶体B，上清液为母液B，所述的晶体B为诺米林0.036g。。

将母液B蒸发干燥后，得到柠檬苦素中性甙元粗品，按照液固比为8ml/g的比例将pH值为10的NaOH加入柠檬苦素中性甙元粗品中，并加温至60℃使柠檬苦素中性甙元粗品溶解于pH值为10的NaOH溶液中，再利用浓度为4M的盐酸调节该溶液的pH为1.5后，离心处理，将得到的沉淀水洗至pH值为7.0，干燥得到不包含柠檬苦素和诺米林的柠檬苦素中性甙元0.18g。

利用本实施例得到的桔油的产率为41.5％；柠檬苦素的产率为0.62％；柠檬苦素酸性甙元的产率为0.49％；诺米林的产率为0.085％，柠檬苦素中性甙元(不包含柠檬苦素和诺米林)的产率为0.43％。

实施例4：

第一步：桔核粉碎后提取桔油：

将85g桔核粉碎至75目后加入至超临界二氧化碳提取器内提取桔油，设置二氧化碳气体压力为32MPa，提取温度为45℃，提取时间为2小时，得到桔油35.47g和去油桔核残渣49.53g。

第二步：去油桔核残渣进行浸泡及匀浆处理：

按照液固比为20ml/g的比例，利用蒸馏水浸泡去油桔核残渣，并用浓度为4M的NaOH溶液调整pH值为11.5，在温度为60℃下浸泡2h后，采用闪式提取器进行匀浆处理，转速为5500r/min搅拌破碎1min后，得到匀浆液。

第三步：将匀浆液进行离心分离处理：

将匀浆液放置于离心机中，在转速4000r/min下离心分离20min，得到上清液A。

第四步：对上清液A进行超滤处理：

将上清液A利用超滤器进行超滤处理，使用的滤膜的截留分子量为10000，收集得到滤液。

第五步：将滤液进行层析：

利用浓度为2M的盐酸调整滤液的pH值为4.4，并利用层析柱对该滤液中的活性成分进行吸附，用去离子水冲洗层析柱至下柱液为无色，得到吸附有活性成分的层析柱。所述的层析柱的填料为XAD16型大孔吸附树脂。

第六步：层析柱进行洗脱处理：

用浓度为85％的乙醇溶液对吸附有活性成分的层析柱进行洗脱处理，洗脱用量为：乙醇溶液与吸附有活性成分的层析柱的体积比为3∶1的比例。收集得到乙醇洗脱液，将乙醇洗脱液蒸发回收乙醇，剩余残余液体，并将残余液体在50℃下浓缩干燥，得到固体混合物。

第七步：将固体混合物进行酶解：

按照液固比为15ml/g的比例，将水加入到所述的固体混合物中，并采用浓度为2M的盐酸调节pH值为5.5，再向其中加入浓度为7％复合酶，搅拌，在温度为50℃下保温8h后，加热至沸腾，10min后离心处理，得到上清液B。

第八步：上清液B酸沉

用浓度为4M的盐酸调节上清液B的pH值等于2，室温静置40min，上清液B中出现悬浮物。将上清液B放入离心机，在转速为5000r/min下离心分离20min后，得到上清液C和沉淀物。所述的悬浮物为离心处理后得到的沉淀物。

第九步：制柠檬苦素

将离心得到的沉淀物用水洗至pH为7.0，在真空干燥箱中真空干燥，压力0.09MPa，温度55℃，得到干燥物。按照液固比为10ml/g的比例，向干燥物中加入二氯甲烷将干燥物溶解，得到二氯甲烷溶解液，再向二氯甲烷溶解液中加入异丙醇，其中二氯甲烷溶解液与异丙醇的体积比为1∶4，-10℃放置2小时，析出晶体A，剩余母液A。所述的晶体A在真空干燥箱中真空干燥，压力0.09MPa，温度55℃真空干燥得到柠檬苦素粗品。所述的柠檬苦素粗品先使用pH值为12的NaOH溶液洗去色素，再用蒸馏水洗将柠檬苦素粗品洗至其pH＝6.5，得到柠檬苦素0.54g。

第十步：制备柠檬苦素酸性甙元

将第八步离心得到上清液C进行减压干燥，减压干燥条件为压力为0.09MPa，温度为60℃，得到柠檬苦素酸性甙元粗品，再利用甲醇萃取后，于45℃蒸发回收甲醇，得萃取物即柠檬苦素酸性甙元0.43g。

第十一步：制诺米林

将第九步的母液A蒸干得到干燥物，按照液固比为20ml/g的比例，向干燥物中加入甲醇(分析纯)，然后于-10℃静置2h，5000r/min离心15min，得到的沉淀为晶体B，上清液为母液B，所述的晶体B为诺米林0.085g。

第十二步：制柠檬苦素中性甙元

将母液B蒸发干燥后，得到柠檬苦素中性甙元粗品，按照液固比为12ml/g的比例将pH值为12的NaOH溶液加入柠檬苦素中性甙元粗品中，并加温至50℃使柠檬苦素中性甙元粗品溶解于NaOH溶液中，再利用浓度为6M的盐酸调节该溶液的pH为2后，离心处理，将得到的沉淀水洗至pH值为6.5，干燥得到柠檬苦素中性甙元(不包含柠檬苦素和诺米林)0.38g。

本实施例中得到的桔油的产率为41％，得到的活性成分：柠檬苦素的产率为0.64％，柠檬苦素酸性甙元的产率为0.49％，诺米林的产率为0.1％，不包含柠檬苦素和诺米林的柠檬苦素中性甙元的产率为0.45％。

实施例5：

第一步：桔核粉碎后提取桔油：

将128g桔核粉碎至90目加入至超临界二氧化碳提取器内提取桔油，设置二氧化碳气体压力为31MPa，提取温度为47℃，提取时间为1.6小时，得到桔油57.2g和去油桔核残渣70.8g。

第二步：去油桔核残渣进行浸泡及匀浆处理：

按照液固比为15ml/g的比例，利用蒸馏水浸泡去油桔核残渣，并用浓度为5M的NaOH溶液调整pH值为10，在温度为70℃下浸泡1h后，采用闪式提取器进行匀浆处理，转速为4000r/min搅拌破碎2min后，得到匀浆液。

第三步：将匀浆液进行离心分离处理：

将匀浆液放置于离心机中，在转速4500r/min下离心分离15min，得到上清液A。

第四步：对上清液A进行超滤处理：

将上清液A利用超滤器进行超滤处理，使用的滤膜的截留分子量为8000，收集得到滤液。

第五步：将滤液进行层析：

利用浓度为1M的盐酸调整滤液的pH值为4.0，并利用层析柱对该滤液中的活性成分进行吸附，用去离子水冲洗层析柱至下柱液为无色，得到吸附有活性成分的层析柱。所述的层析柱的填料XAD16型大孔吸附树脂。

第六步：层析柱进行洗脱处理：

用浓度为70％的乙醇溶液对吸附有活性成分的层析柱进行洗脱处理，洗脱用量为：乙醇溶液与吸附有活性成分的层析柱的体积比为4∶1的比例。收集得到乙醇洗脱液，将乙醇洗脱液蒸发回收乙醇，剩余残余液体，并将残余液体在55℃下浓缩干燥，得到固体混合物。

第七步：将固体混合物进行酶解：

按照液固比为12ml/g的比例，将水加入到所述的固体混合物中，并采用浓度为1M的盐酸调节pH值为5.3，再向其中加入浓度为6％复合酶，搅拌，在温度为48℃下保温10h后，加热至沸腾(100℃)5min后离心处理，得到上清液B。

第八步：上清液B酸沉

用浓度为5M的盐酸调节上清液B的pH值等于1，室温静置30min，上清液B中出现悬浮物。将上清液B放入离心机，在转速为4500r/min下离心分离15min后，得到上清液C和沉淀物。所述的悬浮物为离心处理后得到的沉淀物。

第九步：制备柠檬苦素

将得到的沉淀物用水洗至pH＝6.8，在真空干燥箱中真空干燥，压力0.085MPa，温度47℃，得到干燥物。按照液固比为9ml/g的比例，向干燥物中加入二氯甲烷(分析纯)将干燥物溶解，得到二氯甲烷溶解液，再向二氯甲烷溶解液中加入异丙醇(分析纯)，-15℃放置1小时，析出晶体A，剩余母液A，所述的二氯甲烷溶解液与异丙醇的体积比为1∶3。所述的晶体A在真空干燥箱中真空干燥，压力0.085MPa，温度48℃真空干燥得到柠檬苦素粗品。所述的柠檬苦素粗品先使用pH值为11的NaOH溶液洗去色素，再用蒸馏水洗将柠檬苦素粗品洗至其pH值为6.8，得到柠檬苦素0.83g。

第十步：制备柠檬苦素酸性甙元

将第八步中离心得到的上清液C进行减压干燥，减压干燥条件为压力为0.085MPa，温度为70℃，得到柠檬苦素酸性甙元粗品，再利用甲醇萃取后，于42℃蒸发回收甲醇，得萃取物即柠檬苦素酸性甙元0.68g。

第十一步：制备诺米林

将第九步的母液A蒸干得到干燥物，按照液固比为20ml/g的比例，向干燥物中加入甲醇(分析纯)，然后于-10℃静置1h，4500r/min离心10min，得到的沉淀为晶体B，上清液为母液B，所述的晶体B为诺米林诺米林0.14g。

第十二步：制备柠檬苦素中性甙元

将母液B蒸发干燥后，得到柠檬苦素中性甙元粗品，按照液固比为10ml/g的比例将pH值为11的NaOH溶液加入柠檬苦素中性甙元粗品中，并加温至55℃使柠檬苦素中性甙元粗品溶解于该NaOH溶液中，得到混合溶液，再利用浓度为5M的盐酸调节该溶液的pH为酸性(pH值为1.5)后，离心处理，将得到的沉淀水洗至pH＝6.8，干燥得柠檬苦素中性甙元(不包含柠檬苦素和诺米林)0.59g。

本实施例得到的桔油的产率为43.7％；得到的活性成分：柠檬苦素的产率为0.65％，柠檬苦素酸性甙元的产率为0.53％，诺米林的产率为0.11％，柠檬苦素中性甙元(不包含柠檬苦素和诺米林)的产率为0.46％。

Claims

1.一种从桔核中提取活性成分的方法，其特征在于：包括以下步骤：

第一步：桔核粉碎后提取桔油：

将桔核粉碎后加入至超临界二氧化碳提取器内提取桔油，得到桔油和去油桔核残渣；

第二步：去油桔核残渣进行浸泡及匀浆处理：

按照液固比为10～20ml/g的比例，利用蒸馏水浸泡去油桔核残渣，并用碱溶液A调整pH值为8～11.5，在温度为60～80℃下浸泡后，采用闪式提取器进行匀浆处理后，得到匀浆液；所述的碱溶液A为浓度3～5M的NaOH溶液；

第三步：将匀浆液进行离心分离处理后，分离得到上清液A；

第四步：对上清液A进行超滤处理，收集得到滤液；

第五步：将滤液进行层析：

利用盐酸调整滤液的pH值为3.8～4.4，并利用层析柱对该滤液中的活性成分进行吸附，用去离子水冲洗层析柱至下柱液为无色后，得到吸附有活性成分的层析柱；

第六步：层析柱进行洗脱处理：

用乙醇溶液对吸附有活性成分的层析柱进行洗脱处理，乙醇溶液与吸附有活性成分的层析柱的体积比为3∶1～5∶1的比例，收集得到乙醇洗脱液，将乙醇洗脱液蒸发回收乙醇，剩余残余液体，并将残余液体浓缩干燥，得到固体混合物；

第七步：将固体混合物进行酶解：

按照液固比为10～15ml/g的比例，将水加入到固体混合物中，并利用盐酸调节pH值为5～5.5后，向其中加入浓度为5～7％复合酶，搅拌，在温度为45～50℃下保温8～15h后，加热至沸腾后离心处理，得到上清液B；

第八步：上清液B酸沉

用盐酸调节上清液B的pH值小于等于2，室温静置，上清液B中出现悬浮物，将上清液B放入离心机中离心分离，得到上清液C和沉淀物；

第九步：制柠檬苦素

将沉淀物用水洗至pH＝6.5～7.0，在真空干燥箱中真空干燥，得到干燥物；按照液固比为8～10ml/g的比例，向干燥物中加入二氯甲烷将干燥物溶解，得到二氯甲烷溶解液，再向二氯甲烷溶解液中加入异丙醇，静置后离心，得到晶体A和母液A，所述的二氯甲烷溶解液与异丙醇的体积比为1∶2～1∶4；所述的晶体A在真空干燥箱中真空干燥，得到柠檬苦素粗品；所述的柠檬苦素粗品先使用碱溶液B洗去色素，再用蒸馏水将柠檬苦素粗品洗至pH值为6.5～7.0，得到柠檬苦素；所述的碱溶液B为pH值为10～12的NaOH溶液。

2.根据权利要求1所述的一种从桔核中提取活性成分的方法，其特征在于：所述的第一步超临界二氧化碳提取器提取桔油条件为：二氧化碳气体压力为30～32MPa，提取温度为45～48℃，提取时间为1.5～2小时。

3.根据权利要求1所述的一种从桔核中提取活性成分的方法，其特征在于：所述的第四步超滤处理使用的滤膜的截留分子量为6000～10000。

4.根据权利要求1所述的一种从桔核中提取活性成分的方法，其特征在于：所述的第五步的层析柱的填料为非极性大孔树脂。

5.根据权利要求4所述的一种从桔核中提取活性成分的方法，其特征在于：所述的非极性大孔树脂为XAD16型大孔吸附树脂。

6.根据权利要求1所述的一种从桔核中提取活性成分的方法，其特征在于：所述的复合酶为β-葡聚糖酶、糖化酶和α-淀粉酶的混合物，质量比为1∶1∶1。

7.根据权利要求1所述的一种从桔核中提取活性成分的方法，其特征在于：所述的第九步中真空干燥的条件为0.08～0.09MPa，温度45℃～55℃。

8.一种从桔核中提取柠檬苦素酸性甙元的方法，其特征在于：具体包括以下几个步骤：

第一步：桔核粉碎后提取桔油：

第二步：去油桔核残渣进行浸泡及匀浆处理：

第三步：将匀浆液进行离心分离处理后，分离得到上清液A；

第四步：对上清液A进行超滤处理，收集得到滤液；

第五步：将滤液进行层析：

第六步：层析柱进行洗脱处理：

第七步：将固体混合物进行酶解：

第八步：上清液B酸沉

用盐酸调节上清液B的pH值小于等于2，室温静置，上清液B中出现悬浮物，将上清液B放入离心机中离心分离，得到上清液C和沉淀物；将得到的上清液C进行减压干燥，得到柠檬苦素酸性甙元粗品，再利用甲醇萃取后，蒸发回收甲醇，得到萃取物为柠檬苦素酸性甙元。

9.一种从桔核中提取诺米林和柠檬苦素中性甙元的方法，其特征在于：具体包括以下几个步骤：

第一步：桔核粉碎后提取桔油：

第二步：去油桔核残渣进行浸泡及匀浆处理：

第三步：将匀浆液进行离心分离处理后，分离得到上清液A；

第四步：对上清液A进行超滤处理，收集得到滤液；

第五步：将滤液进行层析：

第六步：层析柱进行洗脱处理：

第七步：将固体混合物进行酶解：

第八步：上清液B酸沉

第九步：制柠檬苦素

将沉淀物用水洗至pH＝6.5～7.0，在真空干燥箱中真空干燥，得到干燥物；按照液固比为8～10ml/g的比例，向干燥物中加入二氯甲烷将干燥物溶解，得到二氯甲烷溶解液，再向二氯甲烷溶解液中加入异丙醇，静置后离心，得到晶体A和母液A，所述的二氯甲烷溶解液与异丙醇的体积比为1∶2～1∶4；所述的晶体A在真空干燥箱中真空干燥，得到柠檬苦素粗品；所述的柠檬苦素粗品先使用碱溶液B洗去色素，再用蒸馏水将柠檬苦素粗品洗至pH值为6.5～7.0，得到柠檬苦素；所述的碱溶液B为pH值为10～12的NaOH溶液；将母液A蒸干得到干燥物，按照液固比为15～20ml/g的比例，向干燥物中加入甲醇，静置后离心，得到晶体B和母液B，所述的晶体B为诺米林；将母液B蒸发干燥后，得到柠檬苦素中性甙元粗品，按照液固比为8～12ml/g的比例将碱溶液B加入柠檬苦素中性甙元粗品中，并加温使柠檬苦素中性甙元粗品溶解于碱溶液B中，再利用盐酸调节该溶液的pH为酸性后，离心处理，得到沉淀，将沉淀水洗至pH＝6.5～7.0，干燥后得到不包含柠檬苦素和诺米林的柠檬苦素中性甙元，碱溶液B为pH值为10～12的NaOH溶液。

10.根据权利要求9所述的一种从桔核中提取诺米林和柠檬苦素中性甙元的方法，其特征在于：第九步所述的减压干燥条件为压力为0.08～0.09MPa，温度为60℃～80℃。