CN102944623A

CN102944623A - 一种金柑中柠檬苦素和诺米林的测定方法

Info

Publication number: CN102944623A
Application number: CN2012104726649A
Authority: CN
Inventors: 郑宝东; 张怡; 孟鹏; 卢旭; 曾绍校
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2012-11-21
Filing date: 2012-11-21
Publication date: 2013-02-27

Abstract

本发明公开了一种利用超高效液相色谱快速测定金柑中柠檬苦素和诺米林的测定方法，属于化学分析检测领域。该方法将金柑果实去籽，45℃热风烘干至恒重，粉碎过40目筛，制得金柑粉末。称取5.0g粉末置于烧瓶中，加入100mL二氯甲烷，50℃超声波提取1h。提取液抽滤后取滤液，50℃真空旋转蒸发至干，乙腈溶解残渣并定容至100mL，混匀，经0.22μm滤膜过滤得清液，采用超高效液相色谱分析。该方法提取方法简单、操作简便、灵敏度高、重现性好，可同时快速测定金柑中柠檬苦素和诺米林的含量。本发明具有高效、合理、准确和重复性好等特点，适用于金柑中柠檬苦素和诺米林的微量分析。

Description

一种金柑中柠檬苦素和诺米林的测定方法

技术领域

本发明涉及一种金柑中柠檬苦素和诺米林的测定方法，属于化学分析检测领域。

背景技术

金柑(Fortunella crassifolia Swingle)也称金橘、金实、柑子、山橘、卢橘、四季橘，是芸香科、柑橘亚科、金柑属植物, 为福建省特色水果之一。尤溪县是福建省金柑主产区，也是我国金柑五大产区之一，2007年尤溪金柑获得国家地理标志产品保护。近年来，金柑果实因其营养丰富，风味独特，已渐渐被消费者接受。金柑鲜食通常无苦味，但经榨汁、杀菌等加工处理后就表现出苦味，这种现象称之为“延迟苦味”。金柑汁出现“延迟苦味”的原因主要是在酸性条件和柠檬苦素D环内酯水解酶的催化下，果实中所存在的非苦味的柠檬苦素A-环内酯转变成了具有强烈苦味的柠檬苦素类化合物所造成。

柠檬苦素类化合物是一类高度氧化的四环三萜类植物次生代谢产物，主要存在于芸香科和楝科的植物组织中。金柑中含有较多柠檬苦素(Limonin)和诺米林(Nomilin)，这2种苷元是引起金柑汁苦味的主要原因之一。据报道，有强烈苦味的柠檬苦素和诺米林在果汁中含量超过6mg/L，那么果汁就不适合饮用。据相关研究报道，柠檬苦素在水溶液中的苦味阈值约为6mg/L，比柚皮苷要苦20倍。

由于金柑中柠檬苦素类化合物等苦味物质的存在，大大影响了金柑加工产品的口感，限制了金柑的深加工和消费者的需求。柠檬苦素含量的高低直接影响金柑及其产品的品质，测定柠檬苦素的含量有利于控制金柑及其相关产品的质量。

这些苦味物质虽影响金柑产品的口感，但具有抗菌、抗病毒、抗氧化和抗肿瘤等功能，应用价值很高。因此建立一种可靠的分析方法，分析金柑中柠檬苦素和诺米林的含量变化，不仅有利于金柑产品的深加工，也有利于开发利用金柑中的苦味物质。

目前，柠檬苦素的提取方法主要有结晶分离法、索氏提取法、超临界流体萃取法、树脂吸附法、微波消解法和超声波法等。其中超声波法提取是一种新兴的提取技术，此方法快速、高效，尤其适于易挥发、低沸点的有效成分提取。

研究金柑中的苦味物质，需要一种能精确定量金柑苦味物质的分析方法。已报道的检测方法很多，主要有HPLC法、Davis法、TLC法、UV法、RIA法等。以上方法中Davis法测定的步骤繁琐，UV法仅适用于对柠檬苦素类化合物总量的测定，TLC法因依靠目测进行定量，测试结果误差较大，RIA法检测不仅需用到昂贵的计数器，而且还存在放射性保护和废物处理等问题。目前多采用HPLC法检测柠檬苦素类化合物，但是由于水果与果汁中柠檬苦素类化合物含量常超越该方法的线性范围和检出限，测定结果有误差。同时相同流速下分析时间较长，通常为十几分钟，消耗流动相。

随着色谱柱填料技术的发展，超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)技术比传统的HPLC技术具有更高的分离能力，大大改善了分析速度、灵敏度和分离度。目前，对于应用超高效液相色谱法同时测定金柑中柠檬苦素和诺米林的方法未见文献报道及专利公开。本方法旨在建立UPLC同时测定金柑中柠檬苦素和诺米林的分析方法，以实现柠檬苦素类化合物快速、准确的检测，以丰富柠檬苦素类化合物的检测手段。

发明内容

本发明目的为提供一种超高效液相色谱技术快速测定金柑中柠檬苦素和诺米林的定量分析方法，该方法提取方法简单、操作简便、灵敏度高、重现性好，可同时快速测定金柑中柠檬苦素和诺米林的含量。

本发明的技术方案如下：

利用超高效液相色谱快速测定金柑中柠檬苦素和诺米林的方法，步骤如下：将金柑果实去籽，45℃热风烘干至恒重，粉碎过40目筛，制得金柑粉末；称取5.0g金柑粉末置于烧瓶中，加入100mL二氯甲烷，50℃超声波提取1h，提取液抽滤后取滤液，50℃真空旋转蒸发至干，乙腈溶解残渣并定容至100mL，经0.22μm滤膜过滤得清液，采用超高效液相色谱分析，测定金柑中柠檬苦素和诺米林的含量；超高效液相色谱的分析条件为： ACQUITY UPLC BEH C₁₈规格为2.1mm×100 mm、1.7μm 的色谱柱，流动相为体积比45∶55的乙腈--水，柱温为：35℃，流速为：0.3mL/min，进样量：2μL，检测波长为：215nm。

所述超高效液相色谱的检测器为：PDA检测器。

所述金柑果实应挑选无病虫害、无霉变、无腐烂的金柑果实作为加工原料。

本发明的优点为：

(1) 本发明建立了一种同时检测柠檬苦素和诺米林的分析方法，操作简便、步骤较少。本发明通过优化色谱条件，使柠檬苦素和诺米林浓度范围分别为1～1780μg/mL和1～1720μg/mL时与色谱峰面积具有良好线性关系，满足在日常检测中柑橘类水果的柠檬苦素和诺米林的检测要求，克服了传统高效液相色谱对柠檬苦素和诺米林检测范围较低的不足。

(2)本发明采用了超高效液相色谱技术有效减少了分析时间、节省了流动相用量。将常规液相色谱分析所需的几十分钟时间缩短为几分钟，流动相的消耗量不及传统方法的十分之一。在保证分离度的同时，降低了分析成本，提高了分析效率。

(3)本发明的柠檬苦素的加标回收率在97.19～100.06%之间，相对标准偏差（RSD）为0.74~2.25%；诺米林的加标回收率在95.35～99.83%之间，相对标准偏差（RSD）为0.80~3.36%；方法的重复性较高，准确性较好。

附图说明

图1为柠檬苦素与诺米林的紫外扫描吸收图；其中图1（a）为柠檬苦素的紫外扫描吸收图，图1（b）为诺米林的紫外扫描吸收图。

图2为标准品和提取样品的UPLC色谱图；其中图2（a）为标准品中柠檬苦素、诺米林的UPLC色谱图，峰1：柠檬苦素，峰2：诺米林；图2（b）为提取样品中柠檬苦素、诺米林的UPLC色谱图，峰1：柠檬苦素，峰2：诺米林。

图3为UPLC标准工作曲线；其中图3（a）为柠檬苦素的UPLC标准工作曲线，图3（b）为诺米林的UPLC标准工作曲线。

具体实施方式

通过以下具体实施步骤，进一步描述本发明，但是实施例仅用于说明，并不能限制本发明的范围。

测试仪器与色谱条件

ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；色谱柱型号：ACQUITY UPLC^TM BEH C₁₈柱(2.1mm×100 mm，1.7μm，Waters公司，USA)；流动相：乙腈∶水（45∶55）；柱温：35℃；流速：0.3mL/min；进样体积：2μL；检测器：PDA检测器；检测波长：215nm；流动相梯度程序：等度洗脱。

辅助类仪器

高速组织捣碎机（天津市台斯特仪器有限公司，FW135）；超声波振荡器(上海生析超声仪器有限公司，DS-8510 DTH)；高速冷冻离心机(美国贝克曼公司，AvantiJ-E)；分析天平(德国赛多利斯)；旋转蒸发仪（上海亚荣仪器生化厂，RE-52AA）；Milli-Q超纯水纯化系统(美国Millipore公司)；涡旋混合器。

试剂和样品

乙腈（色谱纯）；水为超纯水；二氯甲烷（分析纯）、乙醇（分析纯）；柠檬苦素和诺米林标样，购自SIGMA公司。

标准品与样品的制备

标准溶液配制：分别准确称取柠檬苦素和诺米林标准品0.0178g和0.0172g，用乙腈溶解并定容至10mL。分别配制成含柠檬苦素1.78mg/mL和诺米林1.72mg/mL的标准溶液。

样品制备：将金柑去籽，45℃热风烘干至恒重后，粉碎过40目筛，制得金柑粉末。取粉末5.0g置于烧瓶中，加入100mL二氯甲烷50℃下超声波提取1h。提取液抽滤后取滤液，50℃真空旋转蒸发至干，乙腈溶解残渣并定容至100mL，混匀，经0.22μm滤膜过滤得清液，以用于进样分析。

实施步骤1：超高效液相色谱检测波长的选择

以乙腈为空白，采用PDA检测器在200～400nm 范围内对一定浓度的柠檬苦素和诺米林的标准溶液进行紫外扫描，结果见附图1（a）与1（b）。选择柠檬苦素和诺米林的最大吸收波长—215nm作为此方法的检测波长。

实施步骤2：样品提取溶剂的选择

选择二氯甲烷、乙醇、丙酮三种溶剂50℃水浴提取1h，结果见表1。二氯甲烷提取效果为佳。

表1 不同溶剂对柠檬苦素和诺米林提取效果的影响

Figure 2012104726649100002DEST_PATH_IMAGE001

实施步骤3：样品提取方法的选择

水浴提取法：取金柑粉末5. 0 g 置于烧瓶中，加入100mL 提取溶剂50℃水浴回流提取。

采用二氯甲烷作为提取溶剂，对水浴提取和超声波提取进行了比较。结果见表2。超声波方法提取1h效果为佳。

表2 不同提取方法对柠檬苦素和诺米林提取效果的影响

Figure 2012104726649100002DEST_PATH_IMAGE002

实施步骤4：超高效液相色谱保留值定性

分别以不同比例的乙腈-水为流动相进样，当乙腈体积分数在30～50%时，柠檬苦素和诺米林两种物质能够分离开来，但考虑分析时间、乙腈用量和样品中杂质的干扰等因素，本方法选择体积分数45%乙腈作流动相。该条件下柠檬苦素和诺米林的分离度高，峰形较好，保留时间分别为2.35min和2.97min。柠檬苦素和诺米林的标准品色谱图、样品的色谱图见附图2（a）与2（b）。

实施步骤5：标准曲线的制作

精密吸取柠檬苦素和诺米林标准溶液，用乙腈稀释配制成各浓度的标准系列溶液，在选定的色谱条件下，进样2μL进行色谱分析。分别以柠檬苦素和诺米林的质量浓度（X，μg/mL）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，见附图3（a）与3（b）。得柠檬苦素的回归方程Y=3970X+2080（R²=0.9999）、诺米林的回归方程Y=3490X+4380（R²=0.9999）。该方法在柠檬苦素的浓度范围为1～1780μg/mL、诺米林的线性范围为1～1720μg/mL时具有良好的线性关系。以仪器3倍信噪比（S/N=3，LOD）计算，本方法中柠檬苦素和诺米林的检出限（LOD）分别为1.65μg/mL和1.28μg/mL。

实施步骤6：方法的重复性和回收率测定

称取金柑粉，分别加入一定量的柠檬苦素和诺米林标准溶液，运用所建立的方法，对金柑粉和加标金柑粉进行预处理和色谱分析，结果见表3。柠檬苦素的加标回收率为97.19～100.06%，相对标准偏差（RSD）为0.74~2.25%；诺米林的加标回收率为95.35～99.83%，相对标准偏差（RSD）为0.80~3.36%。

表3 加标回收率测定结果

Figure 2012104726649100002DEST_PATH_IMAGE003

*：平行样品数n=5。

实施步骤7：样品的测定

采用上述UPLC检测方法，对市售的琯溪蜜柚、脐橙、柑橘进行检测，经烘干、粉碎、提取后，进行分析。结果见表4。

表4 不同样品中柠檬苦素和诺米林含量的测定结果（mg/g DW）

Claims

1.一种利用超高效液相色谱快速测定金柑中柠檬苦素和诺米林的方法，其特征在于将金柑果实去籽，45℃热风烘干至恒重，粉碎过40目筛，制得金柑粉末；称取5.0g金柑粉末置于烧瓶中，加入100mL二氯甲烷，50℃超声波提取1h，提取液抽滤后取滤液，50℃真空旋转蒸发至干，乙腈溶解残渣并定容至100mL，经0.22μm滤膜过滤得清液，采用超高效液相色谱分析，测定金柑中柠檬苦素和诺米林的含量；超高效液相色谱的分析条件为： ACQUITY UPLC BEH C₁₈规格为2.1mm×100 mm、1.7μm 的色谱柱，流动相为体积比45∶55的乙腈--水，柱温为：35℃，流速为：0.3mL/min，进样量：2μL，检测波长为：215nm。

2.根据权利要求1所述的一种利用超高效液相色谱快速测定金柑中柠檬苦素和诺米林的方法，其特征在于超高效液相色谱的检测器为：PDA检测器。