CN113390942A - 一种基于mspd离线预浓缩联用eks-cze在线富集测定石蒜科生物碱含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于MSPD离线预浓缩联用EKS‑CZE在线富集测定石蒜科生物碱含量的方法，所述的石蒜科生物碱为盐酸石蒜碱、氢溴酸加兰他敏。本发明将MSPD技术和EKS‑CZE在线富集技术结合，MSPD方法中，吸附剂与待测样品的目标分析物吸附结合，使目标分析物从复杂基质中分离出来，然后洗脱得到含有目标分析物的洗脱液，洗脱液随后采用EKS‑CZE在线富集模式进行分离检测。本发明方法操作简单、绿色环保，显著提高了毛细管电泳分析的检测灵敏度，重现性好，富集倍数可达1250‑1500倍，符合绿色化学的要求，为复杂基质中微量成分的测定提供了新思路。

Description

一种基于MSPD离线预浓缩联用EKS-CZE在线富集测定石蒜科 生物碱含量的方法
技术领域
本发明涉及毛细管电泳分析领域，尤其涉及一种基于MSPD(基质固相分散萃取)离线预浓缩联用EKS-CZE(电动增压-毛细管区带电泳模式)在线富集测定石蒜科生物碱含量的方法。
背景技术
石蒜碱是石蒜科植物石蒜(Lycoris radiata(L.Herit.)Herb.)鳞茎的主要活性成分之一，已被证明具有抗疟剂、抗肿瘤、抗病毒、抗真菌等多种生物活性。在石蒜科生物碱中，加兰他敏这一类苄基苯乙胺类生物碱，具有选择性抑制乙酰胆碱酯酶和调节烟碱型乙酰胆碱受体的双重功能，并被用于治疗轻中度阿尔茨海默症。
目前，对于石蒜中相关生物碱成分的测定与分析的研究较少，较常见的检测分析技术主要是液相色谱法，而经典的高效液相色谱法存在分析时间长、样品及溶剂消耗量大等不足之处。相比之下，毛细管电泳检测技术(CE)可应用于微量样品组分的高效测定，且溶剂消耗少，更加绿色环保，在中药等复杂基质的微量组分检测方面独具优势。但中药等样品的成分复杂，经传统提取方法所得到的目标物成分含量较低。因此，为了增强CE对复杂样品中微量活性物质检测的灵敏度，除了采取多步CE在线富集方法的堆叠外，还可以与其他新型的离线样品预浓缩技术相结合。
EKS，由Hirokawa等首次提出，是一种将场放大进样堆积(FESI)和瞬时等速电泳(t-ITP)两步在线堆积相结合的简单但功能强大的在线样品富集方法(Hirokawa T,Okamoto H,Ga B.High-sensitive capillary zone electrophoresis analysis byelectrokinetic injection with transient isotachophoretic preconcentration:Electrokinetic supercharging[J].Electrophoresis,2010,24(3):498-504.)。现如今，该技术已主要应用于食品添加剂、环境中农药残留以及非甾体抗炎药的检测分析，研究证明该技术可以使分析响应的灵敏度提高几个数量级，但其并未在中药有效成分分析领域被过多研究，因此，EKS在中药中微量生物碱成分分析方面具有明显优势。
MSPD是由Barker于1989年推出的一种比固相萃取(SPE)更简便的工艺(Barker,Long S A,Short A R,et al.Isolation of drug residues from tissues by solidphase dispersion[J].Journal of Chromatography A,1989,475(2):353-361.)，主要应用于固体、半固体或粘性液体样品的前处理步骤。该技术集前处理步骤中的提取与净化于一体，避免了样品损失，与SPE相比省去了溶剂萃取环节，大大减少了溶剂消耗量并提高了前处理效率，现已在中药有效成分、农药残留和天然产物活性物质测定中被广泛应用。
公开号为CN110160856A的中国专利文献公开了一种基于FASS-MCDS(场放大样品堆积-胶束溶剂堆积技术)在线富集测定生物碱含量的方法，测定的生物碱为苦参碱和氧化苦参碱，将待测样品预处理后利用FASS-MCDS两步在线富集后进行检测，再结合建立的苦参碱和氧化苦参碱的标准曲线得到样品中苦参碱和氧化苦参碱的含量。该发明操作简便、分析时间短、且需用到有机溶剂，但目标分析物的富集倍数相对较低，为169～218倍。
公开号为CN112415103A的中国专利文献公开了一种基于MSPD提取联合FESI-MCDS-MEKC(场放大样品堆积-胶束环糊精堆积反向迁移胶束)在线测定呋喃香豆素含量的方法，该发明将MSPD和FESI-MCDS-MEKC结合，分子筛作为MSPD中的吸附剂与待测样品的目标分析物吸附结合，使目标分析物从复杂基质中分离出来，然后用适当溶剂洗脱得到含有目标分析物的洗脱液，洗脱液随后采用FESI-MCDS-MEKC电泳富集模式进行分离检测。
发明内容
本发明提供了一种基于MSPD离线预浓缩联用EKS-CZE在线富集测定石蒜科生物碱含量的方法，操作简单、目标物富集效果好、绿色环保，并显著提高了毛细管电泳分析的检测灵敏度。
具体采用的技术方案如下：
一种基于MSPD离线预浓缩联用EKS-CZE在线富集测定石蒜科生物碱含量的方法，所述的石蒜科生物碱为盐酸石蒜碱、氢溴酸加兰他敏；
所述方法包括如下步骤：
(1)MSPD提取待测样品中的石蒜科生物碱
将待测样品研磨成粉末状，与吸附剂混合，研磨粉碎后获得混合粉末，将混合粉末转移至固相萃取柱内，用洗脱剂加压洗脱，将所得洗脱液离心并取上清液，挥干溶剂得到提取物；
(2)EKS-CZE(电动增压-毛细管区带电泳模式)在线富集测定石蒜科生物碱含量
对毛细管进行预处理，基于EKS-CZE进行电泳分析得到提取物中石蒜科生物碱的峰面积，将峰面积代入到相应的标准曲线中得到待测样品中石蒜科生物碱含量；
所述的电泳分析条件为：以20～60mM磷酸二氢钠(NaH2PO4)和5～25mM羟丙基-β-环糊精作为背景缓冲液；先40～60mbar压力注入前导电解质(LE)溶液，再电压+8～12kV注入样品溶液，最后40～60mbar压力注入后导电解质(TE)溶液，分离电压为+20～30kV，温度为20～30℃，检测波长为205nm。
本发明将MSPD技术和EKS-CZE在线富集技术结合，首先，在MSPD方法中，吸附剂与待测样品的目标分析物吸附结合，使目标分析物从复杂基质中分离出来，然后用适当溶剂洗脱得到含有目标分析物的洗脱液，洗脱液随后采用EKS-CZE在线富集模式进行分离检测。
本发明方法中EKS-CZE在线富集技术的机理为：首先使毛细管内充满高电导率的背景缓冲液，随之引入一定量的LE溶液以获得不同的电场强度，紧接着，电动注入低电导率的样品溶液，此时发生初步的FESI堆积，最后压力引入TE溶液。当毛细管两端施加正电压时，瞬时等速电泳(t-ITP)堆积发生。同时，离子迁移率介于TE溶液和LE溶液之间的目标分析物进行富集。到达稳态时，所有区带具有相同的迁移速度，各区带始终保持相邻，这归因于等速电泳的自身锐化效应。随着分离模式从t-ITP转换为CZE，待测样品离子因其不同的迁移率而最终被分离。
所述的待测样品为大鼠粪样或石蒜药材。
步骤(1)中，所述的吸附剂为SBA-15分子筛、ZSM-5分子筛、氟罗里硅土、硅胶或氧化铝，优选的，所述的吸附剂为SBA-15分子筛，SBA-15分子筛具有孔径均匀、比表面积大、通道清晰、水热稳定性好、孔径大小可调、易表面功能化等优点，当SBA-15分子筛为吸附剂时，盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏的提取效果较好。
步骤(1)中，所述的待测样品与吸附剂以质量比1:2.5～3.5混合，吸附剂过少，则吸附不完全；吸附剂用量过多，待测样品难以被洗脱。
步骤(1)中，所述的研磨粉碎时间为140～160s，在上述研磨时间下，样品与吸附剂之间可以实现吸附平衡，若研磨时间过长，将导致吸附作用过强而降低了最终的提取效果。
步骤(1)中，所述的洗脱剂为甲醇、乙腈、无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮。
优选的，步骤(1)中，所述的洗脱剂为甲醇。
步骤(1)中，所述的待测样品与洗脱剂的质量体积比为1mg：45～55μL，在上述范围内，洗脱剂对目标分析物的洗脱效果好，洗脱剂过多会稀释目标分析物，降低提取效率。
优选的，步骤(1)中，所述的吸附剂为SBA-15分子筛；所述的待测样品与吸附剂以质量比为1:3混合；所述的研磨粉碎时间为150s；所述的洗脱剂为甲醇；所述的待测样品与甲醇的质量体积比为1mg：50μL；所述的离心条件为：13000rpm，5min。
步骤(2)中，对毛细管进行预处理，新毛细管柱在使用之前依次用1M NaOH、0.1MNaOH、纯水分别冲洗10～20min进行活化；在每日进样前，毛细管柱依次用0.1M NaOH、纯水、背景缓冲液分别冲洗5～10min；在每两次样品分析运行之间，毛细管柱依次用0.1M NaOH、纯水、背景缓冲液分别冲洗3～5min以保持分析的重现性，且每两次运行后就需及时更换新的背景缓冲液。
优选的，以30～50mM磷酸二氢钠和15～25mM羟丙基-β-环糊精作为背景缓冲液，用磷酸调至pH为6，上述条件下，目标分析物满足完全基线分离，峰面积较大。
所述的LE溶液为氯化钾溶液，浓度为15～25mM，注入时间为20～40s。LE溶液浓度过高，分析物的峰宽明显增加，峰拖尾现象严重；LE溶液的注入时间过长，将导致t-ITP堆叠后的样品分离步骤所需的毛细管空间过短，使目标分析物的富集效果降低。
所述的样品溶液进样时间为30～90s。
综合考虑灵敏度和分离度，所述的样品溶液进样时间优选为60～80s。
所述的TE溶液为十二烷基三甲基氯化铵(DTAC)溶液或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液，浓度为10～20mM，注入时间为35～45s。TE溶液浓度过高，会使得目标分析物的富集效果下降，TE溶液注入时间过长将会导致TE溶液占据更多毛细管空间，t-ITP堆积结束后转为CZE分离模式所需空间过小，进而富集倍数降低。
优选的，所述的电泳分析条件为：以40mM磷酸二氢钠和20mM羟丙基-β-环糊精作为背景缓冲液(用磷酸调至pH为6)；先40～60mbar压力注入20mMKCl溶液30s，再电压+8～12kV注入样品溶液70s，最后40～60mbar压力注入15mM DTAC溶液40s，分离电压为+20～30kV，温度为20～30℃，检测波长为205nm。
所述的盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏的标准曲线建立方法包括：
将浓度均为0.01～0.50μg/mL的盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏的混合标准溶液基于EKS-CZE进行电泳分析，再以毛细管电泳谱图中的峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标分别绘制盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏的标准曲线。
本发明相对现有技术，具有如下的优点：
(1)本发明首次在毛细管区带电泳模式下，将基质固相分散萃取离线预浓缩技术和电动增压在线富集技术相结合，并成功应用于分离和检测中药等复杂样品基质中的石蒜科生物碱(盐酸石蒜碱、氢溴酸加兰他敏)。
(2)本发明方法操作简便、分析时间短、分离效率高、重现性好，目标分析物的富集倍数可达1250～1500倍，且有机溶剂用量少，更加符合绿色化学的要求。
附图说明
图1为盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏的结构式，A为盐酸石蒜碱，B为氢溴酸加兰他敏。
图2为吸附剂种类对MSPD提取效果的影响。
图3为待测样品与吸附剂的质量比对MSPD提取效果的影响。
图4为研磨粉碎时间对MSPD提取效果的影响。
图5为洗脱剂种类对MSPD提取效果的影响。
图6为洗脱剂体积对MSPD提取效果的影响。
图7为背景缓冲液中NaH2PO4浓度对目标分析物富集效果的影响。
图8为背景缓冲液中羟丙基-β-环糊精浓度对目标分析物富集效果和分离效果的影响，其中，A为不同羟丙基-β-环糊精浓度下的电泳图，1为氢溴酸加兰他敏的特征峰，2为盐酸石蒜碱的特征峰，B为不同羟丙基-β-环糊精下两种石蒜科生物碱的分离度。
图9为前导电解质KCl溶液的浓度及注入时间对目标分析物富集效果的影响，其中，A为KCl溶液的浓度对目标分析物峰面积和峰宽的影响，B为KCl溶液的注入时间对目标分析物富集倍数的影响。
图10为后导电解质的种类对目标分析物富集效果的影响，DTAC为十二烷基三甲基氯化铵，CTAB为十六烷基三甲基溴化铵，其中，1为氢溴酸加兰他敏的特征峰；2为盐酸石蒜碱的特征峰。
图11为后导电解质DTAC溶液的浓度及注入时间对目标分析物富集效果的影响，其中，A为DTAC溶液的浓度对目标分析物峰面积的影响，B为DTAC溶液的注入时间对目标分析物富集倍数的影响。
图12为样品溶液进样时间对目标分析物富集效果和分离效果的影响，1为氢溴酸加兰他敏的特征峰；2为盐酸石蒜碱的特征峰。
图13为石蒜药材在实施例1所述的条件下检测得到的电泳图，其中，a为石蒜药材色谱图，b为石蒜药材加标色谱图，1为氢溴酸加兰他敏的特征峰；2为盐酸石蒜碱的特征峰。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
本发明实施例所用试剂或材料市售可得：
固相萃取柱为1mL柱管，材质为PP，购自上海安谱实验科技股份有限公司。
固相萃取柱筛板规格为1mL，材质为PE，购自上海安谱实验科技股份有限公司。
ZSM-5分子筛，优选购自南京吉仓纳米科技股份有限公司。
SBA-15分子筛，优选购自南京吉仓纳米科技股份有限公司。
氟罗里硅土，优选购自国药集团化学试剂有限公司。
Al2O3，优选购自上海安谱实验科技股份有限公司。
硅胶，优选购自上海安谱实验科技股份有限公司。
实施例1
将20mg大鼠粪样粉末与60mg吸附剂SBA-15分子筛混合，研磨粉碎150s后获得混合粉末，将混合粉末转移至底部装有筛板的固相萃取柱内，于柱顶部装入筛板，压实混合填料。取1000μL的甲醇注入固相萃取柱内并用注射器适当加压，将目标分析物洗脱下来，收集洗脱液。洗脱结束后，将所得洗脱液13000rpm离心5min，取上清液置于快速溶剂挥发仪中，挥干甲醇，得到提取物。
对毛细管进行预处理：新毛细管柱在使用之前依次用1M NaOH冲洗20min、0.1MNaOH冲洗10min、纯水冲洗10min进行活化；在每日进样前，依次用0.1M NaOH、纯水、背景缓冲液分别冲洗10min；在每两次样品分析运行之间，依次用0.1M NaOH、纯水、背景缓冲液冲洗3min以保持分析的重现性，且每两次运行后就需及时更换新的背景缓冲液。
基于EKS-CZE进行电泳分析得到提取物中盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏的峰面积，将峰面积代入到相应的标准曲线中得到待测样品中盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏的含量，标准曲线的建立为实施例4。
电泳分析条件为：以40mM磷酸二氢钠和20mM羟丙基-β-环糊精作为背景缓冲液(用磷酸调pH＝6)；样品基质为纯水；先50mbar压力下注入20mMKCl溶液30s，再于+10kV电压下进样品溶液70s，最后在50mbar压力下注入15mM DTAC溶液40s。分离电压：+25kV；检测温度：25℃；检测波长：205nm。
盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏的结构式如图1-A和图1-B所示，待测样品大鼠粪样中，盐酸石蒜碱的含量为17.54μg/g，氢溴酸加兰他敏的含量为10.74μg/g。
实施例2：MSPD离线预浓缩的条件优化
(1)吸附剂种类的优化
参照实施例1的方法，以大鼠粪样粉末为待测样品，探究吸附剂种类对MSPD提取效果的影响。
不同种类的吸附剂因其自身性质的不同，对目标分析物的吸附与解吸附效果也截然不同。实验探究了SBA-15分子筛、ZSM-5分子筛与经典吸附剂(弗罗里硅土、硅胶、氧化铝)对于MSPD提取效果的影响，结果如图2所示，SBA-15分子筛和ZSM-5分子筛的提取效果明显优于其他几种传统的吸附剂，其中，SBA-15分子筛为吸附剂时，目标分析物盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏的峰面积最高，即提取效果最好，这可能是因为SBA-15型介孔二氧化硅具有结构均匀有序、比表面积大、孔体积大的特点，使得样品与吸附剂之间充分接触，因此，优选用SBA-15分子筛为吸附剂。
(2)待测样品与吸附剂质量比的优化
参照实施例1的方法，以大鼠粪样粉末为待测样品，探究待测样品与吸附剂的质量比对MSPD提取效果的影响。
待测样品与吸附剂的质量比是影响MSPD样品预浓缩效果的关键因素。实验在保持样品用量为20mg的基础上，改变吸附剂SBA-15分子筛的用量，分别以1:1、1:2、1:3、1:4和2:1的质量比探究了对相应目标分析物的提取效果，结果如图3所示，增加吸附剂用量在一定程度上可以使目标分析物的峰面积增加，提取效果更好，当待测样品与吸附剂的质量比为1:3时，两种目标分析物的峰面积增加至最大值，提取效果明显较优，但当吸附剂用量过多时，其与样品之间的相互作用力过大，导致样品残留于分子筛孔隙内难以洗脱，提取效率降低，因此，待测样品与吸附剂质量比优选为1:3。
(3)研磨粉碎时间的优化
参照实施例1的方法，以大鼠粪样粉末为待测样品，探究研磨粉碎时间对MSPD提取效果的影响。
研磨粉碎是通过摩擦力和剪切力来破坏待测样品的结构，可以大大增加待测样品与吸附剂之间的接触面积，使待测样品粉末完全分散于吸附剂表面，从而增强提取效果。本实验探究了不同研磨时间(90s、120s、150s、180s、210s)对提取效果的影响，结果如图4所示，随研磨时间的增加，目标分析物盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏的峰面积均出现先增加后降低的趋势，当研磨粉碎时间为150s时，盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏的峰面积达到相对最高值，即待测样品与吸附剂之间实现吸附平衡，继续增加研磨时间，将会导致吸附作用过强，降低了最终的提取效果，因此，研磨粉碎时间优选为150s。
(4)洗脱剂种类的优化
参照实施例1的方法，以大鼠粪样粉末为待测样品，探究洗脱剂种类对MSPD提取效果的影响。
选择合适的洗脱剂有助于排除待测样品基质中各种杂质的干扰，充分提取目标分析物。实验分别探究了洗脱剂为甲醇、乙腈、无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮时，对目标分析物盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏提取效率的影响，结果如图5所示，以甲醇为洗脱剂时，盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏的峰面积较高，提取效率较好，这可能是由于相似相溶原理，盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏在甲醇中的溶解性更强，因而甲醇更容易将目标分析物从吸附剂中洗脱下来，综上，洗脱剂优选为甲醇。
(5)洗脱剂体积的影响
参照实施例1的方法，以大鼠粪样粉末为待测样品，探究洗脱剂体积对MSPD提取效果的影响。
实验在保持待测样品用量为20mg的基础上，改变洗脱剂甲醇的体积，分别以质量体积比为1mg：12.5μL、1mg：25μL、1mg：50μL、1mg：75μL探究了对相应目标分析物的提取效果，即甲醇体积为250μL、500μL、1000μL、1500μL，由图6可知，当甲醇的用量从250μL增加至1000μL时，目标分析物的峰面积随甲醇用量的增加而增大，当甲醇体积为1000μL时，目标分析物可被甲醇充分洗脱，达到最佳提取效果，然而，洗脱剂用量过多，可能会相对稀释样品提取液，使提取效果下降，因此，甲醇的洗脱体积优选为1000μL，即待测样品与洗脱剂甲醇的质量体积比为1mg：50μL。实施例3：EKS-CZE在线富集的参数优化
(1)背景缓冲液中磷酸盐浓度的优化
参照实施例1的方法，以大鼠粪样粉末为待测样品，探究背景缓冲液中NaH2PO4浓度对目标分析物富集效果的影响。
实验探究了不同浓度(20mM、30mM、40mM、50mM、60mM)NaH2PO4的背景缓冲液对目标分析物盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏分离效果的影响，实验结果如图7所示，在NaH2PO4浓度为20～40mM时，目标分析物的峰面积和峰高均随着NaH2PO4浓度的增加而增大，这是因为高浓度的缓冲盐溶液会导致背景缓冲液与样品之间的电导率差异增大，有利于目标分析物的富集。然而，当NaH2PO4浓度继续增加时，峰面积和峰高呈下降趋势，峰展宽现象明显，焦耳热效应的产生降低了目标分析物的富集分离效果。因此，背景缓冲液中的NaH2PO4浓度优选为40mM。
(2)背景缓冲液中羟丙基-β-环糊精浓度的优化
参照实施例1的方法，以大鼠粪样粉末为待测样品，探究背景缓冲液中羟丙基-β-环糊精浓度对目标分析物富集效果和分离效果的影响。
羟丙基-β-环糊精是一种具有疏水性空腔的亲水性分子，可选择性地与目标分析物分子形成包合物，并改变分析物的物化性质，提高分析物间的分离度。为了进一步提高分离效果，实验探究了羟丙基-β-环糊精浓度分别为5mM、10mM、15mM、20mM、25mM时对目标分析物盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏分离效果的影响，结果如图8所示，两种目标分析物间的分离度随着羟丙基-β-环糊精浓度的升高而增加(图8-A)，直至羟丙基-β-环糊精浓度达到20mM，目标分析物完全基线分离(图8-B)，因此，背景缓冲液中的羟丙基-β-环糊精浓度优选为20mM。
(3)LE溶液的浓度及注入时间的优化
参照实施例1的方法，以大鼠粪样粉末为待测样品，探究前导电解质KCl溶液的浓度及注入时间对目标分析物富集效果的影响。
以KCl溶液作为前导电解质(LE)溶液，实验探究了不同LE浓度(0mM、5mM、10mM、20mM、30mM)对目标分析物盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏富集效果的影响，结果如图9-A所示，随着LE浓度的增加，目标分析物的峰面积呈逐渐上升趋势；但是当LE浓度大于20mM，盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏的峰宽明显增加，峰拖尾现象严重，因此，考虑到峰宽的变化情况，LE溶液优选为20mM的KCl溶液。
随后，基于20mM的LE溶液浓度，改变LE溶液注入时间(10s、20s、30s、40s、50s)来研究K+注入量对目标分析物富集效果的影响。如图9-B所示，LE溶液注入时间由10s增加至30s时，盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏的富集倍数增至最高点，但若继续延长注入时间，富集倍数便开始降低，富集效果减弱，这可能是因为LE溶液过长时间的注入导致t-ITP堆叠后的样品分离步骤所需的毛细管空间过短，因此，LE溶液的注入时间优选为30s。
(4)TE溶液的优化
参照实施例1的方法，以大鼠粪样粉末为待测样品，探究后导电解质的种类对目标分析物富集效果的影响。
实验探究了两种不同链长的长链季铵型离子，即十二烷基三甲基铵离子(DTAC)和十六烷基三甲基铵离子(CTAB)，对目标分析物分离效果的影响。如图10所示，1为氢溴酸加兰他敏特征峰，2为盐酸石蒜碱特征峰。相比CTAB，当DTAC作为后导电解质离子时，可获得更令人满意的富集效果，且目标分析物的峰形尖锐，检测灵敏度高。相反，当CTAB作为后导电解质离子时，两种石蒜科生物碱分析物分离效率降低，且肩峰明显，因此，TE溶液优选为DTAC溶液。
(5)TE溶液的浓度及注入时间的优化
参照实施例1的方法，以大鼠粪样粉末为待测样品，探究后导电解质DTAC溶液的浓度及注入时间对目标分析物富集效果的影响。
后导电解质离子的浓度也是影响t-ITP堆叠效果的关键因素之一。实验研究了不同TE浓度(0mM、5mM、10mM、15mM、20mM)对富集效果的影响，结果如图11-A所示。在一定范围内，目标分析物盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏的峰面积随着TE浓度的增加而增大，当TE浓度增大至15mM时，峰面积值最高，若继续提高TE浓度，目标分析物的富集效率下降。综上，TE溶液的浓度优选为15mM。
随后，实验继续探究了10～50s内不同的TE溶液注入时间对于富集效果和后续目标分析物分离的影响(见图11-B)。当TE溶液注入时间为40s时，两种石蒜科生物碱分析物的富集倍数达到最大值，但随注入时间的继续增加，TE注入量过多会占据更多毛细管空间，导致t-ITP堆积结束后转为CZE分离模式所需空间过小，进而富集倍数降低。综上，TE溶液的注入时间优选为40s。
(6)样品溶液进样时间的优化
参照实施例1的方法，以大鼠粪样粉末为待测样品，探究样品溶液进样时间对目标分析物富集效果和分离效果的影响。
增加样品溶液的进样时间是提高富集效果的最直接方法。实验在+10kV电压下，分别注入样品溶液30s、50s、70s、90s，以探究不同进样时间对目标分析物富集效果及分离效果的影响。结果如图12所示，随着样品溶液电动注入时间的增加，目标分析物盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏的峰高、峰面积均增大，富集效果不断提高。但当进样时间超过70s时，由于进样量过多，导致样品超载，使得两种石蒜科生物碱分析物的峰宽增加，且分离效果降低，开始无法达到基线分离。综上，样品溶液进样时间优选为70s。
实施例4：建立标准曲线、方法的线性范围、检出限、重现性和富集倍数
分别取适量1mg/mL标准溶液，精准配制浓度范围为0.01～0.50μg/mL盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏的混合标准溶液，在实施例1所述的检测条件下基于EKS-CZE进行电泳分析，平行测定三次，得到混合标准溶液的毛细管电泳谱图，以所得谱图中各标准品阳离子的峰面积为纵坐标、混合标准溶液中标准品的浓度为横坐标分别绘制盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏的标准曲线，完成标准曲线的构建。结果如表1所示，两种石蒜科生物碱分析物均呈现良好的线性关系，相关系数(r)在0.9982～0.9994之间。将1μg/mL混合标准溶液一天之内连续进样6次以评价日内精密度，连续3天每天进样3次来评价日间精密度，最后计算所得峰面积相对标准偏差(RSD)均低于4.92％，说明方法重现性较好。
表1方法的线性范围、检出限、重现性和富集倍数
Figure BDA0003105222100000121
富集倍数＝(本方法待测物的峰面积/常规进样待测物的峰面积)×稀释倍数。
所述常规进样条件：缓冲液含40mM NaH2PO4和20mM羟丙基-β-环糊精(pH＝6)，50mbar压力下注入100μg/mL的盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏混标溶液3s。计算得出优化后的MSPD离线预浓缩联用EKS-CZE在线富集方法使盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏的富集倍数高达1250～1500倍，有效提高了毛细管电泳对石蒜科生物碱化合物的检测灵敏度。
实施例5：MSPD离线预浓缩联用EKS-CZE在线富集方法在实际样品中的应用
采用实施例1中建立的MSPD离线预浓缩联用EKS-CZE在线富集方法对石蒜药材中盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏进行检测，得到石蒜药材样品溶液毛细管电泳谱图(图13)，将所得谱图中盐酸石蒜碱、氢溴酸加兰他敏两种分析物的峰面积分别代入实施例4构建的标准曲线中，计算得出石蒜药材中两种石蒜科生物碱分析物的含量。结果如下：
石蒜药材中，盐酸石蒜碱含量为458μg/g，氢溴酸加兰他敏含量为154.67μg/g。

Claims (10)

1.一种基于MSPD离线预浓缩联用EKS-CZE在线富集测定石蒜科生物碱含量的方法，其特征在于，所述的石蒜科生物碱为盐酸石蒜碱、氢溴酸加兰他敏；
所述方法包括如下步骤：
(1)MSPD提取待测样品中的石蒜科生物碱
将待测样品研磨成粉末状，与吸附剂混合，研磨粉碎后获得混合粉末，将混合粉末转移至固相萃取柱内，用洗脱剂加压洗脱，将所得洗脱液离心并取上清液，挥干溶剂得到提取物；
(2)EKS-CZE在线富集测定石蒜科生物碱含量
对毛细管进行预处理，基于EKS-CZE进行电泳分析得到提取物中石蒜科生物碱的峰面积，将峰面积代入到相应的标准曲线中得到待测样品中石蒜科生物碱含量；
所述的电泳分析条件为：以20～60mM磷酸二氢钠和5～25mM羟丙基-β-环糊精作为背景缓冲液；先40～60mbar压力注入前导电解质溶液，再电压+8～12kV注入样品溶液，最后40～60mbar压力注入后导电解质溶液，分离电压为+20～30kV，温度为20～30℃，检测波长为205nm。
2.根据权利要求1所述的基于MSPD离线预浓缩联用EKS-CZE在线富集测定石蒜科生物碱含量的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的吸附剂为SBA-15分子筛、ZSM-5分子筛、氟罗里硅土、硅胶或氧化铝。
3.根据权利要求1所述的基于MSPD离线预浓缩联用EKS-CZE在线富集测定石蒜科生物碱含量的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的待测样品与吸附剂以质量比1:2.5～3.5混合。
4.根据权利要求1所述的基于MSPD离线预浓缩联用EKS-CZE在线富集测定石蒜科生物碱含量的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的研磨粉碎时间为140～160s。
5.根据权利要求1所述的基于MSPD离线预浓缩联用EKS-CZE在线富集测定石蒜科生物碱含量的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的洗脱剂为甲醇、乙腈、无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮。
6.根据权利要求1所述的基于MSPD离线预浓缩联用EKS-CZE在线富集测定石蒜科生物碱含量的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的待测样品与洗脱剂的质量体积比为1mg：45～55μL。
7.根据权利要求1所述的基于MSPD离线预浓缩联用EKS-CZE在线富集测定石蒜科生物碱含量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的前导电解质溶液为氯化钾溶液，浓度为15～25mM，注入时间为20～40s。
8.根据权利要求1所述的基于MSPD离线预浓缩联用EKS-CZE在线富集测定石蒜科生物碱含量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的样品溶液进样时间为30～90s。
9.根据权利要求1所述的基于MSPD离线预浓缩联用EKS-CZE在线富集测定石蒜科生物碱含量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的后导电解质溶液为十二烷基三甲基氯化铵溶液或十六烷基三甲基溴化铵溶液，浓度为10～20mM，注入时间为35～45s。
10.根据权利要求1所述的基于MSPD离线预浓缩联用EKS-CZE在线富集测定石蒜科生物碱含量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的标准曲线建立方法为:将浓度均为0.01～0.50μg/mL的盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏的混合标准溶液利用EKS-CZE在线富集后进行检测，再以毛细管电泳谱图中的峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标分别绘制盐酸石蒜碱和氢溴酸加兰他敏的标准曲线。
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