CN107224969B - 一种pqq-da印迹磁性纳米粒子的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种PQQ‑DA印迹磁性纳米粒子的制备方法及其应用，属于生物分析技术领域。本发明以磁性Fe3O4为内核，磁性Fe3O4包裹SiO2，再制备获得PQQ‑DA印迹磁性纳米粒子，形成了PQQ‑DA表面具有高识别性、高选择性的磁性纳米粒子印迹材料。这种特异性的磁性纳米粒子进行分子印迹修饰后，对目标物同时具有磁性及特异选择性，对复杂基质的脑组织中低浓度化合物的分离、净化和富集具有很大的优势。制备的PQQ‑DA印迹磁性纳米粒子用于UPLC‑MS测定生物体内PQQ‑DA痕量分析。本发明建立了基于分子印迹固相萃取的UPLC‑MS，能检测到小鼠脑内痕量PQQ‑DA的含量，检测限达到0.2×10‑11 mg/mL。对神经系统疾病的发生和机理研究具有重要指导意义。

Description

一种PQQ-DA印迹磁性纳米粒子的制备方法及其应用
技术领域
本发明公开一种PQQ-DA印迹磁性纳米粒子的制备方法及其应用，属于生物分析技术领域。
背景技术
多巴胺（DA）为脑内一种重要的神经传递质，是一种信号转导分子，参与许多生命过程，在控制认知功能和行为功能中具有重要作用。脑内DA含量的改变与多种疾病的发生有关，如孤独症、帕金森病及精神分裂症等。
吡咯并喹呤醌（PQQ）是一种氧化还原酶辅基，主要分布于原核生物以及部分植物和哺乳动物之中。PQQ在神经系统方面具有极其重要的功能，在脑中能够促进神经因子的产生对神经细胞具有神经保护作用，采用PQQ缺损建立的大鼠模型显示免疫功能及认知功能下降，已有报道PQQ对帕金森氏病具有防治作用。PQQ在神经系统方面的重要功能与其特殊的化学结构有关，能够与多种活性基团发生反应。
PQQ是否对多巴胺具有调节作用，至今无相关报道。我们发现PQQ与DA反应生成化合物PQQ-DA，其对神经系统是否具有保护作用，至今无相关研究。研究脑内PQQ-DA的含量对PQQ与多巴胺神经递质的作用机制具有重要意义。脑内PQQ-DA含量属于痕量级，一般的分析方法难以检测。常规固相萃取吸附剂特异选择性不足，容易将其他干扰物与目标物共同萃取下来。
PQQ-DA分子具有特殊结构，多羟基和酰胺基带电粒子。因此本发明以磁性Fe304为内核，四甲氧基硅烷、3-（异丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷对磁性纳米粒子表面进行包裹和修饰，将可聚合双键引入硅胶微粒表面，在引发剂作用下，使甲基丙烯酸在硅胶表面实现接枝聚合，形成接枝微粒，增强了硅胶表面的活性，形成可以进一步被多种有机官能团修饰的分子印迹聚合层。洗去模板分子后，在硅胶表面的聚合物薄层中留下了大量可匹配的空穴。而且由于PQQ-DA上的酰氨基与接枝微粒表面的功能大分子之间存在着静电相互作用与吸附作用，因而可以优先吸附与洗脱。形成了PQQ-DA表面具有高识别性、高选择性的磁性分子纳米印迹材料。这种特异性的磁性纳米粒子进行分子印迹修饰后，对目标物同时具有磁性及特异选择性。对复杂基质的脑组织中低浓度化合物的分离、净化和富集具有很大的优势。
发明内容
本发明目的是提供一种PQQ-DA印迹磁性纳米粒子的制备方法及其用于UPLC-MS测定生物体内PQQ-DA痕量分析。
建立了基于分子印迹固相萃取的UPLC-MS，能检测到小鼠脑内痕量PQQ-DA的含量，检测限达到 0.2×10 -11 mg/mL。对神经系统疾病的发生和机理研究具有重要指导意义。
本发明的技术方案：
PQQ-DA分子结构为：
一种PQQ-DA印迹磁性纳米粒子的制备方法，步骤为：
（1）Fe3O4磁性纳米粒子的制备：
100mL 1.25mM FeSO4·7H2O 在氮气的保护下以 800 rpm 的速度机械搅拌，用6MNaOH溶液调pH至10.0，1h后磁性沉淀物分离，用磁铁吸附黑色Fe3O4纳米粒子，倒去上层液体，用二次蒸馏水及乙醇分别洗涤三次，再分散悬浮于乙醇溶液中得到 5.0mg/mL 的纳米Fe3O4溶液；
（2）磁性Fe3O4包裹SiO2 的制备：
将 50 mL制备得到的Fe3O4悬浮液中加入5mL 氨水，5 mL 二次蒸馏水，10 mL含1mM四甲氧基硅烷，60℃800 rpm 速率机械搅拌10 h；加入200 μL 3-（异丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷分散于 50 mL 10%的醋酸水溶液中，继续搅拌 5h，用二次蒸馏水洗涤，得到磁性Fe3O4/SiO 2纳米粒子；
（3）PQQ-DA印迹磁性纳米粒子的制备：
取0.46g PQQ-DA加入 30 mL含0.2M甲基丙烯酸乙二醇酯溶液，超声混合30 min，N2保护下滴加5.0 g乙二醇二甲基丙烯酸酯和 0.02 g偶氮二异丁腈，加入 0.25 g 磁性Fe3O4/SiO2纳米粒子，超声30 min；将此混合液 60℃下反应 24h，得PQQ-DA印迹磁性纳米粒子。
非印迹磁性纳米粒子的制备除了不加模板分子PQQ-DA外，其他步骤和印迹磁性纳米粒子相同。
用（v/v为5/1）乙醇-甲酸混合液洗涤三次，再用二次蒸馏水洗涤三次，用外部磁场分离出磁性纳米粒子，真空干燥，分别得到磁性印迹聚合物及磁性非印迹聚合物。
（4）采用扫描电镜观察分子印迹聚合物表面，用红外光谱对分子印迹聚合物的化学结构进行表征。
图1磁性纳米粒子扫描电子显微镜显示，颗粒大小分布均匀，大致呈圆形，粒径约10 nm，基本满足超顺磁性颗粒的要求。图 2为接枝PQQ-DA印迹层后的电子扫描显微镜图，粒径约 130 nm。颗粒表面呈现粗糙多孔的特性，适合与目标分子的释放与结合，孔隙结构的厚度小于50 nm，适用于模板分子转移，能够在很短的时间内达到萃取平衡。
图3（a-c）为非印迹磁性纳米粒子、印迹磁性纳米粒子洗脱前后红外光谱图。与曲线a相比较，曲线b中3444cm-1处的-OH伸缩振动峰的红外强度明显增强，PQQ-DA中含丰富的-OH，1690 cm-1和1650 cm-1出现酰胺特征峰，2935、2855 cm-1酰胺基在无机杂化涂层出现位移。合成的印迹磁性纳米粒子中含PQQ-DA特征峰。曲线 a 和曲线 c 的峰形和强度基本一致,说明PQQ-DA能够从印迹磁性纳米粒子吸附中较好地洗脱出来，留下可以进行分子识别的空穴。
（5）吸附实验
吸附热力学特性：移取5 mL浓度分别为0.02、0.2、0.8、1.0、2.0、及4.0 mg／mL的PQQ-DA溶液，分别置于锥形瓶中；分别称取15 mg的磁性印迹聚合物和磁性非印迹聚合物，分散于不同浓度的PQQ-DA溶液中，15℃水浴恒温振荡10 h后用磁铁将粒子吸在底部，UPLC-MS测定上清液中的PQQ-DA量；以印迹磁性纳米粒子的吸附容量对PQQ-DA的初始浓度作图，绘制等温吸附线。
吸附容量(Q)为每单位质量(g)纳米粒子吸附目标分子的质量，吸附容量由其在振荡吸附前后PQQ-DA的浓度差值得到，公式为Q=（C0-Ci）V／m。C0为PQQ-DA的初始浓度（mg／mL），Ci是震荡后上清液中PQQ-DA的浓度（mg／mL），V是溶液的体积（mL），m是粒子的质量（mg）。由吸附等温线上可见，低浓度时印迹粒子的吸附容量随PQQ-DA浓度的增大而增加，在2mg／mL时达到饱和吸附，饱和吸附容量为113.8mg／g。而在相同条件下非印迹粒子的饱和吸附量仅为50.2 mg／g，印迹粒子饱和吸附量是非印迹粒子的2.3倍。
（6）印迹磁性纳米粒子用量对回收率的影响
吸附剂用量对目标物的回收率具有重要影响，粒子用量不够，不能完全吸附目标物；粒子用量过多，虽可确保目标物被充分吸附，但会影响洗脱，导致提取效率降低；我们研究了不同磁性纳米分子印迹粒子用量（2.5、5、10、15、20、25mg）对PQQ-DA回收效率的影响，结果如图5。当使用10 mg 印迹磁性纳米粒子时，回收率可达到93.5％，继续增大印迹磁性纳米粒子用量，回收率反而下降。
（7）脱附时间的影响
脱附时间对回收率有着很大的影响，为了获得最佳脱附时间，我们将吸附饱和的印迹磁性纳米粒子分散于2 mL乙醇／甲酸溶液中，置于摇床中振荡洗脱，考察不同振荡洗脱时间（5、10、15、20、30、40 min）的回收率。如图6所示，随着洗脱时间的增大，回收率也逐渐增大，洗脱20 min回收率达到93.6％，洗脱达到平衡，在实际样品分析时选择20 min为最佳洗脱时间。
用所述方法制备的PQQ-DA印迹磁性纳米粒子用于UPLC-MS测定生物体内PQQ-DA痕量分析的方法，即组织样品测定，步骤为：
（1）标准曲线制备
称取PQQ-DA，用二次蒸馏水配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL溶液，分别取20 mg 印迹磁性纳米粒子分散于250 mL上述标准溶液中；15℃振荡吸附1 h后，磁铁置于烧杯底部将印迹磁性纳米粒子吸住，弃除上清液；印迹磁性纳米粒子用去离子水洗涤后，重新分散在5 mL乙醇-甲酸（V/V为 6/1）混合溶液中。分散液超声10min后，粒子用磁铁吸至烧杯底部，取上清液稀释，进行UPLC-MS分析。用积分面积对浓度作图，得回归方程为y=1205519606X+259487（R2=0.9966），X为浓度C（mg/mL），y为积分面积，检测限达到 0.2×10-11 mg/mL。
（2）脑组织处理
脑组织称重，加组织裂解液（脑组织重量/裂解液=1g/1.5mL）匀浆，4℃ 14000rpm离心15min，上清液取出再离心15min，取出上清液，加入等体积的蛋白沉淀剂，4℃冰浴放置10min后，4℃ 14000rpm离心15min，得含目标物的上清液备用。
（3）磁性纳米分子印迹处理
取20 mg 印迹磁性纳米粒子分散于250 mL步骤（2）处理过的组织样品处理液中。15℃振荡吸附1 h后，磁铁置于烧杯底部将印迹磁性纳米粒子吸住，弃除上清液；印迹磁性纳米粒子用去离子水洗涤后，重新分散在5 mL乙醇-甲酸（V/V 为6/1）混合溶液中。分散液超声10min后，粒子用磁铁吸至烧杯底部，取上清液，氮气吹干，待用。
（4）脑组织PQQ-DA的含量测定
UPLC-MS条件：柱子1.7µm 2.1×100mm，检测器 SQ Detctor，梯度洗脱0～10min95/5水/甲醇～30/70水/甲醇。
MS图谱确认466M+为PQQ-DA分子离子峰。色谱峰积分面积代入标准曲线计算出PQQ-DA含量C（mg/mL）。脑组织PQQ-DA含量=C(mg/mL)×V(进样体积)/M(脑组织重量)。计算得到正常小鼠脑组织中PQQ-DA含量为0.25±0.006ng/mg，PQQ缺损模型鼠中未检测到PQQ-DA，连续口服PQQ1mg/mL 6周后小鼠脑组织PQQ-DA含量为1.09±0.012ng/mg。
（5）脑组织样本中PQQ-DA异构体分离
采用本法制备的具有特定识别性能的分子印迹聚合物PQQ-DA- Fe3O4/SiO2，用作UPLC固定相，结果发现466分子离子峰的异构体得到较好的分离。推测PQQ的邻位羧基发生了反应，为进一步研究提供了极有价值的信息。
本发明的有益效果：建立了基于分子印迹固相萃取的UPLC-MS，能检测到小鼠脑内痕量PQQ-DA的含量，检测限达到 0.2×10 -11 mg/mL。对神经系统疾病的发生和机理研究具有重要指导意义。
附图说明
图1 Fe3O4/SiO2磁性纳米粒子扫描电子显微镜图。
图2 PQQ-DA- Fe3O4/SiO2印迹磁性纳米粒子扫描电子显微镜图。
图3为非印迹磁性纳米粒子、印迹磁性纳米粒子洗脱前后红外光谱图。
a、非印迹磁性纳米粒子红外光谱图，b、印迹磁性纳米粒子洗脱前红外光谱图，c、印迹磁性纳米粒子洗脱后红外光谱图。
图4 PQQ在磁性印迹聚合物和磁性非印迹聚合物上的吸附等温线。
图5 PQQ-DA在不同剂量磁性印迹聚合物上的回收率。
图6 脱附时间对PQQ-DA回收率的影响。
图7 PQQ-DA标准曲线。
图8 PQQ-DA质谱图。
图9 对照品PQQ-DA色谱图。
图10 脑组织样本中PQQ-DA异构体在分子印迹聚合物PQQ-DA- Fe3O4/SiO2印迹固定相上的分离色谱图。
具体实施方式
实施例1 制备PQQ-DA印迹磁性纳米粒子，步骤为：
（1） Fe3O4磁性纳米粒子的制备：
100mL 1.25mM FeSO4·7H2O 在氮气的保护下以 800 rpm 的速度机械搅拌，用6MNaOH溶液调pH至10.0，1h后磁性沉淀物分离，用磁铁吸附黑色Fe3O4纳米粒子，倒去上层液体，用二次蒸馏水及乙醇分别洗涤三次，再分散悬浮于乙醇溶液中得到 5.0 g/L 的纳米Fe3O4溶液。
（2）磁性Fe3O4包裹SiO 2的制备
将 50 mL制备得到的Fe3O4悬浮液中加入5mL 氨水，5 mL 二次蒸馏水，10 mL含1mM四甲氧基硅烷，60℃ 800 rpm 速率机械搅拌10 h；加入200 μL 3-（异丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷分散于 50 mL 10%的醋酸水溶液中，继续搅拌 5h，用二次蒸馏水洗涤，得到磁性Fe3O4/ SiO 2纳米粒子。
（3）PQQ-DA印迹磁性纳米粒子的制备：
取0.46g PQQ-DA加入 30 mL含0.2M甲基丙烯酸乙二醇酯溶液，超声混合30 min，N2保护下滴加5.0 g乙二醇二甲基丙烯酸酯和 0.02g偶氮二异丁腈,加入 0.25 g 磁性Fe3O4/ SiO 2纳米粒子，超声30 min。将此混合液 60 ℃下反应 24h。非印迹聚合物的制备除了不加模板分子PQQ-DA外，其他步骤和印迹聚合物相同。
用（v/v为,5/1）乙醇-甲酸混合液洗涤三次，再用二次蒸馏水洗涤三次，用外部磁场分离出聚合物，真空干燥，得到印迹聚合物和非印迹聚合物。
（4）采用扫描电镜观察分子印迹聚合物表面，用红外光谱对分子印迹聚合物的化学结构进行表征。
图1磁性纳米粒子扫描电子显微镜显示，颗粒大小分布均匀，大致呈圆形，粒径约10 nm，基本满足超顺磁性颗粒的要求。图 2为接枝PQQ-DA印迹层后的电子扫描显微镜图，粒径约 130 nm。颗粒表面呈现粗糙多孔的特性，适合与目标分子的释放与结合，孔隙结构的厚度小于50 nm，适用于模板分子转移，能够在很短的时间内达到萃取平衡。
图3（a～c）为非印迹磁性纳米粒子、印迹磁性纳米粒子洗脱前后红外光谱图。与曲线a相比较，曲线b中3444cm-1处的-OH伸缩振动峰的红外强度明显增强，PQQ-DA中含丰富的-OH，1690 cm-1和1650 cm-1出现酰胺特征峰,2935、2855 cm-1酰胺基在无机杂化涂层出现位移。合成的印迹磁性纳米粒子中含PQQ-DA特征峰。曲线 a 和曲线 c 的峰形和强度基本一致,说明PQQ-DA能够从印迹磁性纳米粒子吸附中较好地洗脱出来，留下可以进行分子识别的空穴。
（5）吸附实验
吸附热力学特性：移取5 mL浓度分别为0.02、0.2、0.8、1.0、2.0、及4.0 mg／mL的PQQ-DA溶液，分别置于锥形瓶中。分别称取15 mg的磁性印迹聚合物和磁性非印迹聚合物，分散于不同浓度的PQQ-DA溶液中。15℃水浴恒温振荡10 h后用磁铁将粒子吸在底部，UPLC-MS测定上清液中的PQQ-DA量；以印迹磁性纳米粒子的吸附容量对PQQ-DA的初始浓度作图，绘制等温吸附线，如图4。
吸附容量（Q）为每单位质量（g）纳米粒子吸附目标分子的质量，吸附容量由其在振荡吸附前后PQQ-DA的浓度差值得到，公式为Q=（C0-Ci）V／m。C0为PQQ-DA的初始浓度(mg／mL)，Ci是震荡后上清液中PQQ-DA的浓度(mg／mL)，V是溶液的体积（mL），m是粒子的质量（mg）。由吸附等温线上可见，低浓度时印迹粒子的吸附容量随PQQ-DA浓度的增大而增加，在2mg／mL时达到饱和吸附，饱和吸附容量为113.8mg／g。而在相同条件下非印迹粒子的饱和吸附量仅为50.2 mg／g，印迹粒子饱和吸附量是非印迹粒子的2.3倍。
（6）印迹磁性纳米粒子用量对回收率的影响
吸附剂用量对目标物的回收率具有重要影响，粒子用量不够，不能完全吸附目标物；粒子用量过多，虽可确保目标物被充分吸附，但会影响洗脱，导致提取效率降低。我们研究了不同磁性纳米分子印迹粒子用量（2.5、5、10、15、20、25mg）对PQQ-DA回收效率的影响，结果如图5。当使用10 mg 磁性纳米分子印迹粒子时，回收率可达到93.5％，继续增大磁性纳米分子印迹粒子用量，回收率反而下降。
（7）脱附时间的影响
脱附时间对回收率有着很大的影响，为了获得最佳脱附时间，我们将吸附饱和的印迹磁性纳米粒子分散于2 mL乙醇／甲酸溶液中，置于摇床中振荡洗脱，考察不同振荡洗脱时间（5、10、15、20、30、40 min）的回收率。如图6所示，随着洗脱时间的增大，回收率也逐渐增大，洗脱20 min回收率达到93.6％，洗脱达到平衡，在实际样品分析时选择20 min为最佳洗脱时间。
实施例2 组织样品中PQQ-DA测定
（1）标准曲线制备
称取PQQ-DA，用二次蒸馏水配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL溶液，分别取20 mg 印迹磁性纳米粒子分散于250 mL上述标准溶液中。15℃振荡吸附1 h后，磁铁置于烧杯底部将印迹磁性纳米粒子吸住，弃除上清液。印迹磁性纳米粒子用去离子水洗涤后，重新分散在5 mL乙醇-甲酸（V/V 为6/1）混合溶液中。分散液超声10min后，粒子用磁铁吸至烧杯底部，取上清液稀释，进行UPLC-MS分析。用积分面积对浓度作图，得回归方程为y=1205519606X+259487（R2=0.9966），X为浓度C（mg/mL），y为积分面积。检测限达到 0.2×10-11 mg/mL。
（2）脑组织处理
脑组织称重，加组织裂解液（脑组织重量/裂解液=1g/1.5mL）匀浆，4℃ 14000rpm离心15min，上清液取出再离心15min，取出上清液，加入等体积的蛋白沉淀剂，4℃冰浴放置10min后，4℃ 14000rpm离心15min，得含目标物的上清液备用。
（3）磁性纳米分子印迹处理
取20 mg 印迹磁性纳米粒子分散于250 mL上述处理过的组织样品处理液中。15℃振荡吸附1 h后，磁铁置于烧杯底部将磁性分子印迹粒子吸住，弃除上清液。印迹磁性纳米粒子用去离子水洗涤后，重新分散在5 mL乙醇-甲酸（V/V为6/1）混合溶液中。分散液超声10min后，粒子用磁铁吸至烧杯底部，取上清液，氮气吹干，待用。
（4）脑组织PQQ-DA的含量测定
UPLC-MS条件：柱子1.7µm 2.1×100mm，检测器 SQ Detctor，梯度洗脱0～10min95/5水/甲醇～30/70水/甲醇。
MS图谱确认466M+为PQQ-DA分子离子峰。色谱峰积分面积代入标准曲线计算出PQQ-DA含量C（mg/mL）。脑组织PQQ-DA含量=C(mg/mL)×V（进样体积）/M（脑组织重量）。计算得到正常小鼠脑组织中PQQ-DA含量为0.25±0.006ng/mg，PQQ缺损模型鼠中未检测到PQQ-DA，连续口服PQQ1mg/mL 6周后小鼠脑组织PQQ-DA含量为1.09±0.012ng/mg。
（5）脑组织样本中PQQ-DA异构体分离
采用本法制备的具有特定识别性能的分子印迹聚合物PQQ-DA- Fe3O4/SiO2，用作UPLC固定相，结果发现466分子离子峰的异构体得到较好的分离。推测PQQ的邻位羧基发生了反应。为进一步研究提供了极有价值的信息。

Claims (2)

1.一种PQQ-DA印迹磁性纳米粒子的制备方法，其特征在于步骤为：
（1）Fe3O4磁性纳米粒子的制备：
100mL 1.25mM FeSO4·7H2O 在氮气的保护下以 800 rpm机械搅拌，用6M NaOH溶液调pH至10.0，1h后磁性沉淀物分离，用磁铁吸附黑色 Fe3O4 纳米粒子，倒去上层液体，用二次蒸馏水及乙醇分别洗涤三次，再分散悬浮于乙醇溶液中得到 5.0 mg/mL 的纳米Fe3O4 溶液；
（2）磁性Fe3O4包裹SiO2的制备：
将 50 mL制备得到的Fe3O4悬浮液中加入5mL 氨水，5 mL 二次蒸馏水，10 mL含1mM四甲氧基硅烷，60℃800 rpm机械搅拌10 h；加入200μL 3-（异丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷分散于 50 mL 10%的醋酸水溶液中，继续搅拌 5h，用二次蒸馏水洗涤，得到磁性Fe3O4/ SiO2纳米粒子；
（3）PQQ-DA印迹磁性纳米粒子的制备：
取0.46g PQQ-DA加入 30 mL含0.2M甲基丙烯酸乙二醇酯溶液，超声混合30 min，N2保护下滴加5.0 g乙二醇二甲基丙烯酸酯和 0.02 g偶氮二异丁腈，加入 0.25 g 磁性Fe3O4/SiO2纳米粒子，超声30 min；将此混合液 60℃反应 24h，得PQQ-DA印迹磁性纳米粒子；
非印迹磁性纳米粒子的制备除了不加模板分子PQQ-DA外，其他步骤和印迹磁性纳米粒子相同；
用v/v为5/1的乙醇-甲酸混合液洗涤三次，再用二次蒸馏水洗涤三次，用外部磁场分离出磁性纳米粒子，真空干燥，分别得到磁性印迹聚合物及磁性非印迹聚合物；
（4）采用扫描电镜观察分子印迹聚合物表面，用红外光谱对分子印迹聚合物的化学结构进行表征；
（5）吸附实验
吸附热力学特性：移取5 mL浓度分别为0.02、0.2、0.8、1.0、2.0、及4.0 mg／mL的PQQ-DA溶液，分别置于锥形瓶中；分别称取15 mg的磁性印迹聚合物及磁性非印迹聚合物，分散于不同浓度的PQQ-DA溶液中，15℃水浴恒温振荡10 h后用磁铁将粒子吸在底部，UPLC-MS测定上清液中的PQQ-DA量；以印迹磁性纳米粒子的吸附容量对PQQ-DA的初始浓度作图，绘制等温吸附线；
（6）印迹磁性纳米粒子用量对回收率的影响
吸附剂用量对目标物的回收率具有重要影响，粒子用量不够，不能完全吸附目标物；粒子用量过多，虽可确保目标物被充分吸附，但会影响洗脱，导致提取效率降低；研究了不同印迹磁性纳米粒子用量2.5、5、10、15、20、25mg对PQQ-DA回收效率的影响；当使用10 mg 印迹磁性纳米粒子时，回收率达到93.5％，继续增大印迹磁性纳米粒子用量，回收率反而下降；
（7）脱附时间的影响
脱附时间对回收率有着很大的影响，为了获得最佳脱附时间，将吸附饱和的印迹磁性纳米粒子分散于2 mL乙醇／甲酸溶液中，置于摇床中振荡洗脱，考察不同振荡洗脱时间的回收率，随着洗脱时间的增大，回收率也逐渐增大，洗脱20 min回收率达到93.6％，洗脱达到平衡，在实际样品分析时选择20 min为洗脱时间。
2.权利要求1所述方法制备的PQQ-DA印迹磁性纳米粒子用于UPLC-MS测定生物体内PQQ-DA痕量分析的方法，其特征在于步骤为：
（1）标准曲线制备
称取PQQ-DA，用二次蒸馏水配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL溶液，分别取20 mg印迹磁性纳米粒子分散于250 mL上述所配溶液中；15℃振荡吸附1 h后，磁铁置于烧杯底部将印迹磁性纳米粒子吸住，弃除上清液；印迹磁性纳米粒子用去离子水洗涤后，重新分散在5 mL乙醇-甲酸，V/V为 6/1，混合溶液中，分散液超声10min后，粒子用磁铁吸至烧杯底部，取上清液稀释，进行UPLC-MS分析，用积分面积对浓度作图，得回归方程为y=1205519606X+259487，R2=0.9966，X为浓度C mg/mL，y为积分面积，检测限达到 0.2×10 -11 mg/mL；
（2）脑组织处理
脑组织称重，加组织裂解液匀浆，脑组织重量/裂解液=1g/1.5mL，4℃ 14000rpm离心15min，上清液取出再离心15min，取出上清液，加入等体积的蛋白沉淀剂，4℃冰浴放置10min后，4℃ 14000rpm离心15min，得含目标物的上清液备用；
（3）磁性纳米分子印迹处理
取20 mg 印迹磁性纳米粒子分散于250 mL步骤（2）处理过的组织样品处理液中，15℃振荡吸附1 h后，磁铁置于烧杯底部将印迹磁性纳米粒子吸住，弃除上清液；印迹磁性纳米粒子用去离子水洗涤后，重新分散在5 mL V/V 为6/1的乙醇-甲酸混合溶液中，分散液超声10min后，粒子用磁铁吸至烧杯底部，取上清液，氮气吹干，待用；
（4）脑组织PQQ-DA的含量测定
UPLC-MS条件：柱子1.7µm 2.1×100mm，检测器 SQ Detctor，梯度洗脱0～10min 95/5水/甲醇～30/70水/甲醇；
MS图谱确认466M+为PQQ-DA分子离子峰；色谱峰积分面积代入标准曲线计算出PQQ-DA含量C mg/mL；脑组织PQQ-DA含量=C(mg/mL)×V(进样体积)/M(脑组织重量)；计算得到正常小鼠脑组织中PQQ-DA含量为0.25±0.006ng/mg，PQQ缺损模型鼠中未检测到PQQ-DA，连续口服PQQ1mg/mL 6周后小鼠脑组织PQQ-DA含量为1.09±0.012ng/mg；
（5）脑组织样本中PQQ-DA异构体分离
采用本法制备的具有特定识别性能的分子印迹聚合物PQQ-DA-Fe3O4/SiO2，用作UPLC固定相，结果发现466分子离子峰的异构体得到较好的分离。
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