CN104297026A - 一种提取中药陈皮中的黄酮类有效成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取中药陈皮中的黄酮类有效成分的方法，所述黄酮类有效成分为橙皮苷、川陈皮素、桔皮素中的一种或两种以上，所述方法为：取陈皮药材粉末和分子筛吸附剂，以质量比1：0.25～3比例混合，加入研钵中研磨，取固相萃取小柱，底部加入筛板，用研磨好的固体填充小柱，将填料填实后顶部再加入筛板，将填好的小柱置于固相萃取仪上，取洗脱剂，注入小柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对小柱进行洗脱，底部用离心管收集洗脱液，洗脱结束后，将离心管内洗脱液涡旋、离心，取上层清液即为黄酮类有效成分提取液。本发明采用分子筛作为吸附剂，结合基质固相分散萃取技术，能高效、环保地提取和检测陈皮药材中的黄酮类有效成分。

Description

一种提取中药陈皮中的黄酮类有效成分的方法

技术领域

本发明属于天然药物提取检测领域。它涉及一种中药的微量提取方法，具体地说，它涉及由分子筛作为吸附剂，结合基质固相分散萃取技术，用来提取微量的中药陈皮中黄酮类有效成分的新方法。

背景技术

陈皮为芸香科植物橘(Citrus reticulata Blanco)及其栽培变种的干燥成熟果皮。陈皮具有燥湿化痰、理气健脾的功效，其药材中含有大量活性成分。除挥发油外，陈皮主含黄酮类成分。而其中的黄酮类成分又可分为黄酮苷类和多甲氧基黄酮类两大类型。其中，黄酮苷类主要为二氢黄酮类成分，如橙皮苷、柚皮苷等，这类成分具有清除氧自由基、抗脂质氧化、抗癌、抗菌、抗炎、抗病毒、延缓衰老等作用；另一类活性成分多甲氧基黄酮类，则主要有川陈皮素、橘皮素等，这类成分有抗动脉粥样硬化和降低血清胆固醇、抗癌、抗真菌等药理活性。陈皮中所含黄酮类成分中，含量最高的是二氢黄酮类成分——橙皮苷，其次是多甲氧黄酮类中的川陈皮素和橘皮素的含量为高。

目前，对中药进行提取分析的方法层出不穷。固相萃取(Solid-Phase Extraction，简称SPE)，作为近年发展起来一种样品预处理技术，与传统的样品前处理方法相比，分析物与干扰组分的分离更有效，分析物的回收率更高，省时、省力、操作简单。故而SPE广泛地应用在食品、环境、医药、化工、商检等领域。当然，SPE的局限性也是显而易见：易堵塞、易产生缝隙降低提取效率、截面积小、流量低、重复性差等。

鉴于上述局限，诸多建立在SPE基础上的新型提取方法，也就应运而生。包括磁性固相萃取、分子印迹固相萃取、分散液相微萃取、中空纤维液相微萃取、单滴液相微萃取和基质固相分散萃取等。相比传统的固相萃取方法，这类新型萃取方法具有的优势也更为明显，例如使用有机溶剂量少、对环境污染小、萃取时间短、萃取效率简洁高效等。其中具有代表性的就有基质固相分散萃取(MSPD)。

基质固相分散萃取(MSPD)是近年来国内外研究的一个热门领域。与传统的SPE不同，MSPD是将样品与固相吸附剂(C18反相硅胶、弗罗里硅土等)直接混合研磨，将样品研磨成为微小的碎片分散在固相吸附剂中。然后将此混合物填入固相萃取柱，用适当的溶剂将目标化合物洗脱下来，目前文献报道的基质固相分散萃取技术，特别是针对天然产物领域，其药材量和吸附剂的量以及洗脱剂的用量较大，尤其洗脱剂用量在10mL以上，对环境会造成污染。

基质固相分散萃取的核心因素是吸附剂。吸附剂种类的不同将直接影响实验效果。近年来，用于基质固相分散萃取的吸附剂材料种类繁多。目前，选作基质固相分散萃取的吸附剂包括：弗罗里硅土、C18反相硅胶、氧化铝等。

1932年，McBain提出了“分子筛”的概念。分子筛是指其内部具有均匀的微孔，其孔径与一般分子大小相当的一类物质。由于分子筛的特殊内部结构，使得其比表面积十分庞大，故而分子筛的应用非常广泛，例如可以作选择性吸附剂、高效干燥剂、催化剂、离子交换剂等。

截止目前，基于微量体系的基质固相分散萃取技术，在整个分析化学领域中未见报道，且以分子筛作为吸附剂，并结合基质固相分散萃取技术，在中药的活性成分提取检测方面也尚未见报道，该方法对于中药陈皮的提取检测这一研究领域更是一片空白。

发明内容

本发明的目的在于寻求一种比以往更加高效环保的中药提取检测技术，使其应用于陈皮药材提取检测。发明要点在于创造性地将分子筛作为吸附剂，并应用在基质固相分散萃取领域。分子筛作为基质固相分散萃取的吸附剂与陈皮药材中的目标分子吸附结合，可使目标分子从药材粉末中快速提取、收集，且本发明在一个微量体系中实施，相比药典的提取方法，本发明的有机溶剂使用量大大减少。

本发明具体提供了一种以分子筛作为吸附剂，结合基质固相分散萃取技术，提取为微量中药药材中目标分子的方法。可用于提取检测微量陈皮药材中的黄酮类有效成分。

本发明采用的技术方案是：

一种提取中药陈皮中的黄酮类有效成分的方法，所述黄酮类有效成分为橙皮苷、川陈皮素、桔皮素中的一种或两种以上，所述方法包括以下步骤：

取陈皮药材粉末和分子筛吸附剂，以质量比1：0.25～3比例混合，加入研钵中研磨，取固相萃取小柱，底部加入筛板，用研磨好的固体填充小柱，将填料填实后顶部再加入筛板，将填好的小柱置于固相萃取仪上，取洗脱剂，注入小柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对小柱进行洗脱，底部用离心管收集洗脱液，洗脱结束后，将离心管内洗脱液涡旋、离心，取上层清液即为黄酮类有效成分提取液；

本发明所述分子筛吸附剂可于市场上直接购买获得，本发明实施例中所用的分子筛吸附剂购于南京先丰纳米材料科技有限公司，型号为SBA-15。

所述陈皮药材粉末和分子筛吸附剂的质量比为1：0.25～3，优选为1:1。

所述研磨的时间为110s-190s，优选为150s。

所述固相萃取小柱有不同体积规格，根据陈皮药材粉末和分子筛吸附剂研磨后固体的体积量来选择合适体积的固相萃取小柱即可，这是本领域技术人员公知的。

所述的洗脱剂优选甲醇、乙醇、乙腈、丙酮或乙酸乙酯，优选为甲醇。

所述洗脱剂的体积用量优选以陈皮药材粉末的质量计为0.016～0.032mL/mg，优选0.02mg/mL。所述离心优选在13000rpmin离心5min。

进一步，本发明方法针对微量样品，优选按以下步骤操作：

称取陈皮药材粉末25mg、按照质量比1:1称取分子筛25mg，加入研钵中研磨150s，取1mL规格固相萃取小柱，底部加入筛板，用研磨好的固体填充小柱，将填料填实后顶部再加入筛板，将填好的小柱置于固相萃取仪上，取0.5mL甲醇，注入小柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对小柱进行洗脱，底部用1.5mL规格离心管收集洗脱液，洗脱结束后，将离心管内洗脱液涡旋10s，后放入离心仪中，13000rpm离心5min，取上层清液即为黄酮类有效成分提取液。

本发明可通过超高效液相色谱仪(UPLC)测定陈皮药材中有效成分的含量来表征该基质固相分散萃取方法的有效性。

本发明制得的黄酮类有效成分提取液可用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析，得到提取液的液相色谱图；

然后以橙皮苷的对照品配制不同浓度的对照品溶液，按照提取液同样条件用超高效液相色谱仪检测，获得橙皮苷对照品的液相色谱图，以橙皮苷对照品的进样量为横坐标，以橙皮苷对照品的液相色谱图中色谱峰的峰面积为纵坐标制作橙皮苷素标准曲线，按同样方法制作川陈皮素标准曲线、桔皮素标准曲线；根据提取液的液相色谱图中各色谱峰的峰面积及各成分的标准曲线，计算得到提取液中橙皮苷、川陈皮素、桔皮素的含量，可相应换算得到提取的有效成分相对于陈皮药材粉末的含量。

因此本发明方法可用于检测微量的陈皮药材粉末中的黄酮类有效成分，具体的，所述方法为：

称取陈皮药材粉末25mg、按照质量比1:1称取分子筛25mg，加入研钵中研磨150s，取1mL规格固相萃取小柱，底部加入筛板，用研磨好的固体填充小柱，将填料填实后顶部再加入筛板，将填好的小柱置于固相萃取仪上，取0.5mL甲醇，注入小柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对小柱进行洗脱，底部用1.5mL规格离心管收集洗脱液，洗脱结束后，将离心管内洗脱液涡旋10s，后放入离心仪中，13000rpm离心5min，取上层清液即为黄酮类有效成分提取液；黄酮类有效成分提取液用超高效液相色谱仪采样分析，得到提取液的液相色谱图；

然后以橙皮苷的对照品配制不同浓度的对照品溶液，按照提取液同样条件用超高效液相色谱仪检测，获得橙皮苷对照品的液相色谱图，以橙皮苷对照品的进样量为横坐标，以橙皮苷对照品的液相色谱图中色谱峰的峰面积为纵坐标制作橙皮苷素标准曲线，按同样方法制作川陈皮素标准曲线、桔皮素标准曲线；根据提取液的液相色谱图中各色谱峰的峰面积及各成分的标准曲线，计算得到提取液中橙皮苷、川陈皮素、桔皮素的含量，可相应换算得到提取液中提取的有效成分相对于陈皮药材粉末的含量。

本发明检测微量的陈皮药材粉末中的黄酮类有效成分的检测限可达橙皮苷0.04ng，川陈皮素0.06ng，桔皮素0.05ng，对微量样品具有很好的提取检测效果。

本发明的优点在于：

1.本发明方法将基质固相分散萃取技术用于中药药材的提取检测，首次采用分子筛这一独特的吸附材料，具有独创性，在国内外的期刊专利中均未见报道，属首例。

2.本方法创造性地采用了微量体系下进行提取检测，无论是采用的药材质量还是分子筛质量，以及所使用的有机溶剂，用量极低。中国药典中所述的提取方法为：取本品粗粉约lg，精密称定，置索氏提取器中，加石油醚(60-90℃)80mL，加热回流2-3小时，弃去石油醚，药渣挥干，加甲醇80mL，再加热回流至提取液无色，放冷，滤过，滤液置100mL量瓶中，用少量甲醇分数次洗涤容器，洗液滤入同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。可测得提取液中含量为橙皮苷35.9039mg/g、川陈皮素7.1693mg/g、桔皮素5.3440mg/g。相比药典的提取方法，本发明的方法使用的有机溶剂仅为0.5mL甲醇，显著减少了有机溶剂的使用和使用有机溶剂之后对环境产生的污染，大大提高了环境保护效益。

3.本方法在基质固相分散萃取的洗脱环节，所消耗时间仅在2.5min左右，这就使得整个萃取流程效率高，而且整体流程快速便捷。

4.本发明所述的分子筛材料，均具备一系列优异突出的的物理化学性质：比表面积高，吸附效率比常规基质固相分散萃取吸附剂的效率高，化学稳定性和热稳定性良好，耐酸碱腐蚀，对人体无毒、不污染环境，不燃，使得操作人员的实验环境安全可靠。

5.本发明提供的实验效率高，操作环境安全，操作步骤简洁明了，操作人员无需额外培训即可进行试验操作。

即本发明创造性地提供了一种中药的微量提取方法，该方法采用分子筛作为吸附剂，结合基质固相分散萃取技术，能高效、环保地提取和检测陈皮药材中的黄酮类有效成分。

附图说明

图1为本发明基质固相分散萃取方法的工艺流程图。

图2为考察不同种类吸附剂的基质固相分散萃取效果柱状图。图中，1、2、3分别代表陈皮中不同的有效成分，分别为：1：橙皮苷、2：川陈皮素、3：桔皮素。A、B、C、D代表不同的吸附剂，分别为：A：分子筛、B：弗罗里硅土、C：C18反相硅胶、D：氧化铝。

图3为考察药材和分子筛之间不同质量比例下的基质固相分散萃取效果柱状图。图中，1、2、3分别代表陈皮中不同的有效成分，分别为：1：橙皮苷、2：川陈皮素、3：桔皮素。A、B、C、D、E代表不同的质量比例(药材：分子筛)，分别为：A：4:1、B：2:1、C：1:1、D：1:2、E：1:3。

图4为考察不同种类洗脱剂的基质固相分散萃取效果柱状图。图中，1、2、3分别代表陈皮中不同的有效成分，分别为：1：橙皮苷、2：川陈皮素、3：桔皮素。A、B、C、D、E代表不同的洗脱液，分别为：A：甲醇、B：乙醇、C：乙腈、D：丙酮、E：乙酸乙酯。

图5为考察不同体积洗脱剂的基质固相分散萃取效果折线图。图中，1、2、3分别代表陈皮中不同的有效成分，分别为：1：橙皮苷、2：川陈皮素、3：桔皮素。图中横坐标为洗脱剂体积，单位mL。

图6为考察不同研磨时间的基质固相分散萃取效果折线图。图中，1、2、3分别代表陈皮中不同的有效成分，分别为：1：橙皮苷、2：川陈皮素、3：桔皮素。图中横坐标代表研磨时间，单位s。

图7为考察研磨过程中水的加入量的不同，对基质固相分散萃取效果影响的柱状图。图中，1、2、3分别代表陈皮中不同的有效成分，分别为：1：橙皮苷、2：川陈皮素、3：桔皮素。A、B、C、D代表不同的水加入量，分别为：A：不加水、B：加入5μL、C：加入10μL、D：加入15μL。

图8为考察辅助吸附剂和分子筛之间加入比例，对基质固相分散萃取效果影响的折线图。图中，1、2、3分别代表陈皮中不同的有效成分，分别为：1：橙皮苷、2：川陈皮素、3：桔皮素。A、B、C、D代表不同的辅助吸附剂和分子筛之间的质量比(辅助吸附剂：分子筛)，分别为：A：不加辅助吸附剂、B：1：4、C：1：2、D：1:1。

图9为考察洗脱剂中乙酸的体积分数，对基质固相分散萃取效果影响的折线图。图中，1、2、3分别代表陈皮中不同的有效成分，分别为：1：橙皮苷、2：川陈皮素、3：桔皮素。A、B、C、D、E、F代表甲醇中不同的乙酸体积分数，分别为：A：不加乙酸、B：1％乙酸、C：2％乙酸、D：3％乙酸、E：4％乙酸、F：5％乙酸。

图10为陈皮混合对照品的液相色谱图。图中，1、2、3分别代表陈皮中不同的有效成分，分别为：1：橙皮苷、2：川陈皮素、3：桔皮素。

图11为黄酮类有效成分提取液的液相色谱图。图中，1、2、3分别代表陈皮中不同的有效成分，分别为：1：橙皮苷、2：川陈皮素、3：桔皮素。

具体实施方式

通过以下实例来对本发明所提供的检测方法进行更为详细的描述。由于其应用范围广，故具体实施方案也多，下面将结合几个实例的讨论对本发明的内容作进一步的阐述。

陈皮对照品溶液的制备方法具体步骤为：分别取橙皮苷、川陈皮素、桔皮素的对照品适量，精密称定，混合置棕色量瓶中，加甲醇制成每lmL含橙皮苷500μg、川陈皮素500μg、桔皮素500μg的溶液，即得对照品溶液。

本发明实施例中所用的分子筛吸附剂购于南京先丰纳米材料科技有限公司，型号为SBA-15。

实施例1

称取4份陈皮药材粉末各25mg分别加入4组研钵中，并称取不同种类的吸附剂(分子筛、弗罗里硅土(Florisil)、C18反相硅胶、氧化铝)各25mg，分别加入4组研钵中与陈皮药材粉末研磨150s。取4支1mL规格固相萃取小柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的固体填充小柱，将填料填实后顶部均加入筛板。将填好的4支小柱置于固相萃取仪上。取0.5mL甲醇，注入小柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对小柱逐一进行洗脱。底部分别用4个1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将每个离心管内液体均涡旋10s，后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液，即为黄酮类有效成分提取液，分别取样用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

实施例所用仪器为Waters Acquity Uplc H-Class。色谱柱：ACQUITYBEH C18，1.7μm，2.1×50mm(Waters)。检测波长：283nm。柱温：40℃。进样量：0.2μL。流速0.4mL/min，流动相：A：0.1v％甲酸水，B：甲醇。梯度洗脱：0～2min，30％～45％B；2～4min，45％～45％B；4～6min，55％～70％B；6～7min，70％～80％B；7～8min，80％～90％B，8～9min，90％～100％B，9～10min，100％～100％B，10～11min，100％～30％B。

实验结果如下表1，表1中的数据为峰面积。

表1.

1代表橙皮苷、2代表川陈皮素、3代表桔皮素。

不同种类吸附剂的固相萃取效果柱状图如图2所示。结果显示，分子筛的富集效果最优，可能的原因是，相比其他种类的吸附剂，分子筛其性能优异的内部结构——多空通道，使得能够更好地吸附陈皮中的活性成分。

实施例2

称取5份陈皮药材粉末各25mg分别加入5组研钵中，并称取不同质量(6.25mg、12.5mg、25mg、50mg、75mg)的分子筛，分别加入5组研钵中与陈皮药材粉末研磨150s。取5支1mL规格固相萃取小柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的固体填充小柱，将填料填实后顶部均加入筛板。将填好的5支小柱置于固相萃取仪上。取0.5mL甲醇，注入小柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对小柱逐一进行洗脱。底部分别用5个1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将每个离心管内液体均涡旋10s，后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

实验结果如下表2，表2中的数据为峰面积。

表2.

1代表橙皮苷、2代表川陈皮素、3代表桔皮素。

不同的药材与分子筛之间质量比例，对基质固相分散萃取效果的影响如图3所示。随着分子筛加入量的增大，基质固相分散萃取的效果逐步增大，直到药材和分子筛比例为1:1时达到最佳，后随着分子筛加入量的增大，分子筛的效果趋向饱和，并且吸附剂增大会稍微影响洗脱效果，使得更得活性分成残留在分子筛孔道内部，变得难以洗脱，故药材与分子筛质量比1:1是最佳比例。

实施例3

称取5份陈皮药材粉末各25mg分别加入5组研钵中，并称取5份25mg分子筛，分别加入5组研钵中与陈皮药材粉末研磨150s。取5支1mL规格固相萃取小柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的固体填充小柱，将填料填实后顶部均加入筛板。将填好的5支小柱置于固相萃取仪上。取0.5mL不同种类的洗脱剂(甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯)，分别注入小柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对小柱逐一进行洗脱。底部分别用5个1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将每个离心管内液体均涡旋10s，后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

实验结果如下表3，表3中的数据为峰面积。

表3.

1代表橙皮苷、2代表川陈皮素、3代表桔皮素。

不同种类洗脱剂的基质固相分散萃取效果柱状图见图4。结果显示，甲醇的富集效果最优，这与陈皮中活性成分的结构有关，陈皮中主要包括黄酮类的橙皮苷、川橙皮素、桔皮素等，根据相似相容原理，极性接近的物质溶解度最佳，综合比较这5类溶剂，甲醇的效果最佳。

实施例4

称取5份陈皮药材粉末各25mg分别加入5组研钵中，并称取5份25mg分子筛，分别加入5组研钵中与陈皮药材粉末研磨150s。取5支1mL规格固相萃取小柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的固体填充小柱，将填料填实后顶部均加入筛板。将填好的5支小柱置于固相萃取仪上。取不同体积(0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL)的甲醇，分别注入小柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对小柱逐一进行洗脱。底部分别用5个1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将每个离心管内液体均涡旋10s，后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

实验结果如下表4，表4中的数据为峰面积。

表4.

1代表橙皮苷、2代表川陈皮素、3代表桔皮素。

不同体积洗脱剂的基质固相分散萃取效果折线图如图5所示。结果显示，洗脱液体积为0.4mL时，未能充分将分子筛中的活性成分洗脱下来，而当体积大于0.5mL时，随着加入量的增加，洗脱液本身浓度也变稀，使得萃取效果降低，综合两者情况考虑，洗脱液体积0.5mL是最佳选择。

实施例5

称取5份陈皮药材粉末各25mg分别加入5组研钵中，并称取5份25mg分子筛，分别加入5组研钵中与陈皮药材粉末研磨不同的时间(110s、130s、150s、170s、190s)。取5支1mL规格固相萃取小柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的固体填充小柱，将填料填实后顶部均加入筛板。将填好的5支小柱置于固相萃取仪上。取0.5mL的甲醇5份，分别注入小柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对小柱逐一进行洗脱。底部分别用5个1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将每个离心管内液体均涡旋10s，后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

实验结果如下表5，表5中的数据为峰面积。

表5.

1代表橙皮苷、2代表川陈皮素、3代表桔皮素。

不同研磨时间下的基质固相分散萃取效果折线图见图6。结果显示，研磨时间从110s增大到150s，萃取效果变大，可能原因是时间变久能将药材粉末和分子筛更加充分的混匀，使得活性成分更好地被吸附到分子筛中。当时间大于150s之后，基质固相分散萃取的效果就趋于平缓，可能原因是两者混合程度已经在150s处达到饱和，陈皮中活性成分已经基本被分子筛完全吸附，再增加研磨时间，不会增加萃取效果，反而稍微下降，因为过量的活性成分被过度吸附到分子筛的孔道中，变得难以洗脱下来。

实施例6

称取4份陈皮药材粉末各25mg分别加入4组研钵中，并称取4份25mg分子筛，其中一组作为空白，剩下3组分别加入不同量(5μL、10μL、15μL)的水，之后将4组研钵中混合物质研磨150s。取4支1mL规格固相萃取小柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的固体填充小柱，将填料填实后顶部均加入筛板。将填好的4支小柱置于固相萃取仪上。取0.5mL甲醇，注入小柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对小柱逐一进行洗脱。底部分别用4个1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将每个离心管内液体均涡旋10s，后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

实验结果如下表6，表6中的数据为峰面积。

表6.

1代表橙皮苷、2代表川陈皮素、3代表桔皮素。

研磨过程中不同含水量的基质固相分散萃取效果柱状图如图7所示。结果显示，加水研磨会降低基质固相分散萃取的效果。因为加水之后，在研磨期间，所有的混合物都粘附在研钵内壁，变得难研磨，混合物研磨完毕之后要将混合物从研钵内壁刮下来填柱，但加水组相比不加水组更难刮下，这就使得投料有损失，最终导致效果变差。而且加水量越大，这种损失越明显，萃取效果越差。因此不加水研磨为最佳。

实施例7

称取4份陈皮药材粉末各25mg分别加入4组研钵中，并称取4份25mg分子筛，将4组研钵中混合物质研磨150s。取4支1mL规格固相萃取小柱，底部均加入筛板，其中一支作为空白，剩余3支在筛板上填充不同质量(6.25mg、12.5mg、25mg)的C18反相硅胶，然后分别用研磨好的固体填充小柱，将填料填实后顶部均加入筛板。将填好的4支小柱置于固相萃取仪上。取0.5mL甲醇，注入小柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对小柱逐一进行洗脱。底部分别用4个1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将每个离心管内液体均涡旋10s，后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

实验结果如下表7，表7中的数据为峰面积。

表7.

1代表橙皮苷、2代表川陈皮素、3代表桔皮素。

不同的辅助吸附剂和分子筛之间的质量比例，对基质固相分散萃取效果影响柱状图如图8所示。结果显示，加入辅助吸附剂只会降低基质固相分散萃取效果，因为底部多垫一层吸附剂相当于对活性成分进行二次吸附，势必会对洗脱液造成损失，而且加入辅助吸附剂越多，这种效果越明显。因此不加辅助吸附剂为最佳。

实施例8

称取5份陈皮药材粉末各25mg分别加入5组研钵中，并称取5份25mg分子筛，分别加入5组研钵中与陈皮药材粉末研磨150s。取5支1mL规格固相萃取小柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的固体填充小柱，将填料填实后顶部均加入筛板。将填好的5支小柱置于固相萃取仪上。取0.5mL不同体积分数(0％、1％、2％、3％、4％、5％，v/v)的乙酸的甲醇溶液，分别注入小柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对小柱逐一进行洗脱。底部分别用5个1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将每个离心管内液体均涡旋10s，后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

实验结果如下表8，表8中的数据为峰面积。

表8.

1代表橙皮苷、2代表川陈皮素、3代表桔皮素。

洗脱液中不同的乙酸体积分数，对基质固相分散萃取效果影响柱状图如图9所示。结果显示，甲醇中加入乙酸只会降低基质固相分散萃取的效果。可能原因是，加入乙酸后，稍微改变了洗脱液的pH，而pH越低，陈皮中的活性成分就越难以溶解，故效果逐级降低。因此以不加乙酸的纯甲醇为洗脱剂为最佳。

日内精密度

称取陈皮药材粉末25mg、分子筛25mg，加入研钵中研磨150s。取1mL规格固相萃取小柱，底部加入筛板，用研磨好的固体填充小柱，将填料填实后顶部再加入筛板。将填好的小柱置于固相萃取仪上。取0.5mL甲醇，注入小柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对小柱进行洗脱。底部用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将离心管内液体涡旋10s，后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。在同一天内连续进样6次。

日间精密度

称取陈皮药材粉末25mg、分子筛25mg，加入研钵中研磨150s。取1mL规格固相萃取小柱，底部加入筛板，用研磨好的固体填充小柱，将填料填实后顶部再加入筛板。将填好的小柱置于固相萃取仪上。取0.5mL甲醇，注入小柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对小柱进行洗脱。底部用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将离心管内液体涡旋10s，后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。将该样品连续进样3天，每天2次。

日内、日间精密度实验结果汇总如下表9：

表9.

重复性考察

参照下列实验步骤，平行做5组，作为考察。

称取陈皮药材粉末25mg、分子筛25mg，加入研钵中研磨150s。取1mL规格固相萃取小柱，底部加入筛板，用研磨好的固体填充小柱，将填料填实后顶部再加入筛板。将填好的小柱置于固相萃取仪上。取0.5mL甲醇，注入小柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对小柱进行洗脱。底部用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将离心管内液体涡旋10s，后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

药材含量测定

称取陈皮药材粉末25mg、分子筛25mg，加入研钵中研磨150s。取1mL规格固相萃取小柱，底部加入筛板，用研磨好的固体填充小柱，将填料填实后顶部再加入筛板。将填好的小柱置于固相萃取仪上。取0.5mL甲醇，注入小柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对小柱进行洗脱。底部用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将离心管内液体涡旋10s，后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液，即为黄酮类有效成分提取液，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。获得提取液的液相色谱图。

图11为黄酮类有效成分提取液的液相色谱图。图中，1、2、3分别代表陈皮中不同的有效成分，分别为：1：橙皮苷、2：川陈皮素、3：桔皮素。

以橙皮苷、川陈皮素、桔皮素的对照品配制不同浓度的混合对照品溶液，按同样条件用超高效液相色谱检测，获得三者对照品的色谱图，以三者对照品的进样量为横坐标，以三者对照品溶液的色谱图中色谱峰的峰面积为纵坐标，分别制作橙皮苷标准曲线、川陈皮素标准曲线和桔皮素标准曲线。根据提取液的液相色谱图和标准曲线计算得到陈皮药材中橙皮苷、川陈皮素、桔皮素的含量。

橙皮苷、川陈皮素、桔皮素浓度均为100μg/mL的陈皮对照品溶液的液相色谱图如图10所示，图中，1、2、3分别代表陈皮中不同的有效成分，分别为：1：橙皮苷、2：川陈皮素、3：桔皮素。

3种成分的标准曲线以及检测限和定量限如下表10所示：

表10.

回收率实验

称取陈皮药材粉末25mg、分子筛25mg，平行做2组，其中一组加入200μg/mL的陈皮混合对照品5μL，另一组加入50μg/mL的陈皮混合对照品5μL，两组均加入研钵中研磨150s。分别取2支1mL规格固相萃取小柱，底部加入筛板，用研磨好的固体填充小柱，将填料填实后顶部再加入筛板。将填好的小柱置于固相萃取仪上。取0.5mL甲醇，分别注入小柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对小柱进行逐一洗脱。底部均用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将离心管内液体涡旋10s，后放入离心仪中，13000rpm离心5min。取上层清液装样，用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析。

重复性、含量测定、回收率实验结果汇总如下表11：

表11.

结果表明，本发明方法的重复性良好，回收率高，检测准确性高。

对照例：

按照中国药典中的提取方法为：取本品粗粉约lg，精密称定，置索氏提取器中，加石油醚(60-90℃)80mL，加热回流2-3小时，弃去石油醚，药渣挥干，加甲醇80mL，再加热回流至提取液无色，放冷，滤过，滤液置100mL量瓶中，用少量甲醇分数次洗涤容器，洗液滤入同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。所得提取液用超高效液相色谱仪(UPLC)采样分析，得到液相色谱图与标准曲线对照，可测得提取液中有效成分相对于陈皮药材的含量为橙皮苷35.9039mg/g、川陈皮素7.1693mg/g、桔皮素5.3440mg/g。而本申请方法制得的提取液中有效成分相对于陈皮药材的含量为橙皮苷87.94mg/g，川陈皮素42.76mg/g，桔皮素32.32mg/g，提取得到的有效成分含量提高了1倍以上，提取效果优秀。

Claims (10)

1.一种提取中药陈皮中的黄酮类有效成分的方法，所述黄酮类有效成分为橙皮苷、川陈皮素、桔皮素中的一种或两种以上，其特征在于所述方法包括以下步骤：

取陈皮药材粉末和分子筛吸附剂，以质量比1：0.25～3比例混合，加入研钵中研磨，取固相萃取小柱，底部加入筛板，用研磨好的固体填充小柱，将填料填实后顶部再加入筛板，将填好的小柱置于固相萃取仪上，取洗脱剂，注入小柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对小柱进行洗脱，底部用离心管收集洗脱液，洗脱结束后，将离心管内洗脱液涡旋、离心，取上层清液即为黄酮类有效成分提取液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述分子筛吸附剂为SBA-15。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述陈皮药材粉末和分子筛吸附剂的质量比为1:1。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述研磨的时间为110s-190s。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述研磨的时间为150s。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的洗脱剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮或乙酸乙酯。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的洗脱剂为甲醇。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述洗脱剂的体积用量以陈皮药材粉末的质量计为0.016～0.032mL/mg。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述洗脱剂的体积用量以陈皮药材粉末的质量计为0.02mg/mL。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法按以下步骤操作：

称取陈皮药材粉末25mg、按照质量比1:1称取分子筛25mg，加入研钵中研磨150s，取1mL规格固相萃取小柱，底部加入筛板，用研磨好的固体填充小柱，将填料填实后顶部再加入筛板，将填好的小柱置于固相萃取仪上，取0.5mL甲醇，注入小柱内，打开固相萃取仪的抽气泵，对小柱进行洗脱，底部用1.5mL规格离心管收集洗脱液，洗脱结束后，将离心管内洗脱液涡旋10s，后放入离心仪中，13000rpm离心5min，取上层清液即为黄酮类有效成分提取液。