CN107271579A - 一种温郁金中倍半萜成分的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种温郁金中倍半萜成分的检测方法，所述方法为：将温郁金提取液挥干溶剂并用电泳运行缓冲液复溶，0.22μm滤膜过滤，取滤液即为待测样品，采用微乳液电动毛细管色谱法检测待测样品中各个有效成分的峰面积，分别根据莪术二酮、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯和β‑榄香烯各个对照品标准曲线，获得温郁金待测样品中莪术二酮、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯和β‑榄香烯的含量；本发明创造性地提供了一种中药中挥发油类成分的微量提取检测方法。该方法采用分子筛作为吸附剂的基质固相分散萃取技术，结合微乳液电动毛细管色谱技术，能高效、环保地提取和检测温郁金药材中挥发油类有效成分含量。

Description

一种温郁金中倍半萜成分的检测方法
(一)技术领域
本发明属于天然药物提取分析技术领域。它涉及一种温郁金中挥发油类成分的微量提取检测方法，具体地说，它涉及由分子筛TS-1作吸附剂，结合微量基质固相萃取分散技术和高效毛细管电色谱技术，用来检测中药温郁金中挥发油类有效成分含量的新方法。
(二)背景技术
温郁金(Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling)为姜科姜黄属植物，主产浙江瑞安，多为栽培，少有野生。2015版中国药典收载了温郁金来源的三味中药，包括温郁金，温莪术和片姜黄。传统医学认为，温郁金来源的药材具有活血化瘀、清心解郁、利胆退黄的功效，主要用于治疗经闭、痛经、腹胀痛、热病、刺痛、癫病发狂和黄疸尿赤等症。温郁金是著名的道地药材“浙八味”之一，其主要成分包括挥发油类和姜黄素类成分，其中挥发油类成分主要包括倍半萜类成分莪术醇、吉马酮、莪术二酮、呋喃二烯、β-榄香烯等。现代药理及临床研究表明，β-榄香烯、莪术二酮、吉马酮、莪术醇等对于多种肿瘤细胞肝癌、乳腺癌、肺癌等具有良好的抑制作用，此外这些倍半萜类成分具有抗炎、抗氧化、抗血栓及保肝等多种药理活性。因此，针对以上几种活性成分建立快速、简单、低成本、环保的含量测定方法对控制温郁金来源药材的质量有很重要的意义。
中药挥发油类成分沸点低，极不稳定，存在着许多影响挥发油含量的因素，如产地、品种、加工方法和提取方法等。目前对于温郁金的样品前处理方法主要集中在超声提取上。该方法虽然简单易行，但对目标分子的提取效率较为低下，且受基质干扰影响较大，使得分析结果相应较低。而且这一方法存在的缺陷也显而易见：实验过程会消耗大量有毒害的有机溶剂，既耗时又耗溶剂，且对实验操作人员身体有害，对环境污染严重，不符合“绿色化学”的理念。
鉴于上述局限，诸多建立在固相萃取基础上的新型提取方法应运而生，基质固相分散萃取技术就是其中一种。基质固相分散萃取(MSPD)是建立在固相萃取基础上的一种新型样品处理技术，与传统的固相萃取方法相比，它使用有机溶剂量少，对环境污染少，萃取时间短，萃取效率简洁高效，逐渐成为近年来国内外研究的一个热门领域，已经广泛地应用于天然产物分析检测领域。
当前文献中报道的基质固相分散萃取技术，特别是在天然产物领域，药材用量、吸附剂及洗脱剂的用量较大，且大多是有毒害的有机试剂，对操作员的身体有害，对环境也会造成污染。基质固相分散萃取的核心是吸附剂，吸附剂种类的不同将直接影响实验效果。常规的基质固相分散萃取技术中，所用到的吸附剂多数以C18反相硅胶、弗罗里硅土、氧化铝等为主。
分子筛是指其内部具有均匀的微孔，其孔径与一般分子大小相当的一类物质。由于具有孔径均匀、高比表面积、高吸附能力、强热稳定性等优点，分子筛的应用非常广泛，例如可以作选择性吸附剂、高效干燥剂、催化剂、离子交换剂等。
截至目前，以分子筛作为吸附剂结合基质固相分散萃取技术在中药活性成分的提取检测方面报道较少，是一种较为新颖的提取方法。而已报道的专利号CN 104297026 A一种提取中药陈皮中的黄酮类有效成分的方法及专利号CN10456919 A一种检测含中药黄芩的牙膏中黄酮类有效成分含量的方法分别以分子筛SBA-15、KIT-6为吸附剂，集中在对黄酮类成分的提取检测上。目前为止，尚未有将分子筛作为吸附剂应用于挥发油成分的提取检测的报道。本发明以温郁金中的倍半萜成分为研究对象，将分子筛TS-1引入温郁金5种倍半萜类成分的提取中，可简化提取步骤，提高提取效率，且可避免有机溶剂的残留。
另一方面，目前温郁金中倍半萜类成分的分析方法主要包括高效液相色谱法、气相色谱法、GC-MS等，通常以高效液相色谱法为主。但由于倍半萜类成分极性低，采用反相柱分离往往分析时间长、分离效率低，而且色谱柱容易被污染，柱上沉积的污染物以杂质峰的形式出现，影响分析结果。且实验过程中使用大量有毒害的有机溶剂，对实验操作人员以及环境都造成一定的危害。
毛细管电泳作为20世纪80年代以来兴起的一种新的分离分析技术，在药物分析检测中的应用日益广泛。毛细管微乳电动色谱(MEEKC)是在胶束电动毛细管色谱基础上发展起来的，以微乳液为分离介质的一种较为新型的电泳分离模式。和HPLC相比，MEEKC进样体积小(nL)、分析时间快、流动相用量少(mL)、分离效率高。此外，MEEKC分离的物质的极性范围很宽，可以同时分离水溶性、脂溶性、带电或不带电的物质，所以MEEKC在分离倍半萜类挥发油成分时具有独特优势。
综上，本发明建立了基于分子筛TS-1的基质分散固相萃取结合毛细管微乳电动色谱技术测定温郁金中五种倍半萜类成分的含量，以期为温郁金来源药材的质量控制提供一种更加绿色、简便、快速、高效的新方法。
(三)发明内容
本发明目的在于寻求一种比常规方法更快速、更绿色环保的温郁金来源药材中倍半萜类成分提取及含量测定方法。本发明要点在于将基质固相分散萃取技术和微乳液电动毛细管色谱技术结合，分子筛作为基质固相分散萃取的吸附剂与基质固相分散混合物中的目标分子吸附结合，从而使得目标分子从复杂基质中分离出来，得到含有目标分子的洗脱液。样品提取方法简单，溶剂用量少，绿色环保，同时避免了高温提取对沸点低的倍半萜类成分的损失。洗脱液采用MEEKC进行分离检测。MEEKC所分离的物质的极性范围很宽，可以同时分离水溶性、脂溶性、带电或不带电的物质。相比已报道的分析方法，MEEKC对色谱柱无污染，溶剂使用绿色环保。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种温郁金中倍半萜成分的检测方法，所述倍半萜类成分为莪术二酮、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯或β-榄香烯中的一种或两种以上的混合，所述方法为：(1)提取：将温郁金来源药材粉末与吸附剂混合，研磨，将研磨后的固体混合物转移至固相萃取柱，加入洗脱剂，底部用离心管收集洗脱液即为温郁金提取液；所述吸附剂为下列之一：硅藻土、中性Al2O3、硅胶、C18、分子筛TS-1、分子筛MCM-48、分子筛SBA-15、分子筛SAPO-11或分子筛ZCM-5；所述洗脱剂为下列之一：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、体积比1:1的甲醇-乙醇混合液或体积比1:1的甲醇-水混合液；所述温郁金来源药材粉末与吸附剂质量比为1:2～4；(2)标准曲线：分别将莪术二酮、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯和β-榄香烯用色谱甲醇配制成终浓度分别为1.356mg/mL、0.328mg/mL、1.00mg/mL、8.20mg/mL、1.63mg/mL的对照品混合溶液储备液，将储备液用电泳运行缓冲液梯度稀释成不同浓度的对照品溶液，通过微乳液电动毛细管色谱法(MEEKC)测定对照品溶液中各个对照品的峰面积，以对照品溶液中各个对照品的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，制备各个对照品标准曲线；微乳液电动毛细管色谱法所用电泳运行缓冲液浓度组成为：表面活性剂0.003～0.018g/mL、辅助表面活性剂0.034～0.066g/mL、油相0.005g/mL、有机添加剂0.1mL/mL，溶剂为5～20mmol/L硼砂缓冲液，pH值为9；所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠(SDS)，所述辅助表面活性剂为下列之一：甲醇、乙醇、正丁醇、异丙醇或正丙醇；所述油相为下列之一：乙酸乙酯、正庚烷、正己烷、正辛烷或二氯甲烷；所述有机添加剂为乙腈；(3)检测：将步骤(1)温郁金提取液挥干溶剂并用电泳运行缓冲液复溶，0.22μm滤膜过滤，取滤液即为待测样品，采用微乳液电动毛细管色谱法检测待测样品中各个有效成分的峰面积，分别根据莪术二酮、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯和β-榄香烯各个对照品标准曲线，获得温郁金待测样品中莪术二酮、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯和β-榄香烯的含量。
进一步，步骤(1)所述温郁金来源药材包括温郁金，温莪术和片姜黄，所述温郁金来源药材粉末与吸附剂质量比优选1:1。
进一步，步骤(1)所述吸附剂优选为分子筛TS-1。
进一步，步骤(1)所述研磨采用研钵研磨90～180s，优选150s。
进一步，步骤(1)所述洗脱剂优选为甲醇，所述洗脱剂的体积用量为500μL～2000μL/3ml柱体积，优选洗脱剂用量1000μL/3ml柱体积。
进一步，步骤(1)所述固相萃取柱底部放置筛板，同时在添加研磨后的固体粉末后用另一块筛板将粉末压实；洗脱剂采用加压加入的方式进行洗脱。即将混合物转移到固相萃取柱中，柱子底部和混合物的上方各放一个筛板，防止混合物损失，然后将填料压紧。取洗脱剂，注入萃取柱内，采用注射器适当加压，对萃取柱进行洗脱，底部用离心管收集洗脱液。所述固相萃取小柱有不同体积规格，根据温郁金药材粉末和分子筛吸附剂研磨后固体的体积量来选择合适体积的固相萃取小柱即可，这是本领域技术人员公知的。
进一步，步骤(2)所述微乳液电动毛细管色谱法运行电压为10～25kv(优选25kv)，检测温度为15～30℃(优选25℃)，进样条件：50mbar，3s，检测波长215nm。
进一步，步骤(2)所述辅助表面活性剂优选为正丁醇。
进一步，步骤(2)所述油相优选为乙酸乙酯。
进一步，步骤(2)所述电泳运行缓冲液终浓度组成为：SDS 0.013g/mL、正丁醇浓度0.05g/mL、乙酸乙酯浓度0.005g/mL、乙腈体积浓度0.1mL/mL，溶剂为pH 9.0、10mmol/L硼砂缓冲液。所述运行缓冲液各个组分混合后，超声20min。
进一步，步骤(3)较优的检测条件是：采用压力进样：50mbar，3s；运行电压25kv；检测温度25℃；检测波长215nm条件下对提取液进行分析检测，得到提取液的电泳谱图。进样前用运行缓冲液溶解温郁金提取液残渣，所有溶液使用前用0.22μm滤膜过滤。
在最佳检测条件下，莪术二酮、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯、β-榄香烯在40min内达到基线分离：迁移时间和峰面积的重复性RSD值分别为0.9～1.6％和1.2～4.9％；迁移时间和峰面积的日间精密度RSD值分别为2.5～3.3％和1.2～4.6％，日内精密度RSD值分别为1.4～3.2％和1.2～4.2％；迁移时间和峰面积的日内稳定性RSD值分别为1.0～2.8％和1.1～4.0％。
本发明相对现有技术，具有如下的优点：
1、本发明方法将基质固相分散萃取技术用于中药挥发油类成分的提取，采用分子筛这一独特的吸附材料，相对于常规的基质固相分散萃取吸附剂更具有创新性，并且由于其具备一系列优异突出的物理化学性质：高比表面积、高吸附率、化学稳定性和热稳定性良好，耐酸碱腐蚀，对人体无毒、不污染环境，不燃，使得操作人员的实验环境安全可靠。
2、本发明的方法使用的有机溶剂仅为1.0mL甲醇/3ml柱体积，显著减少了有机溶剂的使用和使用有机溶剂之后对环境产生的污染，大大提高了环境保护效益。在基质固相分散萃取的洗脱环节，所消耗时间仅在3min左右，这就使得整个萃取流程效率高，而且整体流程快速便捷。
3、本发明方法将微乳液电泳毛细管色谱技术用于温郁金药材中挥发油有效成分的检测，MEEKC作为一种新型的毛细管分离模式，具有分辨率高、样品用量少、操作自动化、有机溶剂用量少、环境友好等优点，并且可以同时分离水溶性、脂溶性、带电或不带电的物质。相比液相色谱法更适用于复杂基质的中药成分分析、更环保、符合绿色化学。
即本发明创造性地提供了一种中药中挥发油类成分的微量提取检测方法。该方法采用分子筛作为吸附剂的基质固相分散萃取技术，结合微乳液电动毛细管色谱技术，能高效、环保地提取和检测温郁金药材中挥发油类有效成分含量。
(四)附图说明
图1为本发明基质固相分散萃取方法的工艺流程图。
图2为微乳液电动毛细管色谱分离示意图。
图3为考察不同种类吸附剂的基质固相分散萃取效果柱状图，横坐标为不同种类吸附剂，纵坐标为峰面积，单位mAu·s。图中1、2、3、4、5分别代表温郁金中不同的挥发油类成分，分别为：1：莪术二酮；2：莪术醇；3：吉马酮；4：呋喃二烯；5：β-榄香烯。A、B、C、D、E、F、G、H、I代表不同的吸附剂，分别为：A：分子筛MCM-48、B：分子筛SBA-15、C：分子筛SAPO-11、D：分子筛ZCM-5、E：分子筛TS-1、F：硅胶、G：硅藻土、H：Al2O3、I：C18。
图4为考察温郁金药材和分子筛之间不同质量比的基质固相分散萃取效果柱状图，横坐标为不同温郁金药材与分子筛质量比，纵坐标为峰面积，单位mAu·s。图中，1、2、3、4、5分别代表温郁金中不同的挥发油类成分，分别为：1：莪术二酮；2：莪术醇；3：吉马酮；4：呋喃二烯；5：β-榄香烯。A、B、C、D、E代表不同的质量比例(温郁金药材：分子筛)，分别为：A：4:1、B：2:1、C：1:1、D：2:3、E：1:2。
图5为考察不同研磨时间的基质固相分散萃取效果柱状图，横坐标为不同研磨时间，单位s，纵坐标为峰面积，单位单位mAu·s。图中，1、2、3、4、5分别代表温郁金中不同的挥发油类成分，分别为：1：莪术二酮；2：莪术醇；3：吉马酮；4：呋喃二烯；5：β-榄香烯。
图6为考察不同种类洗脱剂的基质固相分散萃取效果柱状图，横坐标为不同种类洗脱剂，纵坐标为峰面积，单位单位mAu·s。图中，1、2、3、4、5分别代表温郁金中不同的挥发油类成分，分别为：1：莪术二酮；2：莪术醇；3：吉马酮；4：呋喃二烯；5：β-榄香烯。A、B、C、D、E、F代表不同的洗脱液，分别为：A：甲醇、B：乙醇、C：乙腈、D：丙酮、E：乙酸乙酯、F:甲醇-乙醇(50:50)、G:甲醇-水(50:50)。
图7为考察不同体积洗脱剂的基质固相分散萃取效果柱状图，横坐标为洗脱剂体积，单位mL，纵坐标为峰面积，单位mAu·s。图中，1、2、3、4、5分别代表温郁金中不同的挥发油类成分，分别为：1：莪术二酮；2：莪术醇；3：吉马酮；4：呋喃二烯；5：β-榄香烯。
图8为考察不同浓度表面活性剂SDS的微乳液电泳毛细管色谱分离效果折线图。图中横坐标为SDS浓度，单位g/mL，纵坐标为保留时间，单位min。
图9为考察不同种类辅助表面活性剂(甲醇、乙醇、正丁醇、异丙醇或正丙醇)的微乳液电泳毛细管色谱分离效果叠加图。图中，A、B、C、D、E分别代表不同的辅助表面活性剂的混合对照品电泳图，分别为：A：甲醇；B：异丙醇；C：乙醇；D：正丙醇；E：正丁醇。
图10为考察不同浓度辅助表面活性剂正丁醇的微乳液电动毛细管色谱分离效果折线图。图中，1、2、3、4、5分别代表温郁金中不同的挥成分，分别为：1：莪术二酮；2：莪术醇；3：吉马酮；4：呋喃二烯；5：β-榄香烯。图中横坐标为正丁醇浓度，单位g/mL，纵坐标为保留时间，单位min。
图11为考察不同种类油相(环己烷、正辛烷、正庚烷、正己烷、二氯甲烷或乙酸乙酯)的微乳液电泳毛细管色谱分离效果叠加图。图中，A、B、C、D、E、F分别代表不同的辅助表面活性剂的混合对照品电泳图，分别为：A：乙酸乙酯；B：正己烷；C：二氯甲烷；D：环己烷；E：正庚烷；F：正辛烷。
图12为考察不同浓度缓冲溶液的微乳液电动毛细管色谱分离效果折线图。图中，1、2、3、4、5分别代表温郁金中不同的挥成分，分别为：1：莪术二酮；2：莪术醇；3：吉马酮；4：呋喃二烯；5：β-榄香烯。图中横坐标为硼砂浓度，单位mmol/L，纵坐标为保留时间，单位min。
图13为温郁金混合对照品的色谱图。图中，1、2、3、4、5分别代表温郁金中不同的挥发油类成分，分别为：1：莪术二酮；2：莪术醇；3：吉马酮；4：呋喃二烯；5：β-榄香烯。
图14为不同提取方法提取的温郁金提取液的叠加色谱图。图中，1、2、3、4、5分别代表温郁金中不同的有效成分，分别为：1：莪术二酮；2：莪术醇；3：吉马酮；4：呋喃二烯；5：β-榄香烯。图中，A、B分别代表经不同提取方法得到的温郁金4提取液的毛细管电泳色谱图，分别为：A：超声提取；B：固相基质分散萃取(以温郁金4为例)。
图15为8种不同批次温郁金来源药材的有效成分提取液的叠加色谱图。图中，1、2、3、4、5分别代表温郁金中不同的有效成分，分别为：1：莪术二酮；2：莪术醇；3：吉马酮；4：呋喃二烯；5：β-榄香烯。图中，A、B、C、D、E、F、G、H分别代表不同批温郁金的毛细管电泳色谱图，分别为：A：片姜黄1；B：温莪术1；C：温莪术2；D：片姜黄2；E：温郁金1；F：温郁金2；G：温郁金3；H：温郁金4。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所用温郁金来源的药材粉末根据中国药典2015年版制备。
本发明实施例所用固相萃取小柱为3mL柱管，材质为PP，购自上海安谱实验科技股份有限公司。
本发明实施例所用小柱筛板规格为3mL，材质为PE，购自上海安谱实验科技股份有限公司。
本发明实施例所用分子筛TS-1孔径为0.56-0.58nm，硅钛比20-300：1，BET比表面积(m2/g)≥350，相对结晶度(％)≤95，灼减(5)≤5，优选购自南京吉仓纳米科技有限公司。
本发明实施例所用硅藻土SiO2·nH2O，优选购自上海安谱实验科技股份有限公司。
本发明实施例所用中性Al2O3，购自上海安谱实验科技股份有限公司。
本发明实施例所用硅胶mSiO2·nH2O，优选购自上海安谱实验科技股份有限公司。
本发明实施例所用C18，购自上海正亚化工有限公司。
本发明实施例所用不同种类分子筛，购自南京吉仓纳米科技有限公司。
温郁金对照品混合液的制备方法具体步骤为：分别精密称取适量莪术二酮、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯、β-榄香烯对照品，用甲醇混合溶解定容至1mL容量瓶中，制成上述各种对照品终浓度分别为0.678mg/mL、0.164mg/mL、0.500mg/mL、4.100mg/mL、0.817mg/mL的对照品混合液。
实施例1吸附剂的选择
平行称取9份温郁金药材粉末各200mg分别加入5组研钵中，并称取不同种类的吸附剂(分子筛TS-1、硅藻土、中性Al2O3、硅胶、C18、分子筛MCM-48、分子筛SBA-15、分子筛SAPO-11、分子筛ZCM-5)各200mg，分别加入9组研钵中与温郁金药材粉末研磨150s。取9支3mL规格固相萃取柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的固体填充萃取柱，将填料填实后顶部均加入筛板。取1.0mL甲醇，注入萃取柱内，采用注射器适当加压，对萃取柱进行洗脱，底部用1.5mL规格离心管收集洗脱液，洗脱结束后，将离心管内洗脱液挥干甲醇，用250μL电泳运行缓冲液复溶，用0.22μm滤膜过滤后，用高效毛细管电泳仪(HPCE)检测分析。
实施例所用仪器为Agilent 7100毛细管电泳仪(DAD检测器、控温装置、自动进样器)。毛细管柱：未涂层石英毛细管(56cm×50μm,i.d.,河北永年锐丰色谱器件有限公司)。
电泳运行缓冲液：配制10mL含SDS 0.013g、正丁醇0.05g、乙酸乙酯0.005g、乙腈1mL的10mmol/L硼砂缓冲液(pH 9.0)的电泳运行缓冲液；压力进样：50mbar，3s；运行电压25kv；检测温度25℃；检测波长215nm。实验结果如下表1，表1中的数据为峰面积(单位：mAu·s)。
表1不同吸附剂提取的挥发油有效成分峰面积(单位mAu·s)
1代表莪术二酮、2代表莪术醇、3代表吉马酮、4代表呋喃二烯、5代表β-榄香烯。
不同种类吸附剂的固相萃取效果柱状图如图3所示。结果显示，分子筛TS-1的富集效果较优。可能由于分子筛相对其他几种传统的吸附剂具有孔径细小和高比表面积的优异性能，能够更好地吸附温郁金中的倍半萜类成分。从实验结果比较而言，分子筛TS-1的提取效果相对较好。
实施例2吸附剂用量的选择
平行称取5份温郁金药材粉末各200mg分别加入5组研钵中，并称取不同质量(50mg、100mg、200mg、300mg、400mg)的分子筛TS-1，分别加入5组研钵中与温郁金药材粉末研磨150s。取5支3mL规格固相萃取柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的固体填充萃取柱，将填料填实后顶部均加入筛板。取1.0mL甲醇，注入萃取柱内，采用注射器适当加压，对萃取柱进行洗脱，底部用1.5mL规格离心管收集洗脱液，洗脱结束后，将离心管内洗脱液挥干甲醇，用250μL电泳运行缓冲液复溶，用0.22μm滤膜过滤后，用高效毛细管电泳仪(HPCE)检测分析，同实施例1，横坐标表示温郁金与吸附剂的比值，纵坐标表示峰面积(单位mAu·s)，实验结果如表2。
表2不同吸附剂量提取的挥发油有效成分峰面积(单位mAu·s)
1代表莪术二酮、2代表莪术醇、3代表吉马酮、4代表呋喃二烯、5代表β-榄香烯。
不同的药材与分子筛之间质量比例，对基质固相分散萃取效果的影响如图4所示。随着分子筛加入量的增大，基质固相分散萃取的效果逐步增大，直到药材和分子筛质量比例为1:1时达到最佳，后随着分子筛加入量的增大，分子筛的效果趋向饱和，萃取效果趋于平缓甚至略有下降。可能的原因是随着吸附剂用量增加，能更好的吸附混合固体中的活性成分，但活性成分可吸附的总量有限，吸附剂用量达到最优后，过多的吸附剂会导致活性成分从吸附剂中解吸困难，反而影响萃取效果。
实施例3研磨时间选择
平行称取4份温郁金药材粉末各200mg分别加入4组研钵中，并称取4份200mg分子筛TS-1，分别加入4组研钵中与温郁金药材粉末研磨不同的时间(90s、120s、150s、180s)。取4支3mL规格固相萃取柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的固体填充萃取柱，将填料填实后顶部均加入筛板。取1.0mL甲醇，注入萃取柱内，采用注射器适当加压，对萃取柱进行洗脱，底部用1.5mL规格离心管收集洗脱液，洗脱结束后，将离心管内洗脱液挥干甲醇，用250μL电泳运行缓冲液复溶，用0.22μm滤膜过滤后，用高效毛细管电泳仪(HPCE)检测分析，同实施例1，实验结果如表3。
表3不同研磨时间获得的挥发油有效成分峰面积(单位mAu·s)
1代表莪术二酮、2代表莪术醇、3代表吉马酮、4代表呋喃二烯、5代表β-榄香烯。
不同研磨时间下的基质固相分散萃取效果折线图见图5。结果显示，随着研磨时间增长，萃取效果变好，可能由于时间变久能将药材粉末和分子筛更加充分的混匀，使得活性成分更好地被吸附到分子筛中。研磨时间大于150s后，基质固相分散萃取的效果趋于平缓，可能原因是两者混合程度在150s处达到饱和，温郁金中活性成分已经基本被分子筛完全吸附，再增加研磨时间，不会增加萃取效果，反而稍微下降，因为活性成分被过度吸附到分子筛的孔道中，变得难以洗脱下来。
实施例4不同种类洗脱剂的选择
平行称取7份温郁金药材粉末各200mg分别加入7组研钵中，并称取7份200mg分子筛TS-1，分别加入7组研钵中与温郁金药材粉末研磨150s。取7支3mL规格固相萃取柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的固体填充萃取柱，将填料填实后顶部均加入筛板。取1mL不同种类洗脱剂(甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、甲醇—乙醇(50:50，v/v)、甲醇-水(50:50，v/v))，分别注入萃取柱内，采用注射器适当加压，对萃取柱进行洗脱，底部用1.5mL规格离心管收集洗脱液，洗脱结束后，将离心管内洗脱液挥干甲醇，用250μL电泳运行缓冲液复溶，用0.22μm滤膜过滤后，用高效毛细管电泳仪(HPCE)检测分析，同实施例1，实验结果如表4。
表4为不同种类洗脱剂提取的挥发油有效成分峰面积(单位mAu·s)
1代表莪术二酮、2代表莪术醇、3代表吉马酮、4代表呋喃二烯、5代表β-榄香烯。
不同种类洗脱剂的基质固相分散萃取效果柱状图见图6。结果显示，甲醇的富集效果较优，这可能与溶剂的穿透能力及待测成分的极性等因素相关，温郁金中倍半萜类成分极性较小，但甲醇的穿透能力较其他溶剂更强，综合比较这7类溶剂，甲醇的效果最佳。
实施例5洗脱剂用量的选择
平行称取4份温郁金药材粉末各200mg分别加入4组研钵中，并称取4份200mg分子筛TS-1，分别加入4组研钵中与温郁金药材粉末研磨150s。取4支3mL规格固相萃取柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的固体填充萃取柱，将填料填实后顶部均加入筛板。取不同体积(500μL、1000μL、1500μL、2000μL)的甲醇，分别注入萃取柱内，采用注射器适当加压，对萃取柱进行洗脱，底部用1.5mL规格离心管收集洗脱液，洗脱结束后，将离心管内洗脱液挥干甲醇，用250μL电泳运行缓冲液复溶，0.22μm滤膜过滤后，用高效毛细管电泳仪(HPCE)检测分析，同实施例1，实验结果如表5。
表5不同洗脱剂用量下挥发油有效成分峰面积(单位mAu·s)
1代表莪术二酮、2代表莪术醇、3代表吉马酮、4代表呋喃二烯、5代表β-榄香烯。
不同体积洗脱剂的基质固相分散萃取效果折现图如图7所示。结果显示，洗脱液体积低于1000μL时，未能充分将分子筛中的活性成分洗脱下来，而当体积增大至1000μL时，已可将目标物质洗脱完全。随着洗脱剂量的继续增加，萃取效果基本达到平缓状态，综合考虑，洗脱液最优体积为1000μL。
实施例6表面活性剂浓度的选择
将实施例1中电泳运行缓冲液改为分别配制10mL含不同浓度SDS 0.013～0.018g、正丁醇0.05g、乙酸乙酯0.005g、乙腈1mL的10mmol/L硼砂缓冲液(pH 9.0)的电泳运行缓冲液。经超声20min后形成微乳液，使用毛细管电泳仪考察不同的SDS浓度对温郁金药材中五种挥发油成分分离的影响，其他操作同实施例1(分子筛TS-1)。
不同浓度表面活性剂SDS的微乳液电动毛细管色谱分离效果折线图如图8所示。结果显示，各个组分的迁移时间随着SDS浓度的增加而增加，因为SDS浓度增加，使缓冲液离子强度增加，电渗流减小，微乳液滴的个数增加，从而使各组分的迁移时间随之延长。但当SDS过低时，微乳液滴的稳定性下降，峰形相对较差，基线不稳。同时，在所试验的SDS浓度范围内，温郁金的五种组分之间的分离度基本不改变，即5种成分之间并不能通过改变SDS的浓度实现分离度的提高。最终选择SDS最佳浓度为1.3％。
实施例7辅助表面活性剂种类的选择
将实施例1中电泳运行缓冲液改为分别配制10mL含不同种类辅助表面活性剂的电泳运行缓冲液，组成为：0.013g/mLSDS、0.05g/mL(甲醇、乙醇、正丁醇、正丙醇、异丙醇)、0.005g/mL乙酸乙酯、0.1mL/mL乙腈的10mmol/L硼砂缓冲液(PH 9.0)的电泳运行缓冲液，经超声20min后形成微乳液，采用毛细管电泳仪在压力进样：50mbar，3s；运行电压25kv；检测温度25℃；检测波长215nm条件下考察不同种类的辅助表面活性剂对温郁金药材中五种挥发油成分分离的影响，其他操作同实施例1(分子筛TS-1)。
不同种类辅助表面活性剂(甲醇、乙醇、正丁醇、正丙醇、异丙醇)的微乳液电动毛细管色谱分离效果叠加图如图9所示，结果显示，正丁醇为最佳辅助表面活性。图9中，A、B、C、D、E分别代表不同辅助表面活性剂的毛细管电泳分离效果图，分别为：A：甲醇；B：正丙醇；C：异丙醇；D：乙醇；E：正丁醇。
实施例8辅助表面活性剂浓度的选择
将实施例1中电泳运行缓冲液改为分别配制10mL含不浓度正丁醇的运行缓冲液，组成为：0.013g/mLSDS、(0.034g/mL、0.042g/mL、0.05g/mL、0.058g/mL、0.066g/mL)正丁醇、0.005g/mL乙酸乙酯、0.1mL/mL乙腈的10mmol/L硼砂缓冲液(PH 9.0)的电泳运行缓冲液，经超声20min后形成微乳液，采用毛细管电泳仪在压力进样：50mbar，3s；运行电压25kv；检测温度25℃；检测波长215nm条件下考察不同的正丁醇浓度对温郁金药材中五种挥发油成分分离的影响。其他操作同实施例1(分子筛TS-1)。
不同浓度辅助表面活性剂正丁醇的微乳液电动毛细管色谱分离效果折线图如图10所示，结果显示，5种成分中莪术二酮迁移时间基本稳定，莪术醇、吉马酮和呋喃二烯随着正丁醇浓度的增加迁移时间有明显的增加趋势，直至正丁醇浓度为0.05g/mL。继续加大正丁醇浓度，四种挥发油类成分迁移时间有减少的趋势。整体来看，随着正丁醇浓度增加，迁移时间窗口增大，分离度也逐渐增加。但正丁醇浓度过高会降低微乳体系的稳定性，产生破乳。考虑到迁移时间以及微乳液体系的稳定性和对实际样品的分离情况，综合考虑最终选定正丁醇浓度为0.05g/mL。
实施例9油相种类的选择
将实施例1中电泳运行缓冲液改为分别配制10mL含不同种类油相的电泳运行缓冲液，组成为：0.013g/mLSDS、0.05g/mL正丁醇、0.005g/mL(乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、环己烷、正庚烷、正辛烷)、0.1mL/mL乙腈的10mmol/L硼砂缓冲液(PH9.0)的电泳运行缓冲液，经超声20min后形成微乳液，采用毛细管电泳仪在压力进样：50mbar，3s；运行电压25kv；检测温度25℃；检测波长215nm条件下考察不同种类的油相对温郁金药材中五种挥发油成分分离的影响，其他操作同实施例1(分子筛TS-1)。
不同种类油相(乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、环己烷、正庚烷、正辛烷)的微乳液电动毛细管色谱分离效果叠加图如图11所示，结果显示，乙酸乙酯为较优。
图11中，A、B、C、D、E、F分别代表不同油相的毛细管电泳分离效果图，分别为：A：环己烷；B：正辛烷；C：正庚烷；D：正己烷；E：二氯甲烷；F：乙酸乙酯。
实施例10硼砂浓度的选择
将实施例1中电泳运行缓冲液改为分别配制10mL含不同浓度硼砂的电泳运行缓冲液，组成为：0.013g/mLSDS、0.05g/mL正丁醇、0.005g/mL乙酸乙酯、0.1mL/mL乙腈的(5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L)硼砂缓冲液(PH 9.0)的电泳运行缓冲液，经超声20min后形成微乳液，采用毛细管电泳仪在压力进样：50mbar，3s；运行电压25kv；检测温度25℃；检测波长215nm条件下考察不同的硼砂浓度对温郁金药材中五种挥发油成分分离的影响。其他操作同实施例1(分子筛TS-1)。
不同浓度硼砂的微乳电动毛细管色谱分离效果折线图如图12所示，结果显示，几种挥发油类成分均随着硼砂浓度的增大迁移时间增大，同时两组分的分离度也有逐渐增大的趋势，当缓冲溶液浓度达到10mmol/L时，五种挥发油类组分已达到分离。因此，实验选择了在最短时间内各组分彼此都能得到有效分离的硼砂浓度为10mmol/L作为缓冲液体系中缓冲溶液的浓度。
实施例11最优微乳液条件
在最佳电泳运行缓冲液：含0.013g/mLSDS、0.05g/mL正丁醇、0.005g/mL乙酸乙酯、0.1mL/mL乙腈的10mmol/L硼砂缓冲液(PH 9.0)的电泳运行缓冲液10mL；最佳检测条件：压力进样：50mbar，3s；运行电压25kv；检测温度25℃；检测波长215nm。采用实施例1方法(TS-1做吸附剂)对温郁金对照品混合液进行毛细管电泳分析，获得对照品混合液的电泳图谱(图13)，结果表明，5种有效成分之间分离度均>1.5，且在40min以内全部出峰。确定了该检测条件的可实施性。
实施例12不同提取方法的比较
为进一步探究以分子筛TS-1作吸附剂的固相基质萃取法的对温郁金倍半萜成分的提取效率，对其与超声提取法做了比较。固相基质萃取法提取温郁金倍半萜的操作同实施例1(TS-1做吸附剂，以表12中温郁金4为例)。超声提取法提取温郁金倍半萜的操作如下：精密称量温郁金药材粉末2.0g置于烧杯中，并准确量取甲醇10mL浸没药材粉末；置于超声波清洗仪超声20min后补足重量。取上清液1mL于离心管，挥干甲醇内后用250μL电泳运行缓冲液复溶，过0.22μm滤膜后，用高效毛细管电泳仪(HPCE)检测分析。对经两种不同提取方法的温郁金提取液进行毛细管电泳分析，获得不同提取方法的电泳图谱叠加图。
不同提取方法的温郁金提取液电泳叠加图如图14所示，结果显示，倍半萜类成分在基质固相分散萃取技术下能更充分地提取出来，确定了基质固相分散技术对温郁金来源药材中倍半萜类成分提取的可行性。
1代表莪术二酮、2代表莪术醇、3代表吉马酮、4代表呋喃二烯、5代表β-榄香烯。
实施例13
1、参照实施例1操作，在最佳提取条件：温郁金来源药材药材粉末200mg、分子筛TS-1为200mg(按质量比，样品：分子筛1:1)、研磨时间为150s、洗脱剂类型为甲醇、洗脱剂体积为1000μL，最佳电泳运行缓冲液条件：含0.013g/mLSDS、0.05g/mL正丁醇、0.005g/mL乙酸乙酯、0.1mL/mL乙腈的10mmol/L硼砂缓冲液(PH9.0)的电泳运行缓冲液10mL；压力进样：50mbar，3s；运行电压25kv；检测温度25℃；检测波长215nm。采用实施例1方法，对8个不同批次的温郁金(收集信息如表12所示)提取液进行微乳电动毛细管色谱分离分析，其他操作同实施例1，获得不同样品的色谱图。
8种不同批次温郁金来源的药材(温郁金、温莪术和片姜黄)5种倍半萜类成分提取液的含量测定结果如表11，不同批次温郁金来源药材的电泳叠加谱图如图15。结果表明，8种不同批次的温郁金来源药材中5种目标成分在含量上有所不同，同一批次片姜黄和温莪术中挥发油类成分含量相对较高，而温郁金中挥发油类成分相对较低，不同批次温郁金中挥发油类成分含量也有一定差别。推测与药材的不同药用部位及药材的加工方法相关。这一研究为更好控制温郁金药材的内在质量提供了科学依据。
2、标准曲线的制定：
分别精密称取莪术二酮对照品6.78mg、莪术醇对照品1.64mg、吉马酮对照品5.00mg、呋喃二烯对照品41.00mg和β-榄香烯对照品8.17mg，用甲醇溶解并定容至5mL，配制成含莪术二酮1.356mg/mL、莪术醇0.328mg/mL、吉马酮1.00mg/mL、呋喃二烯8.20mg/mL、β-榄香烯1.634mg/mL的混合对照品储备液，备用。分别精密量取混合对照品储备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9μL于1mL容量瓶，用电泳运行缓冲液定容至刻度。在最佳检测条件下，对上述莪术二酮、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯和β-榄香烯的混合对照品储备液进行毛细管电泳分析。以分析物的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
莪术二酮、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯和β-榄香烯的标准曲线、线性相关系数、线性范围和检测限如下表6。
表6各成分制标准曲线方程
3、重复性考察
称取温郁金过筛粉末200mg，分子筛TS-1为200mg，加入研钵中研磨150s，取3mL规格固相萃取柱，底部加入筛板，用研磨好的固体填充萃取柱，将填料填实后顶部再加入筛板。取1.0mL甲醇，注入萃取柱内，对萃取柱进行洗脱。底部用1.5mL离心管收集。洗脱结束后挥干甲醇，取电泳运行缓冲液250μL复溶。按照上述方法平行制样6个，在最佳检测条件下考察其重复性，其他操作同实施例1，结果见表7。
表7五种倍半萜类组分保留时间及峰面积(单位mAu·s)
4、精密度试验
称取温郁金过筛粉末200mg，分子筛TS-1为200mg，加入研钵中研磨150s，取3mL规格固相萃取柱，底部加入筛板，用研磨好的固体填充萃取柱，将填料填实后顶部再加入筛板。取1.0mL甲醇，注入萃取柱内，对萃取柱进行洗脱。底部用1.5mL离心管收集。洗脱结束后挥干甲醇，取电泳运行缓冲液250μL复溶。在一天内连续进样6次，记录其保留时间和峰面积，考察日内精密度。在连续三天内进样6次，记录保留时间和峰面积，考察日间精密度，采用步骤1的条件及实施例1检测方法，结果见表8。
表8五种倍半萜类组分保留时间及峰面积(单位mAu·s)
5、稳定性考察
称取温郁金过筛粉末200mg，分子筛TS-1为200mg，加入研钵中研磨150s，取3mL规格固相萃取柱，底部加入筛板，用研磨好的固体填充萃取柱，将填料填实后顶部再加入筛板。取1.0mL甲醇，注入萃取柱内，对萃取柱进行洗脱。底部用1.5mL离心管收集。洗脱结束后挥干甲醇，取电泳运行缓冲液250μL复溶。得到温郁金供试品溶液，室温放置0、4、8、12、24h后，在最佳检测条件下进行CE分析，采用步骤1的条件及实施例1检测方法，测定5种挥发油的峰面积。莪术二酮、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯、β-榄香烯在不同时间保留时间和峰面积的RSD结果见表9。
表9五种倍半萜类组分保留时间及峰面积(单位mAu·s)
6、加样回收率考察
(1)称取温郁金药材粉末200mg与200mg分子筛TS-1混合研磨150s。取1支3mL规格固相萃取柱，底部均加入筛板，分别用研磨好的固体填充萃取柱，将填料填实后顶部均加入筛板。取1.0mL甲醇进行洗脱，底部用1.5mL离心管收集。洗脱结束后挥干甲醇，取电泳运行缓冲液250μL复溶。经过0.22μm滤膜过滤，得到空白温郁金提取液。
(2)分别精密称取莪术二酮对照品1.054mg、莪术醇对照品0.3mg、吉马酮对照品0.422mg、呋喃二烯对照品9.42mg和β-榄香烯对照品0.7mg，用甲醇溶解并定容至1mL，配成莪术二酮、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯、β-榄香烯终浓度分别为1.05mg/mL、0.3mg/mL、0.42mg/mL、9.42mg/mL、0.70mg/mL的混合对照品溶液，备用。
(3)精密称取温郁金样品100mg，共6份，在步骤1的最佳提取条件下进行提取并得到其甲醇洗脱液。精密量取混合对照品溶液100μL分别加入6份提取液中，挥干甲醇后用250μL电泳运行缓冲液复溶，经过0.22μm滤膜过滤，得到加标温郁金对照品提取液。
在最佳检测条件下(步骤1所示)，对空白温郁金提取液及加标温郁金对照品提取液进样分析，根据其峰面积和标准曲线方程，计算得到莪术二酮、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯、β-榄香烯的加标回收率及其相对标准偏差，结果见表10。
表10加样回收率考察结果(n＝6)
表11不同温郁金来源药材种倍半萜类成分含量测定实验结果
表12不同温郁金来源药材收集信息表
综合以上结果，本发明中应用了一种比常规方法更快速且绿色环保的温郁金来源药材中倍半萜类成分提取及含量测定方法。本方法将基质固相分散萃取技术和微乳液电动毛细管色谱技术结合，分子筛作为基质固相分散萃取的吸附剂与基质固相分散混合物中的倍半萜类成分吸附结合，使得目标分子从复杂基质中分离出来，得到含有目标分子的洗脱液。洗脱液采用MEEKC进行分离检测。本发明在一个微量体系中实施，相比药典提取方法，有机溶剂使用量大大减少，安全，经济，环保，操作过程简单，分析时间短，且可用于实际药材的分析，为温郁金来源的药材中倍半萜类成分的定量分析提供了一种可靠的方法。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种温郁金中倍半萜成分的检测方法，所述倍半萜类成分为莪术二酮、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯或β-榄香烯中的一种或两种以上的混合，其特征在于所述方法为：(1)提取：将温郁金来源药材粉末与吸附剂混合，研磨，将研磨后的固体混合物转移至固相萃取柱，加入洗脱剂，收集洗脱液即为温郁金提取液；所述吸附剂为下列之一：硅藻土、中性Al2O3、硅胶、C18、分子筛TS-1、分子筛MCM-48、分子筛SBA-15、分子筛SAPO-11或分子筛ZCM-5；所述洗脱剂为下列之一：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、体积比1:1的甲醇-乙醇混合液或体积比1:1的甲醇-水混合液；所述温郁金来源药材粉末与吸附剂质量比为1:2～4；(2)标准曲线：分别将莪术二酮、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯和β-榄香烯用色谱甲醇配制成终浓度分别为1.356mg/mL、0.328mg/mL、1.00mg/mL、8.20mg/mL、1.63mg/mL的对照品混合溶液储备液，将储备液用电泳运行缓冲液梯度稀释成不同浓度的对照品溶液，通过微乳液电动毛细管色谱法测定对照品溶液中各个对照品的峰面积，以对照品溶液中各个对照品的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，制备各个对照品标准曲线；所述电泳运行缓冲液浓度组成为：表面活性剂0.003～0.018g/mL、辅助表面活性剂0.034～0.066g/mL、油相0.005g/mL、有机添加剂0.1mL/mL，溶剂为5～20mmol/L硼砂缓冲液，pH值为9；所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠，所述辅助表面活性剂为下列之一：甲醇、乙醇、正丁醇、异丙醇或正丙醇；所述油相为下列之一：乙酸乙酯、正庚烷、正己烷、正辛烷或二氯甲烷；所述有机添加剂为乙腈；(3)检测：将步骤(1)温郁金提取液挥干溶剂并用电泳运行缓冲液复溶，0.22μm滤膜过滤，取滤液即为待测样品，采用微乳液电动毛细管色谱法检测待测样品中各个有效成分的峰面积，分别根据莪术二酮、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯和β-榄香烯各个对照品标准曲线，获得温郁金待测样品中莪术二酮、莪术醇、吉马酮、呋喃二烯和β-榄香烯的含量。
2.如权利要求1所述温郁金中倍半萜成分的检测方法，其特征在于步骤(1)所述温郁金来源药材粉末与吸附剂质量比1:1。
3.如权利要求1所述温郁金中倍半萜成分的检测方法，其特征在于步骤(1)所述吸附剂为分子筛TS-1。
4.如权利要求1所述温郁金中倍半萜成分的检测方法，其特征在于步骤(1)所述研磨采用研钵研磨90～180s。
5.如权利要求1所述温郁金中倍半萜成分的检测方法，其特征在于步骤(1)所述洗脱剂为甲醇，所述洗脱剂的体积用量为500μL～2000μL/3ml柱体积。
6.如权利要求1所述温郁金中倍半萜成分的检测方法，其特征在于步骤(2)所述微乳液电动毛细管色谱法运行电压为10～25kv，检测温度为15～30℃，进样条件：50mbar，3s，检测波长215nm。
7.如权利要求1所述温郁金中倍半萜成分的检测方法，其特征在于步骤(2)所述辅助表面活性剂为正丁醇。
8.如权利要求1所述温郁金中倍半萜成分的检测方法，其特征在于步骤(2)所述油相为乙酸乙酯。
9.如权利要求1所述温郁金中倍半萜成分的检测方法，其特征在于步骤(2)所述电泳运行缓冲液终浓度组成为：0.013g/mLSDS、0.05g/mL正丁醇、0.005g/mL乙酸乙酯、0.1mL/mL乙腈，溶剂为PH 9.0、10mmol/L硼砂缓冲液。
10.如权利要求1所述温郁金中倍半萜成分的检测方法，其特征在于步骤(3)检测条件是：采用压力进样：50mbar，3s；运行电压25kv；检测温度25℃；检测波长215nm。
CN201710312699.9A 2017-05-05 2017-05-05 一种温郁金中倍半萜成分的检测方法 Pending CN107271579A (zh)

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