CN102659914A - 柠檬苦素类似物及其分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于天然药物提取领域，具体涉及柠檬苦素类似物及其分离纯化方法。本发明所解决的技术问题是提供一种全新的柠檬苦素类似物的分离纯化方法，。本发明分离纯化方法是以橘核、柚核、枳实、陈皮等芸香科柑橘属植物药材为原料，以40～50%乙醇为溶剂提取，提取物采用HPD-722型大孔树脂进行分离纯化，所得固形物中柠檬苦素类似物含量＞80%，柠檬苦素的含量＞20%，诺米林的含量＞40%。本方法提取效率高，操作简单，试剂消耗少，污染少。

Description

柠檬苦素类似物及其分离纯化方法

技术领域

本发明属于天然药物提取领域，具体涉及以橘核、柚核、橙核、枳实、陈皮、枳壳等芸香科柑橘属植物药材为原料，从中得到柠檬苦素类似物的分离纯化方法。

背景技术

柠檬苦素类似物是一类具有高度氧化的四环三萜类植物次生代谢物，广泛存在于芸香科和楝科植物中。柠檬苦素类似物中以柠檬苦素、诺米林的含量较高，具有抗癌、镇痛、消炎、抗焦虑、防止动脉粥样化形成、增强抗氧化能力以及抗菌等作用。

橘核为芸香科植物橘Citrus reticulate Blanco及其栽培变种的干燥成熟种子，柠檬苦素类似物为橘核的主要有效组分，主要存在于橘核的醇溶性提取部位。目前，关于橘核中柠檬苦素类似物纯化路线方面的研究较少。

大孔树脂吸附纯化法具有工艺简单、再生方便、成本低廉等优点，近年来，它已成为分离纯化柠檬苦素类似物常用有效的手段。但不同的树脂类型，吸附条件、解吸条件均对柠檬苦素类似物的分离纯化有重大影响，故发明人针对橘核中柠檬苦素类似物大孔树脂纯化工艺进行了详尽的研究，以期寻找到有效分离纯化柠檬苦素类似物的方法。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种全新的从橘核、柚核、橙核、枳实、陈皮、枳壳等芸香科柑橘属植物药材中分离纯化柠檬苦素类似物的方法。

解决本发明技术问题是通过以下技术方案实现的：提取纯化步骤为：

1）取芸香科柑橘属植物药材，粉碎后先用石油醚（沸点60℃～90℃）脱脂，弃去石油醚，再以40～50%乙醇为溶剂（优选在50~60℃的温度条件下提取）提取，过滤得提取液；

2）提取液采用大孔树脂柱层析法经上样、吸附、洗脱三个步骤进行纯化，收集洗脱液干燥即得纯化后样品。

上述制备方法中：

步骤1）中：石油醚脱脂条件为：粉碎芸香科柑橘属植物药材（为便于粉碎，可先干燥），加石油醚（沸点60℃～90℃）回流脱脂，水浴温度为50～60℃，脱脂时间为4～6h；回流条件为：40～50%乙醇为芸香科柑橘属植物药材重量的6~10倍，提取温度50~60℃，提取时间1～2h。

步骤2）中，所述大孔树脂型号为HPD-722型；上样：提取液配制成浓度为3.5mg/mL～5.5mg/mL的样品溶液，样品溶液pH控制在6.0～7.0的范围内，以1.0～2.0BV/h的流速上样；吸附：上样后静置吸附30min以上，用0.5-1.2BV（1.0BV）的蒸馏水溶液清洗；洗脱：清洗后用6.0～7.0BV、pH值在7.0～8.0范围内的80～90%乙醇溶液以1.5～2.0BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液，干燥即得大孔树脂纯化固形物（即柠檬苦素类似物）。

在本发明的制备方法的优选实施方式中，各步骤中乙醇的浓度均采用酒精计测定。

本发明分离纯化方法简单易行，可得到柠檬苦素类似物纯度较高的固形物：固形物中柠檬苦素类似物含量＞30%，柠檬苦素含量＞9%，诺米林含量＞10%的固形物；因原料不同，所得固形物柠檬苦素类似物含量可＞80%，柠檬苦素含量可＞20%，诺米林含量可＞40%。

附图说明

图1HPD-722大孔树脂泄露曲线

图2清洗剂用量对柠檬苦素类似物回收率的影响

图3上样浓度对动态吸附率及解吸率的影响

图4上样流速对动态吸附率及解吸率的影响

图5pH值对动态吸附率及解吸率的影响

图6洗脱剂浓度对动态解吸率的影响

图7洗脱速率对动态解吸率的影响

图8洗脱剂pH值对动态解吸率的影响

图9洗脱剂用量对动态解吸的影响

具体实施方式

以下通过对本发明具体实施方式的描述说明但不限制本发明。

本发明分离纯化工艺是经过对大孔树脂分离纯化工艺中的关键参数：上样条件、清洗条件、洗脱条件进行考察，最终得到了本发明柠檬苦素类似物的最佳分离纯化方法，提高了固形物中柠檬苦素类似物及柠檬苦素、诺米林的含量。

1.样品溶液的制备

方法一：称取一定量的橘核粉末，加石油醚（沸点60℃～90℃）于50～60℃水浴下回流脱脂4～6h，弃去石油醚后，按1:6～1:10的料液比加入40～50%的乙醇于50～60℃水浴下回流提取1～2h，抽滤，滤液浓缩，备用。

方法二：称取一定量的陈皮粉末，按1:6～1:10的料液比加入40～50%的乙醇，超声提取1～2h，抽滤，滤液浓缩，备用。

方法一主要针对芸香科柑橘属植物种子类如橘核、柚核等脂肪油含量较高的药材；方法二则主要针对芸香科柑橘属植物其他部位如陈皮、枳实等脂肪油含量较低的药材，可省去石油醚脱脂的环节。

因此，本发明分离纯化方法中步骤1）：

若原料为芸香科柑橘属植物药材种子类，则粉碎原料后先用石油醚（沸点60℃～90℃）脱脂，弃去石油醚，再以40～50%乙醇为溶剂（优选在50~60℃的温度条件下提取）提取，过滤得提取液。

若原料为芸香科柑橘属植物药材果实或果皮类，则粉碎原料后以40～50%乙醇为溶剂（优选在50~60℃的温度条件下提取）提取，过滤得提取液。

芸香科柑橘属植物药材种子类主要有橘核、柚核、橙核等。芸香科柑橘属植物药材果实或果皮类主要有枳实、陈皮、枳壳等。

2.不同大孔吸附树脂吸附性能的比较

将16种不同型号的树脂分别置于相同的容器中，加入高于树脂层10cm的95%乙醇浸泡24h，放出浸液，用95%乙醇洗涤至洗涤液1份于5份水中不呈白色浑浊状时即可，水洗至无醇味，备用。

精密称取16种树脂各2.0g，各两份，置具塞锥形瓶中，分别加入20mL由“方法一”制备的样品溶液，置于120r/min的摇床中振摇24h，过滤，抽干，并用100mL蒸馏水清洗树脂，合并滤液，稀释测其吸光度。清洗后的大孔吸附树脂置具塞锥形瓶中，分别加入80%乙醇溶液40mL，于120r/min的摇床中振荡解吸24h，取解吸液稀释测其吸光度。计算比吸附量、吸附率、比解吸量和解吸率，结果见表1。比吸附量(比解吸量)为平均每克大孔吸附树脂吸附（解吸）的柠檬苦素类似物的量。

表116种大孔吸附树脂吸附性能比较表

结果表明：静态吸附过程中，HZ-16、HPD-722、HZ-816型大孔吸附树脂的吸附率明显高于其他型号的树脂，且这三种树脂间吸附率并未表现出明显差距。但在静态洗脱中，HPD-722型树脂的解吸率为78.84%，比HZ-16，HZ-816两种树脂较高，HPD-722对柠檬苦素类似物的吸附和解吸表现出最佳的综合性能，故选用HPD-722型树脂对柠檬苦素类似物的纯化工艺进行下一步研究。

3.大孔吸附树脂分离纯化条件的考察

3.1泄露曲线测定为了考察HPD-722大孔树脂对柠檬苦素类似物的动态吸附性能，确定HPD-722大孔树脂的样品处理量，进行泄露曲线的测定。将大孔树脂装入20×500mm的柱子中，使树脂体积为20mL，取柠檬苦素类似物浓度为5.0mg/mL的样品溶液加入到树脂中，流速控制在1BV/h，分段收集，每收集1柱体积测定其吸光值，根据药液吸附流出体积和流出液柠檬苦素类似物浓度测定结果绘制泄露曲线，从而确定HPD-722大孔树脂的样品处理量。

图1为HPD-722大孔树脂泄露曲线，结果表明，以柠檬苦素类似物的浓度为5.0mg/mL上样，流速控制在1BV/h时，上样2.5倍树脂床体积的样品溶液后，HPD-722大孔树脂达到饱和，样品溶液出现较大泄露，故20mLHPD-722大孔树脂最多可吸附浓度为5.0mg/mL样品溶液2.5倍床体积柠檬苦素类似物不发生泄露。

3.2清洗剂用量的考察取相同浓度样品溶液50mL，上样流速控制在1BV/h，分别加入树脂体积均为20mL的HPD-722树脂柱中，然后分别用10mL、20mL、30mL、40mL、50mL蒸馏水冲洗后，再用90%的乙醇溶液以2BV/h的洗脱速度进行洗脱，最后分别测定洗脱下来的洗脱液中柠檬苦素类似物的浓度。

图2为清洗剂用量对柠檬苦素类似物回收率的影响，结果表明，当清洗剂用量为1BV时，已将水溶性杂质去除，同时不会造成柠檬苦素类似物过多损失。因此，清洗剂用量为1BV为宜。

3.3上样条件的考察

3.3.1上样浓度的考察不同浓度的样品溶液（1.5mg/mL、2.5mg/mL、3.5mg/mL、5.5mg/mL、6.0mg/mL）以1BV/h的流速上柱，吸附完全后，用等量蒸馏水清洗，再用等量90%醇解吸，测定其吸附量、吸附率、解吸量和解吸率。

表2上样浓度考察

图3为上样浓度对动态吸附率及解吸率的影响，结果表明，当上样浓度在3.5～5.5mg/mL之间时，吸附率达到最高趋于稳定，当浓度高于5.5mg/mL吸附率逐渐降低，再结合解吸量和变化曲线图分析，上样浓度3.5～5.5mg/mL为最适浓度。

3.3.2上样流速的考察以相同浓度（3.5mg/mL）的样品溶液上柱，使上柱速率分别1BV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h、5BV/h、6BV/h，其他操作同3.3.1。结果见表3。

表3上样流速考察

图4为上样流速对动态吸附率及解吸率的影响，结果表明，随着上样流速的升高吸附率逐渐降低。这是因为流速太快，样品溶液还未被树脂完全吸附就通过大孔树脂柱，使它的吸附效率降低了，且由结果变化曲线可看出，当上样流速低于2时，解吸率较高且平稳，则上样流速以1～2BV/h为宜。

3.3.3样品溶液pH值的考察根据文献报道，柠檬苦素类似物在pH=5.0～7.0时最稳定，所以调节样品溶液pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0，然后以相同流速上柱，其他操作同3.3.1。结果见表4。

表4样品溶液pH值考察

图5为pH值对动态吸附率及解吸率的影响，结果表明，当pH值在6.0～7.0范围内时，HPD-722大孔树脂对柠檬苦素类似物的吸附率和解吸率都较高，与文献报道中柠檬苦素类似物的性质一致，故选择样品溶液pH值为6.0～7.0之间为宜。

3.4洗脱条件的考察

3.4.1洗脱剂浓度的考察定量称取预处理好的树脂湿法装柱，取柠檬苦素类似物浓度为4.5mg/mL的样品溶液，各80mL，上样速率为1BV/h，吸附完全后，用蒸馏水冲洗柱子，再分别用60%、70%、80%、90%的乙醇，以2BV/h的流速洗脱，乙醇用量为120mL，测定洗脱下来溶液中柠檬苦素物质的浓度，计算解吸率，选择洗脱剂的最佳浓度。

图6为洗脱剂浓度对动态解吸率的影响，结果表明，当洗脱剂浓度为80～90%时，解吸率明显升高，故确定洗脱剂的最佳浓度为80～90%。

3.4.2洗脱流速的考察取柠檬苦素类似物浓度为3.6mg/mL的样品溶液各80mL，上样速率为1BV/h，分别加入相同的HPD-722大孔树脂柱中，吸附完全后，用蒸馏水冲洗柱子后分别以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0BV/h的流速洗脱，乙醇用量为120mL，测定洗脱下来溶液中柠檬苦素物质的浓度，计算解吸率，选择最佳洗脱流速。

图7为洗脱速率对动态解吸率的影响，结果表明，当洗脱速率为在1.5～2.0BV/h范围内时，HPD-722大孔树脂对柠檬苦素类似物的解吸率达到最高。因此，调节洗脱速率为1.5～2.0BV/h最佳。

3.4.3洗脱剂pH值的考察取柠檬苦素类似物浓度为4.4mg/mL的样品溶液各80mL，上样速率为1BV/h，分别加入相同的HPD-722大孔树脂柱中，吸附完全后，用1BV的蒸馏水清洗后再用pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0的洗脱溶剂进行洗脱，用量均为120mL，测定洗脱下来溶液中柠檬苦素物质的浓度，计算解吸率，选择最佳的pH值。

图8为洗脱剂pH值对动态解吸率的影响，结果表明，当洗脱剂的pH值为在7.0～8.0之间时，HPD-722大孔树脂对柠檬苦素类似物的解吸率可达到最高。因此，调节洗脱剂pH值在7.0～8.0之间最佳。

3.4.4洗脱剂用量的考察取柠檬苦素类似物浓度为3.5mg/mL的样品溶液80mL，上样速率为1BV/h，吸附完全后，用1BV的蒸馏水清洗。用80%的乙醇，以2BV/h的流速洗脱，每1BV收集一份，测定每份溶液的柠檬苦素类似物的含量，确定洗脱剂的用量。

图9为洗脱剂用量对动态解吸的影响，结果表明，当洗脱剂用量为6.0BV后，洗脱液中柠檬苦素类似物的含量趋近于0，在此情况下继续解吸对能源和时间的消耗较大，则在大规模生产中洗脱剂用量以6.0～7.0BV为宜。

4．验证试验

称取适量预处理好的HPD-722型树脂3份，湿法装柱，精密吸取浓度为3.7mg·mL^-1、pH为6的样品溶液，以1BV·h^-1的流速上样吸附后，浸置30min，用1BV的蒸馏水溶液清洗后，用6BVpH值为7左右的80%乙醇溶液以2BV·h^-1的流速进行洗脱，。测其吸附率、解吸率。洗脱液在50℃，1.0kPa的条件下进行回收，得干燥品，并测定成品中柠檬苦素类似物与柠檬苦素、诺米林的含量。

表5成品指标成分含量

编号	吸附率（%）	解吸率（%）	柠檬苦素类似物含量（%）	柠檬苦素含量（%）	诺米林含量（%）
						201101	82.42	93.44	82.55	23.88	49.67
201102	81.28	92.87	82.83	21.01	42.14
						201103	81.97	93.01	83.07	22.68	45.89

发明人通过上述实验对柠檬苦素类似物大孔树脂纯化工艺各参数进行了考察，优选了最佳的获得高纯度柠檬苦素类似物大孔树脂的纯化工艺。整套工艺流程简单科学，操作过程稳定可控，生产成本低，得到的柠檬苦素类似物纯度＞80%，柠檬苦素纯度＞20%，诺米林＞40%。

进一步的，鉴于柠檬苦素类似物广泛存在于芸香科和楝科植物中，因此发明人对以下药材采用上述分离纯化方法制备柠檬苦素类似物，制备例如下：

制备例1

1）取橙核若干克，粉碎后，加石油醚（沸点60℃～90℃）回流脱脂，水浴温度为50～60℃，脱脂时间为6h；回流条件为：50%乙醇为橙核粉末重量的10倍，提取温度50~60℃，提取时间2h。过滤得提取液；

2）提取液采用HPD-722型大孔树脂柱层析法经上样、吸附、洗脱三个步骤进行纯化，收集洗脱液干燥即得纯化后样品。

其中：上样：提取液配制成浓度为4.5mg/mL的样品溶液，样品溶液pH控制在6.0～7.0的范围内，以1.0～2.0BV/h的流速上样；

吸附：上样后静置吸附30min以上，用1.0BV的蒸馏水溶液清洗；

洗脱：清洗后用6.0～7.0BV、pH值在7.0～8.0范围内的80～90%乙醇溶液以1.5～2.0BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液。

柠檬苦素类似物纯度57.02%，柠檬苦素纯度13.50%，诺米林27.76%。

制备例2

1）取枳壳药材粉碎后加热回流提取，回流条件为：50%乙醇为枳壳粉末重量的6倍，提取温度50~60℃，提取时间2h。过滤得提取液；

2）提取液采用HPD-722型大孔树脂柱层析法经上样、吸附、洗脱三个步骤进行纯化，收集洗脱液干燥即得纯化后样品。

其中：上样：提取液配制成浓度为5.5mg/mL的样品溶液，样品溶液pH控制在6.0～7.0的范围内，以1.0～2.0BV/h的流速上样；

吸附：上样后静置吸附30min以上，用1.0BV的蒸馏水溶液清洗；

洗脱：清洗后用6.0～7.0BV、pH值在7.0～8.0范围内的80～90%乙醇溶液以1.5～2.0BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液。

柠檬苦素类似物纯度30.65%，柠檬苦素纯度9.89%，诺米林12.77%。

制备例3

1）取枳实药材粉碎后加热回流提取，回流条件为：40%乙醇为枳实粉末重量的8倍，提取温度50~60℃，提取时间1h。过滤得提取液；

2）提取液采用HPD-722型大孔树脂柱层析法经上样、吸附、洗脱三个步骤进行纯化，收集洗脱液干燥即得纯化后样品。

其中：上样：提取液配制成浓度为3.5mg/mL的样品溶液，样品溶液pH控制在6.0～7.0的范围内，以1.0～2.0BV/h的流速上样；

吸附：上样后静置吸附30min以上，用1.0BV的蒸馏水溶液清洗；

洗脱：清洗后用6.0～7.0BV、pH值在7.0～8.0范围内的80～90%乙醇溶液以1.5～2.0BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液。

柠檬苦素类似物纯度50.47%，柠檬苦素纯度15.49%，诺米林23.03%。

综上，本发明分离纯化方法简单易行，可得到柠檬苦素类似物纯度较高的固形物：固形物中柠檬苦素类似物含量＞30%，柠檬苦素含量＞9%，诺米林含量＞10%的固形物；因原料不同，所得固形物柠檬苦素类似物含量可＞80%，柠檬苦素含量可＞20%，诺米林含量可＞40%。

Claims (10)

1.一种柠檬苦素类似物的分离纯化方法，其特征在于：提取纯化步骤为：

1）以芸香科柑橘属植物药材为原料：

当芸香科柑橘属植物药材为种子类时，粉碎原料后，先用沸点60℃～90℃的石油醚脱脂，弃去石油醚，再用40～50%v/v乙醇回流提取，过滤得提取液；或

当芸香科柑橘属植物药材为果皮类或果实类时，粉碎原料后，用40～50%v/v乙醇回流提取，过滤得提取液；

2）提取液采用大孔树脂柱层析法经上样、吸附、洗脱三个步骤进行纯化，收集洗脱液干燥，即得柠檬苦素类似物。

2.根据权利要求1所述的柠檬苦素类似物的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤1），沸点60℃～90℃的石油醚脱脂条件为：水浴温度为50～60℃，保持其微沸，脱脂时间为4～6h。

3.根据权利要求1所述的柠檬苦素类似物的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤1）40～50%v/v乙醇回流提取条件为：40～50%v/v乙醇为芸香科柑橘属植物药材粉末重量的6~10倍，提取温度为50~60℃，提取时间1～2h。

4.根据权利要求1所述的柠檬苦素类似物的分离纯化方法，其特征在于：步骤2）所述大孔树脂型号为HPD-722型。

5.根据权利要求1所述的柠檬苦素类似物的分离纯化方法，其特征在于：步骤2）所述提取液上样前配置成浓度为3.5mg/mL～5.5mg/mL的样品溶液，pH控制在6.0～7.0的范围内，样品溶液以1.0～2.0BV/h的流速上样。

6.根据权利要求1所述的柠檬苦素类似物的分离纯化方法，其特征在于：步骤2）所述吸附是指上样后静置吸附30min以上，用0.5-1.2BV的水溶液清洗。

7.根据权利要求6所述的柠檬苦素类似物的分离纯化方法，其特征在于：步骤2）所述吸附用1.0BV的水溶液清洗。

8.根据权利要求1所述的柠檬苦素类似物的分离纯化方法，其特征在于：步骤2）所述洗脱：清洗后用6.0～7.0BV、pH值在7.0～8.0范围内的80～90%v/v乙醇溶液以1.5～2.0BV/h的流速进行洗脱。

9.根据权利要求1-8任一项所述的柠檬苦素类似物的分离纯化方法，其特征在于：当芸香科柑橘属植物药材为种子类时，所述芸香科柑橘属植物药材为橘核、橙核或柚核；当芸香科柑橘属植物药材为果皮类或果实类时，所述芸香科柑橘属植物药材为枳实、陈皮或枳壳。

10.权利要求1-9任一项所述的分离纯化方法制备而得的柠檬苦素类似物。

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