CN103724394B

CN103724394B - 甘草酸和甘草黄酮的连续分离纯化方法

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Publication number: CN103724394B
Application number: CN201410000244.XA
Authority: CN
Inventors: 陈振斌; 龙佳朋; 刘晓娇
Original assignee: Lanzhou University of Technology
Current assignee: Sinopharm Xinjiang Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2014-01-02
Filing date: 2014-01-02
Publication date: 2016-02-10
Anticipated expiration: 2034-01-02
Also published as: CN103724394A

Abstract

甘草酸和甘草黄酮的连续分离纯化方法，首先将甘草通过常用的提取方法进行提取，得到甘草酸溶液。从而实现了对甘草酸和甘草黄酮的同时提取；然后根据甘草酸和甘草黄酮在水中溶解性和电离常数(pKa)上的差异，以水和乙醇为溶剂，通过对干燥后提取物用不同浓度梯度的水/乙醇溶解和对溶液pH值的精密控制，使含有甘草酸和甘草黄酮的混合液依次通过聚酰胺类的树脂和大孔吸附树脂混合床吸附柱吸附/解吸的方法，实现甘草酸和甘草黄酮的高效分离，制备出较高纯度甘草酸和甘草黄酮。

Description

甘草酸和甘草黄酮的连续分离纯化方法

技术领域

本发明涉及一种从甘草中同时提取甘草酸和甘草黄酮的方法。

背景技术

甘草为常用大宗药材，年需量约6万吨左右，甘草提取物被广泛应用于工业、化工等领域，并大量出口。由于生产周期较长，致使原料供给不足，目前市场上甘草品质下降，价格持续增长。甘草中含有甘草酸、甘草黄酮等活性成分。是一种具有抗炎、抗病毒、保肝解毒及增强免疫等多项功能的中药材。

目前从甘草中提取甘草酸和甘草黄酮的方法主要有以下几种：

（1）水提法：但建明等发表的论文“甘草渣中黄酮类化合物的提取工艺研究”（石河子大学学报,1995,26(1),39-44），该方法主要以水作为溶剂，将甘草放入提取器中，进行水煮提取，结果表明虽然提取工艺简单、溶剂成本低、环保。但此法存在提取杂质多、提取液存放易腐败变质、后续处理繁琐等缺点。

（2）超声提取法：随着现代科学技术的发展，超声技术已广泛应用于中草药有效成分的提取中。超声波能破坏植物的细胞，从而加速药材有效成分在溶剂中的溶解，缩短提取时间，提高有效成分的提出率，为中草药成分的提取提供了一种快速、高效的新方法。李炳奇等发表的论文“超声法联合提取甘草黄酮和甘草酸的研究”（山东中医杂志,2005,24(1),38-40），采用超声技术对甘草中黄酮和甘草酸进行联合提取，确定了影响提取效果的主要因素，摸索出一套恰当的甘草酸和黄酮的提取方法。但对于超声提取，耗能大、浪费能源、成本高、不利于工业化生产，同时也破坏了天然药材的有效成分。

（3）氨水提取法：崔杏雨等发表的论文“甘草酸制备新工艺的研究”（太原理工大学学报,2001,32(3):271-273），该方法主要以氨水作为溶剂进行提取，结果表明虽然提取率高于水提法，但氨水造成环境污染，不易采用。

尽管现有的工艺能满足现有企业对甘草中主要成分的分离，但是，现有的工艺都有它的不足之处，例如：超滤法成本太高，不利于工业化生产，但是对于甘草中主要成分的分离，现有的工艺往往采用大孔树脂分离的方法，不能同时将甘草黄酮和甘草酸连续分离出来，往往是针对其中的一种成分进行分离的。即采用单一的树脂来分离，得到的纯度很低，不利于回收。

虽然目前对MAR应用的研究已经相当广泛，但研究主要集中在利用合成或市售的某一种MAR对底物的吸附分离实验。由于不同的MAR在极性、功能基、孔径、孔容及比表面积等结构参数方面都有所不同，而某一种MAR对多种成分也有不同程度的吸附，因此，对于一些物质结构较为相似的成分分离，采用单一类型的MAR往往很难达到预期的分离效果，这在一定程度上限制了MAR应用研究更好地发展。

发明内容

本发明的目的是提高一种甘草酸和甘草黄酮的连续分离纯化方法。

本发明是甘草酸和甘草黄酮的连续分离纯化方法，其步骤为：

(1)将烘干粉碎的甘草，通过常用的方法进行提取，得到含有甘草酸和甘草黄酮的提取液，然后再将提取液浓缩、烘干干燥；

(2)按水、梯度水/乙醇、乙醇的次序分别对样品进行充分溶解；

(3)得到系列梯度溶液，分别测定各梯度溶液中甘草酸和甘草黄酮的含量；

(4)取甘草酸提取物干品，用水/乙醇使其完全溶解；

(5)用AlCl₃和NaNO₂显色法测定甘草总黄酮含量；

通过用不同大孔吸附树脂在相同条件下进行吸附/解吸实验，并采用相同方法测定残液和解吸液中甘草总黄酮的含量，根据吸附值和解吸率选择对甘草黄酮吸附/解吸性能优异的大孔吸附树脂；

(6)再将解吸液浓缩烘干，通过显色法测其纯度；

(7)取市售纯度为98%的甘草酸样品，加水完全溶解，用HPLC法测定溶液浓度；

采用与步骤(5)中同样的方法，进行分离甘草酸的大孔吸附树脂混合床选择；

(8)再将解吸液浓缩烘干，通过HPLC法测其纯度。

本发明的优点是：

(1)实现了甘草黄酮和甘草酸的同时提取、分离技术；

(2)在最佳工艺条件下，采用动、静态吸附相结合的方法，首先采用静态吸附方法对MAR进行筛选，筛选出较好的混合床，然后再通过动态吸附的方法对其进行分离纯化；

(3)实现了对两种成分的更高效分离，为工业化生产打下了基础;

(4)本发明所涉及到的工艺路线、所用试剂等均为国际上所公认的绿色环保技术。

附图说明

图1为技术路线图，图2为甘草酸标准曲线图。

具体实施方式

如图1所示，甘草酸和甘草黄酮的连续分离纯化方法，其步骤为：

(4)取甘草酸提取物干品，用水/乙醇使其完全溶解；

(5)用AlCl₃和NaNO₂显色法测定甘草总黄酮含量；

(6)再将解吸液浓缩烘干，通过显色法测其纯度；

(8)再将解吸液浓缩烘干，通过HPLC法测其纯度。

本发明中所采用的大孔吸附树脂为：从极性树脂和非极性树脂中选出来的几种混合在一起。

本发明中大孔吸附树脂含水率的测定及其活化方法如下:

(1)大孔吸附树脂含水率的测定

称取一定量的MAR，在110℃的真空干燥箱中烘36h，取出并置于干燥器内冷却0.5h，称重；在同样的温度条件下再烘30min，取出并置于干燥器内冷却0.5h，称重。重复前面测重过程，直到前后两次质量差≤0.05mg。根据烘干前后的质量差计算其含水率。每种树脂在测定含水率时取两份平行样，以保证称量的精确性。

（2）大孔吸附树脂的活化与纯化

称取干重约为28g的聚酰胺树脂和32gMAR，分别放入250mL瓶杯中，加入150mL乙醇浸泡24h后，回收浸泡液。再加入适量乙醇洗涤至加入3倍体积的蒸馏水已无白色浑浊物出现。加入适量的蒸馏水洗涤树脂，浸泡5min以后弃去洗涤液，如此反复三次，使得残留在树脂中的乙醇能够较充分的被水逐渐替换。

本发明中，纯度的测定和计算方法如下：

用移液管分别移取对照品溶液1、2、3、4、5、6、7、8、9mL，分别置于25mL容量瓶中，向容量瓶中加入蒸馏水至刻度。在波长254nm处通过HPLC测峰面积，绘制标准曲线，结果见图2。所得线性回归方程为：y=573572.1x-1863.46（R²=0.996），且在0.08~0.8mg/mL浓度范围内线性关系良好。甘草黄酮标准曲线通过用NaNO₂-AlCl₃-NaOH显色法来测其吸光度，A=10.837C+0.00161（R²=0.9991），且在0.002~0.07mg/mL浓度范围内线性关系良好。

（3）甘草黄酮和甘草酸吸附率、吸附量、解吸量、解吸率的计算

将活化处理过的聚酰胺树脂装入内径为1.6cm的交换柱中，准确移取1000mL总浓度为2.00mg/mLpH为9的甘草提取物溶液，控制流速为1.6BV/h行吸附，收集残液，用显色法测定残液中甘草黄酮的含量。将吸附后的MAR用蒸馏水洗涤3次，每次间隔5min，然后准确移取2倍树脂床体积的pH=8的70%乙醇溶液进行解吸，控制其流速为2.5BV/h进行洗脱，收集解吸液，用显色法测定解吸液中甘草黄酮的含量。然后再将交换柱中的聚酰胺树脂换成MAR，将聚酰胺树脂吸附残液pH调到6以1.2BV/h的流速进通过MAR进行吸附，收集残液，通过HPLC测定残液中甘草酸的含量，再通过2倍树脂床体积的pH为7的70%进行解吸，控制其流速为2BV/h进行洗脱，收集解吸液，用HPLC法测定解吸液中甘草酸的含量，依式（1）-（4）分别计算聚酰胺树脂和MAR的吸附率、解吸率、吸附量及解吸量；依下式（5）计算经吸附解吸附分离过程后所得样品的纯度。

吸附率：

(1)

吸附量：

(2)

其中，F代表吸附率（%），q _a代表吸附量（mg/g）；C ₀和C ₁分别代表原液浓度和残液浓度（mg/mL）；m是所用树脂干重质量（g）；V是所用溶液体积（mL）。

解吸率：

(3)

解吸量：

(4)

其中，D是解吸率（%）；q _d是解吸附量（mg/g）；C _d分别表示解吸液中总黄酮和甘草酸浓度（mg/mL）；V _d是解吸液体积（mL）。

甘草黄酮和甘草酸纯度：

(5)

其中，r _i是经吸附/解吸附分离过程后所得甘草黄酮和甘草酸样品的纯度，C_i是配置溶液的浓度，V_i是配成溶液的体积，m ₀是样品质量。

本发明的实施例陈述如下：

实施例一：

如图1所示，给出甘草酸和甘草黄酮的连续、同时分离纯化的技术路线，具体步骤如下：

(1)分别将28g聚酰胺树脂和32gMAR分别放入250mL烧杯中，按照前面所述的方法进行活化与纯化处理；

(2)首先将处理好的聚酰胺树脂装入内径为1.6cm的交换柱中，将甘草酸粗品配成0.2-2g/L，pH=9的溶液作为吸附液，使其以1.6BV/h的速度流经聚酰胺树脂，进行吸附；

待吸附结束后，收集吸附残液，NaNO₂-AlCl₃-NaOH显色法测定残液中甘草黄酮的含量，依式(1)-(2)计算吸附率以及吸附量；

(3)将上述聚酰胺树脂柱用蒸馏水洗涤3次，每次间隔5min，然后控制流速为2.5BV/h，加入70%乙醇进行洗脱，待洗脱完成后，收集洗脱液，用NaNO₂-AlCl₃-NaOH显色法测定各洗脱液中甘草黄酮的含量，依式(3)-(4)计算解吸率以及解吸量；

将各洗脱液倒入培养皿中于60^oC烘箱进行干燥，得到甘草黄酮；

(4)将上述所得甘草黄酮配成0.1-1g/L的溶液，用NaNO₂-AlCl₃-NaOH显色法测定溶液中的甘草黄酮含量，依式(5)计算所得甘草黄酮的纯度；

(5)再将交换柱中的聚酰胺树脂换成活化好的MAR进行吸附，将聚酰胺树脂吸附残液pH调到6作为吸附液，使其以1.2BV/h的速度流经大孔树脂树脂混合床，进行吸附；

待吸附结束后，收集吸附残液，通过HPLC法测定残液中甘草酸的含量，依式(1)-(2)计算吸附率以及吸附量；

(6)将上述MAR柱用蒸馏水洗涤3次，每次间隔5min，然后控制流速为2BV/h，加入70%乙醇进行洗脱，待洗脱完成后，收集洗脱液，通过HPLC法测定洗脱液中甘草酸的含量，依式(3)-(4)计算解吸率以及解吸量；

将洗脱液倒入培养皿中于60^oC烘箱进行干燥，得到甘草酸；

(7)将上述所得甘草酸配成0.1-1g/L的溶液，通过HPLC法测定洗脱液中甘草酸的含量，依式(5)计算所得甘草酸的纯度。

下面结合实施例二和三对本发明做进一步的说明：

实施例二

(1)称取干重约为28.0g的聚酰胺树脂和32gMAR混合床LS-809C+LS100，分别放入250mL烧杯中，加入一定体积乙醇浸泡24h后，回收浸泡液。随后再加入适量乙醇洗涤至加入3倍体积的蒸馏水已无白色浑浊物出现。加入适量的蒸馏水洗涤树脂，浸泡5min以后弃去洗涤液，如此反复三次，使得残留在树脂中的乙醇能够较充分的被水逐渐替换；

待吸附结束后，收集吸附残液，NaNO₂-AlCl₃-NaOH显色法测定残液中甘草黄酮的含量，依式(1)-(2)计算吸附率以及吸附量；吸附率为70%，吸附量为12.7mg/g；

(3)将上述聚酰胺树脂柱用蒸馏水洗涤3次，每次间隔5min，然后控制流速为2.5BV/h，加入70%乙醇进行洗脱，待洗脱完成后，收集洗脱液，用NaNO₂-AlCl₃-NaOH显色法测定各洗脱液中甘草黄酮的含量，依式(3)-(4)计算解吸率以及解吸量；解吸率为90%，解吸量11.43mg/g；

(4)将上述所得甘草黄酮配成0.1-1g/L的溶液，用NaNO₂-AlCl₃-NaOH显色法测定溶液中的甘草黄酮含量，依式(5)计算所得甘草黄酮的纯度为65%；

待吸附结束后，收集吸附残液，通过HPLC法测定残液中甘草酸的含量，依式(1)-(2)计算吸附率以及吸附量，吸附率为63.63%，吸附量为106.06mg/g；

(6)将上述MAR柱用蒸馏水洗涤3次，每次间隔5min，然后控制流速为2BV/h，加入70%乙醇进行洗脱，待洗脱完成后，收集洗脱液，通过HPLC法测定洗脱液中甘草酸的含量，依式(3)-(4)计算解吸率以及解吸量，解吸率为75.68%，解吸量为80.2715mg/g；

将洗脱液倒入培养皿中于60^oC烘箱进行干燥，得到甘草酸；

(7)将上述所得甘草酸配成0.1-1g/L的溶液，通过HPLC法测定洗脱液中甘草酸的含量，依式(5)计算所得甘草酸的纯度为65%。

实施例三：

(1)称取干重约为28.0g的聚酰胺树脂和32gMAR混合床LS-809C+LS100+LS809A+LX38，分别放入250mL烧杯中，加入一定体积乙醇浸泡24h后，回收浸泡液。随后再加入适量乙醇洗涤至加入3倍体积的蒸馏水已无白色浑浊物出现。加入适量的蒸馏水洗涤树脂，浸泡5min以后弃去洗涤液，如此反复三次，使得残留在树脂中的乙醇能够较充分的被水逐渐替换

(5)再将交换柱中的聚酰胺树脂换成活化好的LS-809C+LS100+LS809A+LX38进行吸附，将聚酰胺树脂吸附残液pH调到6作为吸附液，使其以1.2BV/h的速度流经大孔树脂树脂混合床，进行吸附；

待吸附结束后，收集吸附残液，通过HPLC法测定残液中甘草酸的含量，依式(1)-(2)计算吸附率以及吸附量，吸附率为85.43%，吸附量为130.45mg/g；

(6)将上述MAR柱用蒸馏水洗涤3次，每次间隔5min，然后控制流速为2BV/h，加入70%乙醇进行洗脱，待洗脱完成后，收集洗脱液，通过HPLC法测定洗脱液中甘草酸的含量，依式(3)-(4)计算解吸率以及解吸量，解吸率为90.02%，解吸量为117.41mg/g；

将洗脱液倒入培养皿中于60^oC烘箱进行干燥，得到甘草酸；

(7)将上述所得甘草酸配成0.1-1g/L的溶液，通过HPLC法测定洗脱液中甘草酸的含量，依式(5)计算所得甘草酸的纯度为82%。

Claims

1.甘草酸和甘草黄酮的连续分离纯化方法，其步骤为：

(1)从烘干粉碎的甘草中提取得到含有甘草酸和甘草黄酮的提取液，然后再将提取液浓缩、烘干干燥，得到甘草提取物干品；

(2)按水、梯度水和乙醇的混合溶液、乙醇的次序分别对甘草提取物干品进行充分溶解；

(4)取甘草提取物干品，用水和乙醇的混合溶液使其完全溶解，得到甘草酸粗品；

将干重为28g的聚酰胺树脂浸于150mL乙醇中浸泡24h后，回收浸泡液，再向聚酰胺树脂中加入乙醇洗涤至加入3倍体积的蒸馏水已无白色浑浊物出现，加入适量的蒸馏水洗涤聚酰胺树脂，浸泡5min以后弃去洗涤液，如此反复三次，使得残留在树脂中的乙醇能够被水逐渐替换；

将活化好的聚酰胺树脂装入内径为1.6cm的交换柱中，将甘草酸粗品配成pH值为9的碱性溶液作为吸附液，使吸附液流经聚酰胺树脂，进行吸附；

所述吸附的温度为30～60℃；

(5)用AlCl₃和NaNO₂显色法测定甘草总黄酮含量；

通过用不同大孔吸附树脂在相同条件下进行吸附和解吸实验，并采用相同方法测定残液和解吸液中甘草总黄酮的含量，根据吸附值和解吸率选择对甘草黄酮吸附和解吸性能优异的大孔吸附树脂；

所述吸附温度为30～60℃，解吸温度为30～60℃；

(6)再将步骤(5)中的解吸液浓缩烘干，通过显色法测甘草黄酮的纯度；

(7)取市售纯度为98％的甘草酸样品，加水完全溶解，用HPLC法测定溶液浓度；

(8)将交换柱中的聚酰胺树脂换成活化好的大孔吸附树脂进行吸附，将聚酰胺树脂吸附残液的pH调到6作为吸附液，使吸附液以1.2BV/h的流速流经选择得到的大孔吸附树脂混合床，进行吸附；

再将解吸液浓缩烘干，通过HPLC法测甘草酸的含量和纯度；

所述大孔吸附树脂是从极性树脂和非极性树脂中选出的。

2.根据权利要求1所述的甘草酸和甘草黄酮的连续分离纯化方法，其特征在于步骤(1)中所述为提取过程，干燥温度为20～60℃。

3.根据权利要求1所述的甘草酸和甘草黄酮的连续分离纯化方法，其特征在于步骤(2)、(3)中所述为提取物的梯度溶解，浓度范围0-10g/L。

4.根据权利要求1所述的甘草酸和甘草黄酮的连续分离纯化方法，其特征在于步骤(8)中所述为分离甘草酸大孔吸附树脂混合床的选择，烘干温度为20～60℃。