CN104876998B - pH梯度洗脱法同步分离甘草膏中三萜皂苷类及甘草黄酮类化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及pH梯度洗脱法同步分离甘草膏中三萜皂苷类及甘草黄酮类化合物的方法。经过1)上样溶液的制备、2)大孔树脂的预处理、3)上样吸附、4)预热和5)应用夹层层析柱进行pH梯度洗脱采用碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液或氢氧化钠溶液等不同碱性的溶液进行pH梯度洗脱，分别得到了三萜皂苷类成分为主的洗脱液和含甘草黄酮类成分及其它有用成分的洗脱液，甘草酸的收率与乙醇溶液作洗脱剂同比可提高2～4倍，同时降低了乙醇的消耗以及回收乙醇带来的能耗，甘草酸的收率与常温洗脱工艺同比最高可提高60％以上，同时也为化学、化工和制药领域中温敏性特殊成分的非常温柱分离提供一种简便易行的实验装置，具有推广的价值。
Description
技术领域
本发明涉及pH梯度洗脱法同步分离甘草膏中三萜皂苷类及甘草黄酮类等化合物的方法。
背景技术
甘草为豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)、胀果甘草G.inflata Bat、光果甘草G.glabra L的干燥根及根茎。主产于内蒙古、甘肃、新疆、宁夏及东北等地。春、秋两季采挖，以秋采者为佳。甘草味甘、性平，归心、肺、脾、胃经。具有补脾益气、祛痰止咳、缓急止痛、清热解毒、调和诸药的功效。
据现有资料报道，国内外已从甘草中分离得到100多种黄酮类化合物，60多种三萜类化合物、以及多糖、香豆素类、l8种氮基酸、多种生物碱，雌性激素和多种有机酸等。其中三萜类化合物、黄酮类化合物和多糖类是主要成分。
甘草中药成分的提取和分离纯化方法很多，工业应用较多的提取方法主要有水提法、醇提法、氨水提取法等，分离纯化方法主要有液-液萃取法、聚酰胺法、大孔吸附树脂法等。
专利CN200610018275.3采用有机溶剂萃取，醇沉，酸化等步骤得到甘草黄酮粗品、甘草多糖粗品和甘草酸粗品。专利CN03105372.6首先采用微波辅助提取法将甘草酸从甘草中快速高效地提取出来，然后采用有机溶剂萃取的方法得到精制甘草酸。专利CN201110262440.0采用聚酰胺柱层析法制备了高纯度的甘草酸。CN201110075470.0、CN201110318687.X、CN200510038035.5等专利采用大孔吸附树脂法对中药有效成分进行富集，采用不同浓度的乙醇作为洗脱剂进行分离纯化。采用大孔树脂法分离纯化甘草中药成分的文献也多有报道，也是采用不同浓度的乙醇进行洗脱，获取目标成分。该法的优点在于操作简单、易于大批量生产。缺点是即使回收溶剂，消耗的乙醇依旧较多，能耗较大，需要控制成本。
已知甘草中主要成分除多糖外，三萜皂苷类和黄酮类均为酸性化合物，但二者酸性强弱不同，存在酸性梯度，若能充分利用二者的酸性差异进行分离，不仅可以提高目标成分的收率，还可以大大节约生产的成本。
另外三萜皂苷类成分甘草酸是一种表面活性物质，易溶于热水，加热条件下柱层析对这类成分的分离有利。而常见的单层玻璃层析柱由层析玻管、出料管和出料控制阀组成，材质为普通玻璃，仅能在常温下进行分离操作。中国专利CN200910089340.5公开的一种恒压密闭上行层析柱装置，中国专利CN200920316761.2公开的一种自动加液层析柱，CN201420166784.0公开的一种包含储液器和柱体的玻璃层析柱以及福州大学的李玉林根据高效液相色谱的基本原理研制出的TLC Mesh层析柱与常见的玻璃层析柱一样，装置也仅能实现常温分离操作。为满足化学、化工及制药领域中如甘草酸的温敏性特殊成分非常温柱分离的需要，有必要设计一种简便易行、热膨胀系数小强度高能耐受较大温差，并能有效控制柱温的层析柱装置。
发明内容
本发明的目的是为了改变传统大孔树脂乙醇洗脱工艺消耗乙醇较多，回收溶剂能耗较大的现状，以甘草提取多糖后的浸膏为原料，利用其中三萜皂苷类成分和甘草黄酮类成分的酸性差异，优选碱性溶液作为洗脱溶剂进行梯度分离，提高目标成分的收率，节约生产成本；同时根据甘草酸易溶于热水的特性，以及化学、化工及制药过程中加热有利于传质的原理，设计开发一种可控制柱温的高硼硅酸盐玻璃夹层层析柱应用于洗脱过程，可在加热条件下进行洗脱，提高甘草酸的收率，实现甘草资源的充分有效利用，也为化学、化工和制药领域中温敏性特殊成分的非常温柱分离提供一种简便易行的实验装置。
本发明的技术方案如下：
本发明的一种可控制柱温的高硼硅酸盐玻璃层析柱，在层析柱本体的上端设置有进料口、内部设置有砂芯，下端设置有出料管，出料管上设置有出料控制阀，出料管的直径小于层析柱本体的直径，在层析柱本体的外周设置有夹套层，层析柱本体的外周全部被夹套层所包围，夹套层与所述层析柱本体之间形成空腔，夹套层上设置有载体的进出口。
所述层析柱本体厚度b1≧3mm。
所述夹套层厚度b2≧3mm。
所述层析柱夹套层内径和层析柱本体外径之差≧10mm。
所述出料控制阀材质为聚四氟乙烯或高硼硅酸盐玻璃。
本发明的夹层层析柱的温度控制方法，在柱层析柱温为T℃(0℃≦T≦100℃)采用热水进行加热，将恒温水浴锅中已加热到T℃的热水通过泵从层析柱夹套层下部的热流体下进口泵入空腔，在柱层析过程中加热剂的温度一直维持T℃，对层析柱本体及其中的填料和洗脱溶剂持续供热，在空腔内循环之后从夹套层上部的热流体上出口管流出，回流到恒温水浴锅中循环使用。
本发明的pH梯度洗脱法同步分离甘草膏中甘草黄酮和三萜皂苷类化合物的工艺及夹层层析柱的应用实施方案，步骤如下：
1)上样溶液的制备
将甘草流浸膏在常温下加纯化水搅拌溶解，其中流浸膏：纯化水体积比1:1～1：4；以转速2000r/min～4000r/min离心15～30min，取上清液配制成上样溶液；
2)大孔树脂的预处理
将通过静态吸附洗脱的药用级树脂用乙醇浸泡24h后，用纯化水洗涤树脂至无醇味，加水浸泡备用；
3)上样吸附：
准确称取经预处理的药用级树脂装入本发明的一种可控制柱温的高硼硅酸盐玻璃夹层层析柱，平衡12～24h后，上样吸附至饱和；
4)预热
上样吸附饱和后，采用泵将恒温水浴锅中加热至40℃～60℃的热水从层析柱夹套层下部的热流体下接管通入夹层，对层析柱本体及其中的填料和洗脱剂进行预热，热水在夹层中循环加热后从夹套层上部的热流体上接管流出，回到恒温水浴锅中循环使用。预热时间为0.5～1h。
5)应用夹层层析柱进行pH梯度洗脱
预热结束之后开始pH梯度洗脱。洗脱过程与预热过程一样采用泵将恒温水浴锅中加热至40℃～60℃的热水从层析柱夹套层下部的热流体下接管通入夹层，对层析柱本体及其中的填料和洗脱溶剂持续供热，热水在夹层中循环加热后从夹套层上部的热流体上接管流出，回到恒温水浴锅中循环使用，直至洗脱结束。同时依次将一定体积的不同pH值的碱性洗脱液按先后顺序从层析柱本体上端的进料口加入，分段收集；先采用1～2BV的1％～5％碳酸钠溶液或1％～5％碳酸钾溶液洗脱，收集得到三萜皂苷类成分为主的洗脱液，然后采用1～2BV的1％～5％碳酸氢钠溶液或1％～5％碳酸氢钾溶液或0.5％～2％氢氧化钠溶液洗脱，收集得到含甘草黄酮类成分及其它有用成分的洗脱液。
所述的药用级树脂为HPD100、HPD400、HPD450、D101或AB-8。
本发明的一种可控制柱温的高硼硅酸盐玻璃夹层层析柱的实施方式如附图2所示。
本发明优选碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液或氢氧化钠溶液等不同碱性的溶液进行pH梯度洗脱，分别得到了三萜皂苷类成分为主的洗脱液和含甘草黄酮类成分及其它有用成分的洗脱液，使甘草残膏中主要活性物质三萜皂苷类成分、甘草黄酮类等成分得到同步有效分离，甘草酸的收率与乙醇溶液作洗脱剂同比可提高2～4倍，同时降低了乙醇的消耗以及回收乙醇带来的能耗，生产安全性提高，节约了生产成本，实现了甘草资源的充分利用。
本发明的一种可控制柱温的高硼硅酸盐玻璃夹层层析柱的应用，可在加热条件下进行洗脱，甘草酸的收率与常温洗脱工艺同比最高可提高60％以上，同时也为化学、化工和制药领域中温敏性特殊成分的非常温柱分离提供一种简便易行的实验装置，具有推广的价值。
附图说明
图1为本发明的一种可控制柱温的高硼硅酸盐玻璃夹层层析柱结构示意图。
图2本发明的一种可控制柱温的高硼硅酸盐玻璃夹层层析柱的应用方法示意图。
其中：1-进料口；2-热流体上接管；3-夹套层；4-层析柱本体；5-出料控制阀；6-出料管；7-热流体下接管；8-砂芯；9-恒温水浴锅；10-泵；11-本发明的层析柱；b1-层析柱本体厚度；b2-层析柱夹套层厚度；D1-层析柱夹套层内径；D2-层析柱本体外径。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明：
实施例1
本发明所述pH梯度洗脱法应用于同步分离甘草膏中三萜皂苷类和甘草黄酮类化合物的工艺技术及装备包括以下步骤：
1、上样溶液的制备
将提取多糖后待回收利用的甘草流浸膏在常温下加纯化水搅拌溶解(流浸膏：纯化水体积比1：4)，离心20min(转速4000r/min)后取上清液配制成合适的浓度作为上样溶液。
2、大孔树脂的预处理
将静态吸附洗脱实验优选出的药用级树脂HPD100，用乙醇浸泡24h后，用大量纯化水洗涤树脂至无醇味，加水浸泡备用。
3、上样吸附：准确称取经预处理的大孔树脂HPD100装柱，平衡24h后，上样吸附至饱和。
层析柱采用可控制柱温的高硼硅酸盐玻璃夹层层析柱，如图1所示，可控制柱温的玻璃夹层层析柱，包括层析柱本体4，层析柱本体4的上端连接有进料口1、内部装有砂芯8、下端连接有出料管6，出料管6上设有出料控制阀5，出料管6的直径小于层析柱本体4的直径，在层析柱本体4的外周包设有夹套层3，使层析柱本体4的外周全部被夹套层3所包围，所述夹套层3与所述层析柱本体4之间形成空腔，夹套层3的下部设有热流体下接管7，夹套层3的上部设有热流体上接管2。所述层析柱本体4、夹套层3以及空腔进出口材质采用高硼硅酸盐3.3玻璃。所述层析柱本体厚度b1≧3mm，夹套层厚度b2≧3mm，层析柱夹套层3内径D1和层析柱本体4外径D2之差≧10mm。出料控制阀5材质为聚四氟乙烯或高硼硅酸盐3.3玻璃。
4、预热及pH梯度洗脱
上样吸附饱和后，梯度洗脱之前向层析柱夹套层中通入60℃的热水对柱体进行预热，过程中采用泵10将恒温水浴锅9中的热水从本发明的层析柱11夹套层3下部的热流体下接管7通入夹层，热水在夹层中循环加热后从夹套层3上部的热流体上接管2流出，回到恒温水浴锅9中循环使用。预热0.5h后，持续向层析柱夹套层中通入60℃的热水对柱体进行加热，直至洗脱结束。同时将1BV的2.5％碳酸钠溶液从层析柱本体4上端的进料口1加入，收集得到三萜皂苷类成分为主的洗脱液；然后将2BV的2.5％碳酸氢钠溶液从层析柱本体4上端的进料口1加入，收集得到含甘草黄酮类成分及其它有用成分的洗脱液。其中甘草酸的收率与乙醇溶液洗脱工艺同比提高3.2倍，后续可进行进一步的酸化分离精制。
实施例2
本发明所述pH梯度洗脱法应用于同步分离甘草膏中三萜皂苷类和甘草黄酮类化合物的工艺技术及装备包括以下步骤：
1、上样溶液的制备
将提取多糖后待回收利用的甘草流浸膏在常温下加纯化水搅拌溶解(流浸膏：纯化水体积比1：4)，离心20min(转速4000r/min)后取上清液配制成合适的浓度作为上样溶液。
2、大孔树脂的预处理
将静态吸附洗脱实验优选出的药用级树脂HPD400，用乙醇浸泡24h后，用大量纯化水洗涤树脂至无醇味，加水浸泡备用。
3、上样吸附：准确称取经预处理的大孔树脂HPD400装柱，平衡24h后，上样吸附至饱和。
层析柱与实施例1采用的相同。
4、预热及pH梯度洗脱
上样吸附饱和后，梯度洗脱之前向层析柱夹套层中通入50℃的热水对柱体进行预热，过程中采用泵10将恒温水浴锅9中的热水从本发明的层析柱11夹套层3下部的热流体下接管7通入夹层，热水在夹层中循环加热后从夹套层3上部的热流体上接管2流出，回到恒温水浴锅9中循环使用。预热0.5h后，持续向层析柱夹套层中通入50℃的热水对柱体进行加热，直至洗脱结束。同时将1BV的2.5％碳酸钠溶液从层析柱本体4上端的进料口1加入，收集得到三萜皂苷类成分为主的洗脱液；然后将2BV的2.5％碳酸氢钠溶液从层析柱本体4上端的进料口1加入，收集得到含甘草黄酮类成分及其它有用成分的洗脱液。其中甘草酸的收率与乙醇溶液洗脱工艺同比提高2.48倍，后续可进行进一步的酸化分离精制。
实施例3
本发明所述pH梯度洗脱法应用于同步分离甘草膏中三萜皂苷类和甘草黄酮类化合物的工艺技术及装备包括以下步骤：
1、上样溶液的制备
将提取多糖后待回收利用的甘草流浸膏在常温下加纯化水搅拌溶解(流浸膏：纯化水体积比1：4)，离心20min(转速4000r/min)后取上清液配制成合适的浓度作为上样溶液。
2、大孔树脂的预处理
将静态吸附洗脱实验优选出的药用级树脂HPD450，用乙醇浸泡24h后，用大量纯化水洗涤树脂至无醇味，加水浸泡备用。
3、上样吸附：准确称取经预处理的大孔树脂HPD450装柱，平衡24h后，上样吸附至饱和。
层析柱与实施例1采用的相同。
4、预热及pH梯度洗脱
上样吸附饱和后，梯度洗脱之前向层析柱夹套层中通入40℃的热水对柱体进行预热，过程中采用泵10将恒温水浴锅9中的热水从本发明的层析柱11夹套层3下部的热流体下接管7通入夹层，热水在夹层中循环加热后从夹套层3上部的热流体上接口2流出，回到恒温水浴锅9中循环使用。预热0.5h后，持续向层析柱夹套层中通入40℃的热水对柱体进行加热，直至洗脱结束。同时将1BV的2.5％碳酸钠溶液从层析柱本体4上端的进料口1加入，收集得到三萜皂苷类成分为主的洗脱液；然后将2BV的2.5％碳酸氢钠溶液从层析柱本体4上端的进料口1加入，收集得到含甘草黄酮类成分及其它有用成分的洗脱液。其中甘草酸的收率与乙醇溶液洗脱工艺同比提高2.4倍，后续可进行进一步的酸化分离精制。
Claims (1)
1.pH梯度洗脱法同步分离甘草膏中三萜皂苷类及甘草黄酮类化合物的方法，其特征在于步骤如下：
1)上样溶液的制备
将甘草流浸膏在常温下加纯化水搅拌溶解，其中流浸膏：纯化水体积比1:1～1：4；以转速2000r/min～4000r/min离心15～30min，取上清液配制成上样溶液；
2)大孔树脂的预处理
将通过静态吸附洗脱的药用级树脂用乙醇浸泡24h后，用纯化水洗涤树脂至无醇味，加水浸泡备用；
3)上样吸附：
称取经预处理的药用级树脂装入可控制柱温的高硼硅酸盐玻璃夹层层析柱，平衡12～24h后，上样吸附至饱和；
4)预热
上样吸附饱和后，采用泵将恒温水浴锅中加热至40℃～60℃的热水从层析柱夹套层下部的热流体下接管通入夹层，对层析柱本体及其中的填料和洗脱剂进行预热，热水在夹层中循环加热后从夹套层上部的热流体上接管流出，回到恒温水浴锅中循环使用；预热时间为0.5～1h；
5)应用夹层层析柱进行pH梯度洗脱
预热结束之后开始pH梯度洗脱；洗脱过程与预热过程一样采用泵将恒温水浴锅中加热至40℃～60℃的热水从层析柱夹套层下部的热流体下接管通入夹层，对层析柱本体及其中的填料和洗脱溶剂持续供热，热水在夹层中循环加热后从夹套层上部的热流体上接管流出，回到恒温水浴锅中循环使用，直至洗脱结束；同时依次将不同pH值的碱性洗脱液按先后顺序从层析柱本体上端的进料口加入，分段收集；先采用1～2BV的1％～5％碳酸钠溶液或1％～5％碳酸钾溶液洗脱，收集得到三萜皂苷类成分为主的洗脱液，然后采用1～2BV的1％～5％碳酸氢钠溶液或1％～5％碳酸氢钾溶液或0.5％～2％氢氧化钠溶液洗脱，收集得到含甘草黄酮类成分及其它有用成分的洗脱液；
所述的药用级树脂为HPD100、HPD400、HPD450、D101或AB-8。
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