CN103196982A - 磁性固相萃取-毛细管区带电泳测定生物样本中吡咯并喹呤醌含量的方法 - Google Patents

Abstract

磁性固相萃取-毛细管区带电泳测定生物样本中吡咯并喹呤醌含量的方法，属于生命分析技术领域。本发明采用SiO₂与不同极性的吸附剂混合组成，这些吸附剂对疏水性能不同的化合物具有不同的选择性，从而能够有效的进行分离。本方法采用的毛细管电泳法加入了修饰剂β-环糊精，首次在毛细管电泳缓冲体系中加入三氟乙酸，解决了毛细管电泳图中峰的拖尾问题，峰的对称性明显好于文献报道。本方法快速、简便，首次应用磁固相萃取技术结合毛细管电泳测定牛奶中PQQ的含量。与文献方法对比，分离效率提高了6倍。

Description

磁性固相萃取-毛细管区带电泳测定生物样本中吡咯并喹呤醌含量的方法

技术领域

磁性固相萃取-毛细管区带电泳测定生物样本中吡咯并喹呤醌含量的方法，属于生物分析技术领域。

背景技术

吡咯并喹呤醌（pyrroloquinoline quinine PQQ）是一种新的氧化还原酶辅基，主要分布于原核生物以及部分植物和哺乳动物之中，在牛奶尤其母乳中含量较高，被认为是体内必需的维生素之一。

生物样本中PQQ的分析方法有气相色谱-质谱法、高效液相色谱、毛细管电泳法等[文献方法1：Zdeneˇk Glatz*,Martina Moravcova′,Oldrˇich Janiczek，Determination of pyrroloquinoline quinone by capillary zone Electrophoresis，Journalof Chromatography B,739(2000)101–107.]。毛细管电泳是二十世纪80年代发展起来的一种快速分析方法，具有分析速度快、分离效率高、样品和试剂消耗量少的优点。与高效液相色谱法相比，毛细管柱容易清洗、使用寿命长。文献报道的PQQ毛细管电泳检测法是在缓冲体系加入β-丙氨酸，采用反相C18小柱固相萃取分离富集细胞培养基中的PQQ，检出限为0.1～0.2μM，PQQ峰型存在拖尾现象，固相萃取所用的C18小柱价格昂贵，而且步骤繁琐，工作量大。

近年来，磁纳米固相萃取技术在生物样品制备领域受到广泛关注。由于磁性萃取介质直接分散于样品溶液中，接触面大，对生物样品和液体中含固体悬浮物的样品尤其适合，样品处理简单。本发明采用SiO₂与不同极性的吸附剂混合组成，这些吸附剂对疏水性能不同的化合物具有不同的选择性，从而能够有效的进行分离。本方法快速、简便，首次应用磁固相萃取技术结合毛细管电泳测定牛奶中PQQ的含量。

本方法采用的毛细管电泳法加入了修饰剂β-环糊精，首次在毛细管电泳缓冲体系中加入三氟乙酸，解决了毛细管电泳图中峰的拖尾问题。峰的对称性明显好于文献报道。与文献方法对比，分离效率提高了6倍。

发明内容

本发明的目的在于提供一种磁性固相萃取-毛细管区带电泳测定生物样本中吡咯并喹呤醌含量的方法，使PQQ与其他较难分离的电中性杂质达到高效快速的分离。

本发明的技术方案：一种磁性固相萃取-毛细管区带电泳测定生物样本中吡咯并喹呤醌含量的方法：

（1）毛细管选择及预处理：

选用未涂层的41.5cm×50μm石英毛细管柱；新毛细管柱先依次用甲醇冲洗10min，蒸馏水冲洗5min，1mol/L NaOH溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗10-15min；每次进样前，用蒸馏水及运行缓冲液冲洗2min；

运行缓冲液及样品溶液均用0.22μm微孔针头过滤器过滤；

（2）毛细管电泳分析条件：

检测波长为249nm，进样方式为0.5psi压力进样，进样时间10.0秒，分离电压为25kv，毛细管柱温25℃；

运行缓冲液为：pH=8.8、10mmol/L硼砂-10mmol/Lβ-环糊精-质量浓度0.1%三氟乙酸的混合液。

（3）生物样本中吡咯并喹呤醌PQQ的检测

选用牛奶作为生物样本的典型，

①Fe₃O₄磁性纳米粒子的制备：

100mL1.25mM FeSO₄·7H₂O60℃下搅拌，用6M NaOH调pH至10，1h后磁性沉淀物分离，用去离子水冲洗，60℃真空干燥6h，得Fe₃O₄磁性纳米粒子；

②改性的混合磁性功能纳米粒子Fe₃O₄-SiO₂-Phenyl-C8的制备：

将制备得到的Fe₃O₄磁性纳米粒子加入到含1mM四甲氧基硅烷、1mM苯基三甲氧基硅烷和1mM辛基三甲氧基硅烷混合液中，四甲氧基硅烷:苯基三甲氧基硅烷:辛基三甲氧基硅烷体积比1:1:1，加50mL含w/v0.01%吐温-100、w/v0.02%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）的v/v12.5%甲醇和0.3mL w/v25%NH₃作催化剂，120℃搅拌回流12～16h，用水、丙酮、正己烷依次清洗多次，60℃真空干燥6h，得磁性功能纳米粒子Fe₃O₄-SiO₂-Phenyl-C8；

③牛奶样品去除蛋白

1mL牛奶加5mL甲醇，涡旋振荡2min，4000rpm离心10min，上清液用50mL McIlvaine buffer缓冲液稀释，以备磁性固相萃取；

McIlvaine buffer缓冲液为：pH7.0、0.1M柠檬酸调0.2M磷酸氢二钠溶液；

④磁性固相萃取

称取上述制备好的50mg磁性功能纳米粒子Fe₃O₄-SiO₂-Phenyl-C8于安普瓶中，分别用1mL的甲醇和水活化；加入步骤③处理后的牛奶样品溶液10mL，涡旋萃取1min，甲醇解吸3min，解吸液经氮气吹干，用pH7.0、100μL磷酸缓冲液稀释，进行毛细管电泳分析。

本发明的有益效果：本发明采用SiO₂与不同极性的吸附剂混合组成，这些吸附剂对疏水性能不同的化合物具有不同的选择性，从而能够有效的进行分离。本方法快速、简便，首次应用磁固相萃取技术结合毛细管电泳测定牛奶中PQQ的含量。

本方法采用的毛细管电泳法加入了修饰剂β-环糊精，首次在毛细管电泳缓冲体系中加入三氟乙酸，解决了毛细管电泳图中峰的拖尾问题。峰的对称性明显好于文献报道。与文献方法对比，分离效率提高了6倍。

附图说明

图1pH对PQQ保留时间的影响。

图2PQQ毛细管电泳图，运行缓冲液10mmol/L硼砂-10mmol/Lβ-环糊精，pH=8.8，分离电压25kV。

图3PQQ毛细管电泳图，运行缓冲液10mmol/L硼砂-10mmol/Lβ-环糊精，pH=8.8，0.1%三氟乙酸，分离电压25kV。

图4PQQ标准曲线。

图5a：牛奶磁固相萃取后的毛细管电泳图，b：含20μg/mL PQQ标准品的牛奶溶液经磁固相萃取后的毛细管电泳图。

具体实施方式

实施例1

（1）毛细管电泳分析条件：

未涂层石英毛细管柱（41.5cm×50μm，河北永年县锐沣色谱器件有限公司），新毛细管先用甲醇冲洗10min，蒸馏水冲洗5min，1mol/L NaOH溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗10-15min。运行缓冲液及样品溶液均用0.22μm微孔针头过滤器过滤。每次进样前，用蒸馏水和运行缓冲液冲洗2min。检测波长是249nm，进样方式为压力进样（0.5psi，10.0秒），分离电压为25kV,毛细管柱温25℃。运行缓冲液为：10mmol/L硼砂-10mmol/Lβ-环糊精混合液，pH=8.8，含有质量浓度0.1%的三氟乙酸。

（2）缓冲体系的选择

缓冲体系及浓度直接影响离子的迁移和分离。实验考察了PQQ在甘氨酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼砂缓冲体系中的分离情况。结果峰型很差，都达不到理想的分离状况。

可能PQQ分子中具有多羧基的缘故，具有较低的淌度，其淌度方向和电渗流方向相反，影响它的流出，不能得到较好的峰型。因此，本实验考虑在背景电解液中加入β-环糊精，β-环糊精上的14个仲羟基位于空腔的宽口，其疏水性空腔可以选择性地和分析物形成包合物。PQQ上的羧基与β-环糊精上的羟基能够形成稳定的包合物，从而影响样品的权均淌度，因此改善了分离。我们在不同缓冲体系（甘氨酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼砂缓冲液）中加入β环糊精，结果显示，硼砂-β环糊精缓冲体系较好，与单纯的硼砂相比，峰型有了很大的改善，能得到较尖锐的峰。

（3）硼砂浓度的选择

缓冲液浓度是一个重要的指标，对选择性的影响非常突出。我们分别用硼砂浓度5，10，15，20mmol/L实验，当浓度大于10mmol/L时，峰形严重不对称，分离效果不佳。可能随着浓度的增加，导电的离子数增加，毛细管的电流值增大，焦耳热增加；而且随着缓冲液浓度的增加，离子强度增加，电渗流速降低，溶质在毛细管内的迁移速度下降，迁移时间会延长。当浓度小于10mmol/L时，前沿拖尾较为严重。因此，我们选择硼砂浓度为10mmol/L时最为合适。

（4）pH值对迁移时间的影响

缓冲液的pH值影响可解离分析物的有效电荷，决定其在电场中的迁移速度。同时它还影响Zeta电势，通过pH值的选择可有利调整电迁移和电渗的平衡，增加分离度。分别调pH3.0、5.0、7.0、8.0、9.0实验，发现pH7.0以下，峰很宽，pH大于8.0峰较好。分别测定样品在pH值为8.5、8.8、9.0、9.5、10.0的硼砂-β环糊精缓冲溶液中迁移时间，发现pH值对保留时间有明显的变化，以pH值为横坐标，保留时间为纵坐标，作图1。

如图1看出，pH值对其保留时间有一定的影响，当pH大于9.0时，迁移时间增加，且峰形严重不对称，故选择pH小于9.0较为合适，综合考虑，最终选择pH为8.8。

（5）β-环糊精浓度的影响

β-环糊精的浓度直接影响它对分析物的包合，因此，其浓度的选择非常重要。我们改变β-环糊精的浓度，分别取5，10，12，15，20mmol/L实验。当β-环糊精浓度高于20mmol/L时,分离效果欠佳，峰型不理想；当β-环糊精浓度为10mmol/L时，峰形对称性有很大的改善，但峰的前沿和拖尾现象始终存在，有待继续优化，如图2。

（6）有机溶剂的影响

为了进一步优化分离，我们考虑添加有机溶剂来改善分离。加入有机溶剂往往可以使包合常数K增大，在低浓度的β-环糊精下达到分离。我们分别采用乙腈、乙醇等多种有机溶剂实验，考察其对样品PQQ分离效果的影响。结果表明，各种有机溶剂的加入，对峰的拖尾并无多大的改善。

（7）三氟乙酸的影响

PQQ的结构式为弱酸性，我们考虑是否可以添加三氟乙酸来改善峰的拖尾现象。我们在硼砂-β环糊精体系中，加入少量的三氟乙酸，并考察三氟乙酸浓度的影响，在缓冲体系中分别加入0.01%，0.05%，0.1%的三氟乙酸实验。实验结果证明，加入少量的三氟乙酸可以很好的改善峰形的拖尾现象，按浓度来看，选择0.1%最为合适，能最有效的使峰形变得对称，如图3。

（8）电压的选择

溶质的出峰时间对电场强度非常敏感，电场强度会影响溶质在毛细管中的停留时间。被分析物与β-环糊精形成包合物后，若各组分平均迁移率相差较大，增加电场强度能提高分离度；反之，若平均迁移率相差较小，增加电场强度并不能有效改善分离。包合是一个快速可逆平衡过程，从动力学角度讲，高温不利于包合，在高电场强度下，由于焦耳热的产生，径向温度梯度增加，使包合常数K减小，分离度降低，因此，一味增加电场强度并不是一个良策，通常需要有一个平衡。在缓冲液为10mmol/L硼砂-10mmol/Lβ-环糊精混合液，pH=8.8,含有0.1%的三氟乙酸时，考查样品PQQ在10、15、20、22、25、27kV电压下的分离情况，当电压大于25kV时，分离时间缩短，分离度降低，且基线不稳定。电压低于20kv时，分离时间较长，实验中选择25kV最为理想。

（9）线性关系与检测限测定

精密称取PQQ1.0mg，加1mL磷酸缓冲液（pH7.0），用运行缓冲液稀释成浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg/mL的标准溶液，每个样品分别重复进样3次，得峰面积取平均值，以平均峰面积为纵坐标，PQQ浓度C为横坐标作图。得标准曲线（图4）。所得回归方程为：

y=553571x+5686.8(R²=0.9996)。在0.025～1.0μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。最低检出浓度为0.05～0.1μM（S/N≥3）。

（10）生物样本中PQQ的检测

1）Fe₃O₄磁性纳米粒子的制备：

100mL1.25mM FeSO₄·7H₂O60℃下搅拌，用6M NaOH调pH至10，1h后磁性沉淀物分离，用去离子水冲洗。60℃真空干燥6h。

2）改性的混合极性功能纳米粒子Fe₃O₄-SiO₂-Phenyl-C8的制备：

将制备得到的Fe₃O₄磁性纳米粒子加入到含1mM四甲氧基硅烷(98%，tetramethylorthosilicate TMOS)，1mM苯基三甲氧基硅烷（97%，phenyltrimethoxysilane，PTMS）和1mM辛基三甲氧基硅烷（98%，octyltrimethoxysilane,C8)混合物中（1:1:1，v/v/v），加50mL含0.01%吐温-100(w/v)，0.02%CTAB(w/v)，12.5%甲醇（v/v）和0.3mL25%(w/v)NH₃作催化剂，120℃搅拌回流16h。用水、丙酮和正己烷依次清洗多次，60℃真空干燥6h。

3）牛奶样品去除蛋白

1mL牛奶加5mL甲醇，涡旋振荡2min，离心4000rpm10min，上清液用50mL McIlvaine buffer缓冲液(0.1M柠檬酸调0.2M磷酸氢二钠pH7.0)稀释，以备磁性固相萃取。

4）磁性固相萃取

称取上述制备好的50mg磁性功能纳米材料于安普瓶中，分别用1mL的甲醇和水活化；加入上述牛奶处理后的溶液10mL，涡旋萃取1min，甲醇解吸3min。解吸液经氮气吹干，用100μL磷酸缓冲液(pH7.0)稀释，进行毛细管电泳分析。如图5。

5）提取回收率与精密度测定

称取一定量的PQQ标准品适量，使其在牛奶中的浓度为20、60、100μg/L，按上述方法进行处理、萃取，经毛细管电泳分析测定PQQ的浓度，测定值除以理论值得PQQ提取回收率。结果见表1。

表1提取回收率测定

精确称取一定量的PQQ标准品适量，用磷酸缓冲液(pH7.0)溶解，配制5、20、40μg/L的高、中、低3种浓度的PQQ质控溶液，在确定的毛细管电泳条件下于同一天内连续进样5次，连续3天重复测定，以计算日内和日间精密度，用相对标准偏差（RSD%）表示。结果见表2。

表2日内日间精密度测定结果

6）样本测定

牛奶样本按上述方案处理后用磷酸缓冲液（pH7.0）稀释，超声振荡，过滤，经毛细管电泳测试，测定结果牛奶中所含PQQ分别为60.8、73.2、68.5μg/L。

（11）与[文献方法1]对比，分离效率提高了6倍。首次在毛细管电泳缓冲体系中加入三氟乙酸，解决了毛细管电泳图中峰的拖尾问题。峰的对称性明显好于文献报道。

表3分离效率比较

Claims (1)

1.一种磁性固相萃取-毛细管区带电泳测定生物样本中吡咯并喹呤醌含量的方法，其特征在于：

（1）毛细管选择及预处理：

选用未涂层的41.5cm×50μm石英毛细管柱；新毛细管柱先依次用甲醇冲洗10min，蒸馏水冲洗5min，1mol/L NaOH溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗10-15min；每次进样前，用蒸馏水及运行缓冲液冲洗2min；

运行缓冲液及样品溶液均用0.22μm微孔针头过滤器过滤；

（2）毛细管电泳分析条件：

检测波长为249nm，进样方式为0.5psi压力进样，进样时间10.0秒，分离电压为25kV，毛细管柱温25℃；

运行缓冲液为：pH=8.8、10mmol/L硼砂-10mmol/Lβ-环糊精-质量浓度0.1%三氟乙酸的混合液；

（3）生物样本中吡咯并喹呤醌PQQ的检测

选用牛奶作为生物样本的典型

①Fe₃O₄磁性纳米粒子的制备

100mL1.25mM FeSO₄·7H₂O60℃下搅拌，用6M NaOH调pH至10，1h后磁性沉淀物分离，用去离子水冲洗，60℃真空干燥6h，得Fe₃O₄磁性纳米粒子；

②改性的混合磁性功能纳米粒子Fe₃O₄-SiO₂-Phenyl-C8的制备

将制备得到的Fe₃O₄磁性纳米粒子加入到含1mM四甲氧基硅烷、1mM苯基三甲氧基硅烷和1mM辛基三甲氧基硅烷混合液中，四甲氧基硅烷:苯基三甲氧基硅烷:辛基三甲氧基硅烷体积比1:1:1，加50mL含w/v0.01%吐温-100、w/v0.02%十六烷基三甲基溴化铵的v/v12.5%甲醇和0.3mL w/v25%NH₃作催化剂，120℃搅拌回流12～16h，用水、丙酮、正己烷依次清洗多次，60℃真空干燥6h，得磁性功能纳米粒子Fe₃O₄-SiO₂-Phenyl-C8；

③牛奶样品去除蛋白

1mL牛奶加5mL甲醇，涡旋振荡2min，4000rpm离心10min，上清液用50mL McIlvaine buffer缓冲液稀释，以备磁性固相萃取；

McIlvaine buffer缓冲液为：pH7.0、0.1M柠檬酸调0.2M磷酸氢二钠溶液；

④磁性固相萃取

称取上述制备好的50mg磁性功能纳米粒子Fe₃O₄-SiO₂-Phenyl-C8于安普瓶中，分别用1mL的甲醇及水活化；加入步骤③处理后的牛奶样品溶液10mL，涡旋萃取1min，甲醇解吸3min，解吸液经氮气吹干，用pH7.0、100μL磷酸缓冲液稀释，进行毛细管电泳分析。

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