CN104880526A - 一种玛咖中苄基芥子油苷的含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种玛咖中苄基芥子油苷的含量测定方法，该方法是以苄基芥子油苷为指标成分，通过对其定量测定来进行的。芥子油苷及其分解产物异硫氰酸苄酯具有在提高生育力、抗肿瘤等功效，因此对玛咖中芥子油苷含量测定尤为重要，本实验采用方法简便易行，结果可靠。可作为玛咖中芥子油苷含量检测新方法推广应用。

Description

一种玛咖中苄基芥子油苷的含量测定方法

技术领域

本发明涉及检测领域，具体的说，本发明涉及一种玛咖中苄基芥子油苷的含量测定方法。

背景技术

玛咖(Lepidium meyenii Walp)为十字花科独行菜属植物,原产于安第斯山脉，我国云贵高原和青藏高原均有引种。具有提高生育力、改善性功能、抗疲劳和增强免疫等功效[1]，近年来研究发现，其主要活性成分为玛咖酰胺、玛咖烯和芥子油苷等[2]。2011年玛咖粉被卫生部列为新资源食品[3]，具有广泛的开发市场和应用前景。

芥子油苷又称为硫代葡萄糖苷，是仅在十字花科植物中发现的一种次生代谢产物，玛咖药材中芥子油苷含量约为1％，其中苄基芥子油苷为其主要活性成分及其特征物质。目现有的方法是利用硫酸酯酶(sulfatase enzyme)将苄基芥子油苷催化水解为苄基脱硫硫代葡萄糖苷(Desulfoglucotropaeolin)，用HPLC进行分析定量，但是该方法的标准品存在问题，苄基脱硫硫代葡萄糖苷无法购买，目前只能采用丙烯基芥子油苷同步水解，定量分析后系数换算来解决标准品问题，不仅没有针对性，而且检测过程复杂繁琐，增加了方法的不确定度。

本方法利用葡糖硫苷酶(thioglucosidase)将苄基芥子油苷催化水解为异硫氰酸苄酯(BITC)，利用BITC简便的HPLC分析条件，建立苄基芥子油苷快速定量分析检测方法。方法的原理见下式：

[1]余龙江，金文闻，吴元喜，等.玛咖的植物学及其药理作用研究概况[J].天然产物研究与开发,20002,14(5):71-74

[2]金文闻.药食两用植物玛咖(Lepidium meyenii)的功效物质研究[D].武汉：华中科技大学，2007

[3]中华人民共和国卫生部

[4]转基因植物及其产品食用安全检查-抗营养素第三部分：硫代葡萄糖苷的测定[S].NY/T1103.3-2006

[5]Matthew W.Bernart.Thioglucosidase-Catalyzed Hydrolysis of the Major Glucosinolate of Maca(Lepidium meyenii)to Benzyl Isothiocyanata.American Chemical Society 2006:157-169 

发明内容

本发明的目的是提供一种玛咖中苄基芥子油苷的含量测定方法。

为了实现本发明的目的，本发明提供一种玛咖中苄基芥子油苷的含量测定方法，该方法是以苄基芥子油苷为指标成分，通过对其定量测定来进行的。

优选地，所述定量是通过使用高效液相色谱法来进行的。

更优选地， 

a.色谱条件的建立

色谱柱：C18柱(4.6×250mm,5μm)；

流动相：甲醇-水溶液(梯度洗脱：0-5min，3％-8％甲醇；5-9min， 8％-48％甲醇；9-23min，48％-62％；23-25min，62％-95％)；25-28min，95％甲醇；

进样量为10μL，检测波长302nm，流速为1.0mL/min，流速为1.0mL/min，柱温40℃；

b.葡糖硫苷酶溶液配制

精密称取1mg葡糖硫苷酶，置于10mL容量瓶内，加蒸馏水溶解，定容，配制成每毫升含0.33UN的酶活力溶液；

c.标准曲线的绘制

精确称取BITC标准品250mg，用甲醇定容至25mL容量瓶内，配制成10mg/mL的标准品溶液；分别移取20μL、50μL、100μL、150μL、200μL，分别用甲醇定容至10mL容量瓶内，制成浓度为0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.15mg/mL、0.20mg/mL的标准品溶液，用以制作标准曲线；在a项下色谱条件，分别进样10μL，以对照品质量浓度X(g/L)为横坐标，对照品峰面积Y为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线，所得回归方程Y＝4886.3X+6.4890(R2＝0.9994，n＝5)，表明BITC在0～0.20mg/mL范围内有较好的线性关系；

d.供试品溶液 

精密称取100mg样品，置于10mL容量瓶内，加5mL 47.5％乙醇/水溶液(V/V)，50℃水浴超声1小时，样品放置室温后，用47.5％乙醇/水溶液(V/V)定容至10mL；精密量取上述溶液4mL，置于10mL的顶空瓶内，添加1mL的b项中的酶溶液，摇匀后，加盖密闭。置于45℃的恒温水浴锅内酶解30min，取出转移至10mL容量瓶内，用47.5％乙醇/水溶液(V/V)定容至10mL，经0.22μm微孔滤膜过滤后，用于HPLC检测；

e.加样回收率试验

精密称取9份已知含量的同一批次供试品溶液，分别加入高、中、低浓度的对照品溶液，按照d项方法，每个浓度配制三份，按照d项下方法配制供试品溶液，进样测定峰面积，BITC的平均回收率为99％，RSD为1.3％；

f.精密度试验 

取BITC对照品溶液10μL，在a项色谱条件下连续进样五次，结果色谱峰面积的RSD为0.8％，表明仪器的精密度良好；

g.稳定性试验 

取供试品溶液，在a项色谱条件下分别在0、2、4、6、8、10h进样，进样量为10μL，结果BITC的RSD为1.06％，表明供试品溶液在室温下10h内稳定；

h.重复性实验 

按照a项方法平行制备6份供试品，各吸取10μL进样重复进样分析测定峰面积，BITC的RSD为0.7％，表明方法重复性良好。

芥子油苷及其分解产物异硫氰酸苄酯具有在提高生育力、抗肿瘤等功效，因此对玛咖中芥子油苷含量测定尤为重要，本实验采用方法简便易行，结果可靠。可作为玛咖中芥子油苷含量检测新方法推广应用。

附图说明

图1.BITC标准曲线；

图2.供试品与对照品高效液相色谱图，A为供试品、B为对照品、1为BITC。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例1

1.仪器与材料 

1.1仪器

仪器：高效液相色谱系统(Agilent1260)；色谱柱：C18柱(4.6×150mm，5μm)；HF-700高速多功能粉碎机(永康天祺盛世工贸有限公司)；KQ-300DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；MS105DU分析天平(Mettler Toledo)，HH-6恒温水浴锅(国华电器有限公司)，10mL顶空进样瓶，其他仪器均为实验室常用玻璃仪器。

材料：玛咖(购自云南)；甲醇(色谱纯，Sigma Aldrich)；95％乙醇(分析纯)；蒸馏水,异硫氰酸苄酯benzyl isothiocyanate(BITC，CAS 622A-78-6，购自东京化成工业株式会社)，其他试剂均为分析纯。

2.实验方法与结果

2.1色谱条件的建立

色谱柱：C₁₈柱(4.6×250mm,5μm)；流动相：甲醇-水溶液(梯度洗脱：0-5min，3％-8％甲醇；5-9min，8％-48％甲醇；9-23min，48％-62％；23-25min，62％-95％)；25-28min，95％甲醇。进样量为10μL，检测波长302nm，流速为1.0mL/min，流速为1.0mL/min，柱温40℃。

2.2葡糖硫苷酶溶液配制

精密称取1mg葡糖硫苷酶，置于10mL容量瓶内，加蒸馏水溶解，定容，配制成每毫升含0.33UN的酶活力溶液。备注：溶液现配现用。

2.3标准曲线的绘制

精确称取BITC标准品250mg，用甲醇定容至25mL容量瓶内，配制成10mg/mL的标准品溶液。分别移取20μL、50μL、100μL、150μL、200μL，分别用甲醇定容至10mL容量瓶内，制成浓度为0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.15mg/mL、0.20mg/mL的标准品溶液，用以制作标准曲线。在“1.2.1”项下色谱条件，分别进样10μL，以对照品质量浓度X(g/L)为横坐标，对照品峰面积Y为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线。所得回归方程Y＝4886.3X+6.4890(R²＝0.9994，n＝5)，表明BITC在0～0.20mg/mL范围内有较好的线性关系。标准曲线如图1所示。

2.4供试品溶液 

精密称取100mg样品，置于10mL容量瓶内，加5mL47.5％乙醇/水溶液(V/V)，50℃水浴超声1小时，样品放置室温后，用47.5％乙醇/水溶液(V/V)定容至10mL。精密量取上述溶液4mL；置于10mL的顶空瓶内，添加1mL的“2.2”项中的酶溶液，摇匀后，加盖密闭。置于45℃的恒温水浴锅内酶解30min，取出转移至10mL容量瓶内，用47.5％乙醇/水溶液(V/V)定容至10mL。经0.22μm微孔滤膜过滤后，用于HPLC检测。结果如图2所示。

2.5加样回收率试验

精密称取9份已知含量的同一批次供试品溶液，分别加入高、中、低浓度的对照品溶液，按照“2.4”项方法，每个浓度配制三份，按照“2.4”项下方法配制供试品溶液，进样测定峰面积，BITC的平均回收率为99％，RSD为1.3％。

2.5精密度试验 

取BITC对照品溶液10μL，在”2.1”项色谱条件下连续进样五次，结果色谱峰面积的RSD为0.8％，表明仪器的精密度良好。

2.6稳定性试验 

取供试品溶液，在”2.1”项色谱条件下分别在0、2、4、6、8、10h进样，进样量为10μL，结果BITC的RSD为1.06％，表明供试品溶液在室温下10h内稳定。

2.7重复性实验 

按照“2.1”项方法平行制备6份供试品，各吸取10μL进样重复进样分析测定峰面积。BITC的RSD为0.7％，表明方法重复性良好。

Claims (3)

1.一种玛咖中苄基芥子油苷的含量测定方法，其特征在于，该方法是以苄基芥子油苷为指标成分，通过对其定量测定来进行的。

2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述定量是通过使用高效液相色谱法来进行的。

3.根据权利要求2所述的含量测定方法，其特征在于，

a.色谱条件的建立

色谱柱：C18柱(4.6×250mm,5μm)；

流动相：甲醇-水(梯度洗脱：0-5min，3％-8％甲醇；5-9min，8％-48％甲醇；9-23min，48％-62％；23-25min，62％-95％)；25-28min，95％甲醇；

进样量为10μL，检测波长302nm，流速为1.0mL/min，流速为1.0mL/min，柱温40℃；

b.葡糖硫苷酶溶液配制

精密称取1mg葡糖硫苷酶，置于10mL容量瓶内，加蒸馏水溶解，定容，配制成每毫升含0.33UN的酶活力溶液；

c.标准曲线的绘制

精确称取BITC标准品250mg，用甲醇定容至25mL容量瓶内，配制成10mg/mL的标准品溶液；分别移取20μL、50μL、100μL、150μL、200μL，分别用甲醇定容至10mL容量瓶内，制成浓度为0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.15mg/mL、0.20mg/mL的标准品溶液，用以制作标准曲线；在a项下色谱条件，分别进样10μL，以对照品质量浓度X(g/L)为横坐标，对照品峰面积Y为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线，所得回归方程Y＝4886.3X+6.4890(R2＝0.9994，n＝5)，表明BITC在0～0.20mg/mL范围内有较好的线性关系；

d.供试品溶液

精密称取100mg样品，置于10mL容量瓶内，加5mL 47.5％乙醇/水溶液(V/V)，50℃水浴超声1小时，样品放置室温后，用47.5％乙醇/水溶液(V/V)定容至10mL；精密量取上述溶液4mL，置于10mL的顶空瓶内，添加1mL的b项中的酶溶液，摇匀后，加盖密闭。置于45℃的恒温水浴锅内酶解30min，取出转移至10mL容量瓶内，用47.5％乙醇/水溶液(V/V)定容至10mL，经0.22μm微孔滤膜过滤后，用于HPLC检测；

e.加样回收率试验

精密称取9份已知含量的同一批次供试品溶液，分别加入高、中、低浓度的对照品溶液，按照d项方法，每个浓度配制三份，按照d项下方法配制供试品溶液，进样测定峰面积，BITC的平均回收率为99％，RSD为1.3％；

f.精密度试验

取BITC对照品溶液10μL，在a项色谱条件下连续进样五次，结果色谱峰面积的RSD为0.8％，表明仪器的精密度良好；

g.稳定性试验

取供试品溶液，在a项色谱条件下分别在0、2、4、6、8、10h进样，进样量为10μL，结果BITC的RSD为1.06％，表明供试品溶液在室温下10h内稳定；

h.重复性实验

按照a项方法平行制备6份供试品，各吸取10μL进样重复进样分析测定峰面积，BITC的RSD为0.7％，表明方法重复性良好。