CN111624270A - 一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法 - Google Patents

一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法，属于油料作物深加工领域。本发明通过恒温水浴、超声提取、固相萃取柱及微孔滤膜等技术的综合应用对菜籽中硫代葡萄糖苷的提取纯化方法进行了改进，并利用离子对提取法建立了一种准确、高效的菜籽硫代葡萄糖苷分析方法，该方法不仅可以满足已知的14种菜籽硫代葡萄糖苷的检测需要，还首次对新发现的6种存在于菜籽中的硫代葡萄糖苷成分进行了提取和定性表征。本发明解决了传统菜籽硫代葡萄糖苷作为风味前体物质降解机理不清的问题，改善了菜籽硫代葡萄糖苷在提取工艺中的稳定性，在菜籽油加工的原料选择和育种方向等领域具有极大的应用潜力和经济价值。

Description

一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法
技术领域
本发明属于油料作物深加工领域，尤其涉及一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法。
背景技术
菜籽油因为风味独特而深受消费者喜爱，其感官风味特征显著区别于其他植物油。硫代葡萄糖苷(glucosinolate,GS)是菜籽中标志性的次生代谢产物，根据侧链基团的不同，可以把硫代葡萄糖苷分为脂肪族、芳香族和吲哚族三大类。在芥子酶的催化作用或者加热条件下硫代葡萄糖苷会发生降解(即酶降解和热降解)，降解产物有异硫氰酸酯、硫氰酸酯、腈类、硫氰酸酯等，其中部分有辛辣气味的特征风味物质，次级重排反应还能导致其他风味化合物的形成。硫代葡萄糖苷降解产物种类和含量决定了菜籽油风味的气味特征，因此对菜籽原料中硫代葡萄糖苷的提取和鉴定至关重要，有利于菜籽油加工的原料选择和育种方向的指导。
目前油菜籽中常见报道的硫代葡萄糖苷有14种，通过农业行业标准方法测定的硫代葡萄糖苷包括2-羟基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷，反式-2-羟基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷，丙烯基硫代葡萄糖苷，4-甲亚砜丁基硫代葡萄糖苷，2-羟基-4-戊烯基硫代葡萄糖苷，5-甲亚砜戊基硫代葡萄糖苷，3-丁烯基硫代葡萄糖苷，4-羟基-3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷，4-戊烯基硫代葡萄糖苷，苯甲基(苄基)硫代葡萄糖苷，3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷，苯乙基硫代葡萄糖苷，4-甲氧基3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷和1-甲氧基-3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷。
但是，由于部分标准品的缺失，以往对菜籽硫代葡萄糖苷的定性分析不够准确，未知峰无法鉴别。而目前通过菜籽油挥发性成分的鉴定发现菜籽中可能还存在其他未鉴定的硫代葡萄糖苷结构。
因此，开发一种可以保留更多种类菜籽硫代葡萄糖苷、避免敏感物质降解的提取方法以及快捷高效准确的检测方法就成为了本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种通过恒温水浴、超声及微柱系统的菜籽硫代葡萄糖苷的提取纯化方法，并利用离子对提取法建立一种准确、高效的菜籽硫代葡萄糖苷的定性分析方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法，所述菜籽硫代葡萄糖苷包括5-甲硫戊基硫苷、4-(甲基亚磺酰基)丁基硫苷、4-甲硫丁基硫苷、苯基乙基硫硫苷、3-(甲基磺酰基)丙基硫苷、白介子硫苷、3-甲硫丙基硫苷、7-(甲硫基)庚基硫苷中的一种或多种；且
所述提取检测方法的步骤包括：
步骤I、原料预处理，将菜籽样品在-80℃冷冻保持24-48h后，研磨过筛，得到菜籽粉末样品；
步骤II、硫代葡萄糖苷的提取，将步骤I得到的菜籽粉末样品溶于70％甲醇水溶液中，再将混合液在75℃下水浴20～40min，离心收集上清液，得到菜籽提取液；
步骤III、硫代葡萄糖苷的纯化，利用固相萃取柱和微孔过滤膜对步骤II得到的菜籽提取液进行纯化过滤，得到进样试液；
步骤IV、利用液相色谱-质谱联用仪对步骤III得到的进样试液进行检测。
值得说明的是，本发明提供了一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法，通过恒温水浴、固相萃取和微孔滤膜技术实现了菜籽硫代葡萄糖苷的提取和纯化。该方法通过-80℃冷冻24～48h的处理抑制了黑芥子酶活性，避免了菜籽硫代葡萄糖苷的酶降解，保留了更多种类的菜籽硫代葡萄糖苷。与目前已知的14种菜籽硫代葡萄糖苷相比，本发明从菜籽中首次提取检测到5-甲硫戊基硫苷、4-(甲基亚磺酰基)丁基硫苷、4-甲硫丁基硫苷、3-(甲基磺酰基)丙基硫苷、白介子硫苷、3-甲硫丙基硫苷等6种菜籽硫代葡萄糖苷，为菜籽油中硫苷降解产物的溯源化研究提供了可能。
进一步地，所述硫代葡萄糖苷还包括2-羟基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷、反式-2-羟基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷、丙烯基硫代葡萄糖苷、4-甲亚砜丁基硫代葡萄糖苷、2-羟基-4-戊烯基硫代葡萄糖苷、5-甲亚砜戊基硫代葡萄糖苷、3-丁烯基硫代葡萄糖苷、4-羟基-3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷、4-戊烯基硫代葡萄糖苷、苯甲基(苄基)硫代葡萄糖苷、3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷、苯乙基硫代葡萄糖苷、4-甲氧基3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷、1-甲氧基-3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷中的一种或多种。
进一步地，考虑到样品处理过程中的萃取效率，避免菜籽硫代葡萄糖苷在菜籽不同部位的种类及含量差异对提取造成影响，所述步骤I中还包括对菜籽样品进行蒸馏水洗涤、晾晒，且所述研磨过筛为40目筛，并将收集得到的菜籽粉末样品转移到聚丙烯试管中保存。
进一步地，考虑到硫代葡萄糖苷在加热条件下会发生热降解，为了有限避免硫代葡萄糖苷的降解，最大程度的保留菜籽中硫代葡萄糖苷的种类，本发明还提供一种通过超声进行硫代葡萄糖苷提取的技术方案，即将所述步骤II中的水浴处理替换为在20～40℃下超声处理20min，避免了菜籽硫代葡萄糖苷提取过程中的受热分解。
更进一步地，为了方便固液分离，所述步骤II的离心处理的具体步骤为8000rmp离心处理20min。
进一步地，所述步骤III中的固相萃取柱为C18柱，微孔滤膜为0.22μm的有机相滤膜。
值得说明的是，虽然本发明限定了所述步骤III中固相萃取柱和微孔滤膜的种类，但应当明确，固相萃取柱的作用在于根据不同的保留原理实现菜籽提取液中各组分的分离，从而实现菜籽硫代葡萄糖苷的纯化。类似的，微孔滤膜则是依赖微孔大小、滤膜材料实现了菜籽提取液中不同组分的过滤纯化。因此，应当理解，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他可以实现菜籽提取液中各组分分离、菜籽硫代葡萄糖苷类物质纯化过滤的各类固相萃取柱和各规格微孔滤膜的应用都属于本发明保护的范围。
进一步地，所述步骤IV中液相色谱-质谱联用仪液相色谱的分析条件为：5mM甲酸铵的水和甲醇溶液按7：3(v/v)作为流动相，流速为0.3mL/min，色谱柱为内径100mm×2.5mm，粒径1.7μm的C18色谱柱。
更进一步地，所述步骤IV中液相色谱-质谱联用仪质谱的分析条件为：采用HESI源，鞘气流速＝30L/min；辅助气体流量＝10L/min；吹扫气流量＝1L/min；喷雾电压＝4.30kV；毛细管温度＝320℃；且扫描范围为300-500m/z。
最为进一步地，所述步骤IV得到的检测数据为基于全扫描模式下确定的菜籽硫代葡萄糖苷组分的m/z值和在MS2模式下得到的硫代葡萄糖苷碎片。
值得说明的是，目前国标中对菜籽硫代葡萄糖苷的检测是通过液相色谱实现的。但由于部分标准品的缺失，仅采用液相色谱对菜籽硫代葡萄糖苷的定性分析不够准确，多种硫代葡萄糖苷组分无法实现有效分离，提取后的未知峰无法鉴别。因此，液相色谱检测技术无法与目前通过菜籽油挥发性成分结构推测而知晓的其他硫代葡萄糖苷结构实现互相验证。
而本发明利用离子对提取法，通过全扫描模式下确定的菜籽硫代葡萄糖苷组分的m/z值和在MS2模式下得到的硫代葡萄糖苷碎片实现了未知菜籽硫代葡萄糖苷成分的归属，对22种菜籽硫代葡萄糖苷组分实现了定性表征(表1)。
表1
Figure BDA0002509540390000051
Figure BDA0002509540390000061
Figure BDA0002509540390000071
与现有技术相比，本发明优点在于：
1、本发明首次提出菜籽中包含20种硫代葡萄糖苷成分，并对除已公开的14种硫代葡萄糖苷外的6种硫代葡萄糖苷进行了定性表征，扩展了菜籽硫代葡萄糖苷的种类，为菜籽原料中硫代葡萄糖苷和菜籽油挥发性成分的鉴定溯源提供了新的互证途径；
2、本发明通过恒温水浴、超声提取、固相萃取柱及微孔滤膜的综合应用对菜籽中硫代葡萄糖苷的提取纯化方法进行了改进，并利用离子对提取法建立了一种准确、高效的菜籽硫代葡萄糖苷分析方法；
3、本发明解决了传统菜籽硫代葡萄糖苷在芥子酶的催化作用或者加热条件下发生降解的问题，利用-80℃冷冻保存的方法抑制了芥子酶活性，并利用超声处理避免了提取过程中的升温处理，提高了菜籽硫代葡萄糖苷提取的稳定性；
4、本发明提供的菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法简单高效、绿色环保，在菜籽油加工的原料选择和育种方向等领域具有极大的应用潜力和经济价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为5-甲硫戊基硫苷的二级质谱碎片离子图。
图2为4-(甲基亚磺酰基)丁基硫苷的二级质谱碎片离子图。
图3为4-甲硫丁基硫苷的二级质谱碎片离子图。
图4为3-(甲基磺酰基)丙基硫苷的二级质谱碎片离子图。
图5为白介子硫苷的二级质谱碎片离子图。
图6为3-甲硫丙基硫苷的二级质谱碎片离子图。
具体实施方式
下面将结合说明书附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明公开了一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法，通过恒温水浴、超声提取、固相萃取柱及微孔滤膜的综合应用对菜籽中硫代葡萄糖苷的提取纯化方法进行了改进，并利用离子对提取法建立一种准确、高效的菜籽硫代葡萄糖苷的定性分析方法。
进一步地，本发明还首次提出菜籽中包含20种硫代葡萄糖苷成分，并对除已公开的14种硫代葡萄糖苷外的6种硫代葡萄糖苷(如图1～图6所示)进行了定性表征，扩展了菜籽硫代葡萄糖苷的种类，为菜籽原料中硫代葡萄糖苷和菜籽油挥发性成分的鉴定溯源提供了新的互证途径。
更进一步地，本发明还解决了传统菜籽硫代葡萄糖苷在芥子酶的催化作用或者加热条件下发生降解的问题，利用-80℃冷冻保存的方法抑制了芥子酶活性，并利用超声处理避免了提取过程中的升温处理，提高了菜籽硫代葡萄糖苷提取的稳定性。
为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。
实施例1
一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法，具体包括以下步骤：
步骤I、原料的预处理：甘蓝型菜籽样品用蒸馏水洗涤，晾干，立即在-80℃冷冻保持24h，以抑制黑芥子酶活性。提取前使用实验室研磨机将样品研磨成细粉，过40目筛。收集菜籽粉末样品，转移到聚丙烯试管中保存。
步骤II、硫代葡萄糖苷的提取：称取0.4g菜籽粉末样品放入10mL离心管中，加入5mL70％甲醇水溶液，混合液在75℃下水浴加热40分钟。8000rmp离心20min，收集上清液，定容至5mL，得到菜籽提取液。
步骤III、硫代葡萄糖苷的纯化：将C18微柱装置安装好，5mL甲醇冲洗C18微柱，排干，5mL超纯水冲洗C18微柱，排干，加入1mL菜籽提取液，排干，用4mL超纯水洗脱，收集，用超纯水将洗脱定容至5mL，过0.22μm滤膜之后得到进样试液。
步骤IV、采用液相色谱-质谱联用仪对进样试液进行检测，其中，HPLC-MS分析条件：5mM甲酸铵的水和甲醇溶液(7：3v/v)作为流动相，流速＝0.3mL/min，色谱柱：C18色谱柱(内径100mm×2.5mm，粒径＝1.7μm，Waters)，进样量10μL，自动进样器处于10℃恒温条件下。Q-Orbitrap质谱仪配备了HESI源，该源使用以下优化的参数集使用：鞘气流速＝30L/min；辅助气体流量＝10L/min；吹扫气流量＝1L/min；喷雾电压＝4.30kV；毛细管温度＝320℃。使用以上设置在LC-MS全扫描模式下获取所有定量数据，扫描范围＝300-500m/z。得到基于全扫描模式确定的m/z值和在MS2模式下观察到的硫代葡萄糖苷碎片。
实施例2
一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法，具体包括以下步骤：
步骤I、原料的预处理：白菜型菜籽样品用蒸馏水洗涤，晾干，立即在-80℃冷冻保持36h，以抑制黑芥子酶活性。提取前使用实验室研磨机将样品研磨成细粉，过40目筛。收集菜籽粉末样品，转移到聚丙烯试管中保存。
步骤II、硫代葡萄糖苷的提取：称取0.4g菜籽粉末样品放入10mL离心管中，加入5mL70％甲醇水溶液，混合液在75℃下水浴加热30分钟。8000rmp离心20min，收集上清液，定容至5mL，得到菜籽提取液。
步骤III、硫代葡萄糖苷的纯化：将C18微柱装置安装好，5mL甲醇冲洗C18微柱，排干，5mL超纯水冲洗C18微柱，排干，加入1mL菜籽提取液，排干，用4mL超纯水洗脱，收集，用超纯水将洗脱定容至5mL，过0.22μm滤膜之后得到进样试液。
步骤IV、采用液相色谱-质谱联用仪对进样试液进行检测，其中，HPLC-MS分析条件：5mM甲酸铵的水和甲醇溶液(7：3v/v)作为流动相，流速＝0.3mL/min，色谱柱：C18色谱柱(内径100mm×2.5mm，粒径＝1.7μm，Waters)，进样量10μL，自动进样器处于10℃恒温条件下。Q-Orbitrap质谱仪配备了HESI源，该源使用以下优化的参数集使用：鞘气流速＝30L/min；辅助气体流量＝10L/min；吹扫气流量＝1L/min；喷雾电压＝4.30kV；毛细管温度＝320℃。使用以上设置在LC-MS全扫描模式下获取所有定量数据，扫描范围＝300-500m/z。得到基于全扫描模式确定的m/z值和在MS2模式下观察到的硫代葡萄糖苷碎片。
实施例3
一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法，具体包括以下步骤：
步骤I、原料的预处理：芥菜型菜籽样品用蒸馏水洗涤，晾干，立即在-80℃冷冻保持48h，以抑制黑芥子酶活性。提取前使用实验室研磨机将样品研磨成细粉，过40目筛。收集菜籽粉末样品，转移到聚丙烯试管中保存。
步骤II、硫代葡萄糖苷的提取：称取0.4g菜籽粉末样品放入10mL离心管中，加入5mL70％甲醇水溶液，混合液在40℃下超声处理20min。8000rmp离心20min，收集上清液，定容至5mL，得到菜籽提取液。
步骤III、硫代葡萄糖苷的纯化：将C18微柱装置安装好，5mL甲醇冲洗C18微柱，排干，5mL超纯水冲洗C18微柱，排干，加入1mL菜籽提取液，排干，用4mL超纯水洗脱，收集，用超纯水将洗脱定容至5mL，过0.22μm滤膜之后得到进样试液。
步骤IV、采用液相色谱-质谱联用仪对进样试液进行检测，其中，HPLC-MS分析条件：5mM甲酸铵的水和甲醇溶液(7：3v/v)作为流动相，流速＝0.3mL/min，色谱柱：C18色谱柱(内径100mm×2.5mm，粒径＝1.7μm，Waters)，进样量10μL，自动进样器处于10℃恒温条件下。Q-Orbitrap质谱仪配备了HESI源，该源使用以下优化的参数集使用：鞘气流速＝30L/min；辅助气体流量＝10L/min；吹扫气流量＝1L/min；喷雾电压＝4.30kV；毛细管温度＝320℃。使用以上设置在LC-MS全扫描模式下获取所有定量数据，扫描范围＝300-500m/z。得到基于全扫描模式确定的m/z值和在MS2模式下观察到的硫代葡萄糖苷碎片。
实施例4
一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法，具体包括以下步骤：
步骤I、原料的预处理：甘蓝型菜籽样品用蒸馏水洗涤，晾干，立即在-80℃冷冻保持48h，以抑制黑芥子酶活性。提取前使用实验室研磨机将样品研磨成细粉，过40目筛。收集菜籽粉末样品，转移到聚丙烯试管中保存。
步骤II、硫代葡萄糖苷的提取：称取0.4g菜籽粉末样品放入10mL离心管中，加入5mL70％甲醇水溶液，混合液在75℃下水浴加热20分钟。8000rmp离心20min，收集上清液，定容至5mL，得到菜籽提取液。
步骤III、硫代葡萄糖苷的纯化：将C18微柱装置安装好，5mL甲醇冲洗C18微柱，排干，5mL超纯水冲洗C18微柱，排干，加入1mL菜籽提取液，排干，用4mL超纯水洗脱，收集，用超纯水将洗脱定容至5mL，过0.22μm滤膜之后得到进样试液。
步骤IV、采用液相色谱-质谱联用仪对进样试液进行检测，其中，HPLC-MS分析条件：5mM甲酸铵的水和甲醇溶液(7：3v/v)作为流动相，流速＝0.3mL/ml，色谱柱：C18色谱柱(内径100mm×2.5mm，粒径＝1.7μm，Waters)，进样量10μL，自动进样器处于10℃恒温条件下。Q-Orbitrap质谱仪配备了HESI源，该源使用以下优化的参数集使用：鞘气流速＝30L/min；辅助气体流量＝10L/min；吹扫气流量＝1L/min；喷雾电压＝4.30kV；毛细管温度＝320℃。使用以上设置在LC-MS全扫描模式下获取所有定量数据，扫描范围＝300-500m/z。得到基于全扫描模式确定的m/z值和在MS2模式下观察到的硫代葡萄糖苷碎片。
实施例5
一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法，具体包括以下步骤：
步骤I、原料的预处理：芥菜型菜籽样品用蒸馏水洗涤，晾干，立即在-80℃冷冻保持48h，以抑制黑芥子酶活性。提取前使用实验室研磨机将样品研磨成细粉，过40目筛。收集菜籽粉末样品，转移到聚丙烯试管中保存。
步骤II、硫代葡萄糖苷的提取：称取0.4g菜籽粉末样品放入10mL离心管中，加入5mL70％甲醇水溶液，混合液在20℃下超声处理20min。8000rmp离心20min，收集上清液，定容至5mL，得到菜籽提取液。
步骤III、硫代葡萄糖苷的纯化：将C18微柱装置安装好，5mL甲醇冲洗C18微柱，排干，5mL超纯水冲洗C18微柱，排干，加入1mL菜籽提取液，排干，用4mL超纯水洗脱，收集，用超纯水将洗脱定容至5mL，过0.22μm滤膜之后得到进样试液。
步骤IV、采用液相色谱-质谱联用仪对进样试液进行检测，其中，HPLC-MS分析条件：5mM甲酸铵的水和甲醇溶液(7：3v/v)作为流动相，流速＝0.3mL/min，色谱柱：C18色谱柱(内径100mm×2.5mm，粒径＝1.7μm，Waters)，进样量10μL，自动进样器处于10℃恒温条件下。Q-Orbitrap质谱仪配备了HESI源，该源使用以下优化的参数集使用：鞘气流速＝30L/min；辅助气体流量＝10L/min；吹扫气流量＝1L/min；喷雾电压＝4.30kV；毛细管温度＝320℃。使用以上设置在LC-MS全扫描模式下获取所有定量数据，扫描范围＝300-500m/z。得到基于全扫描模式确定的m/z值和在MS2模式下观察到的硫代葡萄糖苷碎片。
实施例6
一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法，具体包括以下步骤：
步骤I、原料的预处理：白菜型菜籽样品用蒸馏水洗涤，晾干，立即在-80℃冷冻保持48h，以抑制黑芥子酶活性。提取前使用实验室研磨机将样品研磨成细粉，过40目筛。收集菜籽粉末样品，转移到聚丙烯试管中保存。
步骤II、硫代葡萄糖苷的提取：称取0.4g菜籽粉末样品放入10mL离心管中，加入5mL70％甲醇水溶液，混合液在30℃下超声处理20min。8000rmp离心20min，收集上清液，定容至5mL，得到菜籽提取液。
步骤III、硫代葡萄糖苷的纯化：将C18微柱装置安装好，5mL甲醇冲洗C18微柱，排干，5mL超纯水冲洗C18微柱，排干，加入1mL菜籽提取液，排干，用4mL超纯水洗脱，收集，用超纯水将洗脱定容至5mL，过0.22μm滤膜之后得到进样试液。
步骤IV、采用液相色谱-质谱联用仪对进样试液进行检测，其中，HPLC-MS分析条件：5mM甲酸铵的水和甲醇溶液(7：3v/v)作为流动相，流速＝0.3mL/min，色谱柱：C18色谱柱(内径100mm×2.5mm，粒径＝1.7μm，Waters)，进样量10μL，自动进样器处于10℃恒温条件下。Q-Orbitrap质谱仪配备了HESI源，该源使用以下优化的参数集使用：鞘气流速＝30L/min；辅助气体流量＝10L/min；吹扫气流量＝1L/min；喷雾电压＝4.30kV；毛细管温度＝320℃。使用以上设置在LC-MS全扫描模式下获取所有定量数据，扫描范围＝300-500m/z。得到基于全扫描模式确定的m/z值和在MS2模式下观察到的硫代葡萄糖苷碎片。
为了进一步验证本发明的优异效果，发明人还进行了如下对比实验：
对比例1
一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法，具体包括如下步骤：
步骤I、硫代葡萄糖苷的提取：称取粉粹后的菜籽0.2g到10mL离心管中，加入2mL70％甲醇溶液，55℃超声20min，离心10min，取上清液(1)，继续往沉淀里面加入2mL70％甲醇溶液，55℃超声20min，5000rmp离心10min，取上清液(2)，将上清液(1)和(2)合并定容至5mL，形成提取液。
步骤II、硫代葡萄糖苷的纯化：将凝胶柱装置安装好，加入750μL葡萄糖凝胶树脂，用洗耳球将水分排干。再加入1mL6moL/L甲酸咪唑冲洗凝胶树脂，排干水分，重复1次。再加入1mL超纯水冲洗凝胶树脂，排干水分，重复1次。再加入1mL提取液，自然过滤，排干水分。再加入1mL0.02moL/L醋酸钠溶液，排干水分，重复1次。将柱子排水口封住，加入200μL硫酸酯酶，放入恒温恒湿箱反应20h。再往凝胶柱中加入1mL超纯水，排干，重复3次。将收集液定容至5mL，过0.22μm滤膜之后得到进样试液。
步骤III、采用液相色谱仪对进样试液进行检测。色谱柱：SpherisorbC18柱，流动相A相：超纯水，流动相B相：乙腈，洗脱梯度：0min：0％B相，12min：20％B相，16min：20％B，16.5min：0％B，21min：0％B。流速：1mL/min，柱温30℃，紫外检测波长229nm。
按此提取方法只能鉴定出1-14种菜籽硫代葡萄糖苷。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法，其特征在于，所述菜籽硫代葡萄糖苷包括5-甲硫戊基硫苷、4-(甲基亚磺酰基)丁基硫苷、4-甲硫丁基硫苷、3-(甲基磺酰基)丙基硫苷、白介子硫苷、3-甲硫丙基硫苷中的一种或多种；且
所述提取检测方法的步骤包括：
步骤I、原料预处理，将菜籽样品在-80℃冷冻保持24-48h后，研磨过筛，得到菜籽粉末样品；
步骤II、硫代葡萄糖苷的提取，将步骤I得到的菜籽粉末样品溶于70％甲醇水溶液中，再将混合液在75℃下水浴20～40min，离心收集上清液，得到菜籽提取液；
步骤III、硫代葡萄糖苷的纯化，利用固相萃取柱和微孔滤膜对步骤II得到的菜籽提取液进行纯化过滤，得到进样试液；
步骤IV、利用液相色谱-质谱联用仪对步骤III得到的进样试液进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法，其特征在于，所述硫代葡萄糖苷还包括2-羟基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷、反式-2-羟基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷、丙烯基硫代葡萄糖苷、4-甲亚砜丁基硫代葡萄糖苷、2-羟基-4-戊烯基硫代葡萄糖苷、5-甲亚砜戊基硫代葡萄糖苷、3-丁烯基硫代葡萄糖苷、4-羟基-3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷、4-戊烯基硫代葡萄糖苷、苯甲基(苄基)硫代葡萄糖苷、3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷、苯乙基硫代葡萄糖苷、4-甲氧基3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷、1-甲氧基-3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法，其特征在于，所述步骤I中还包括对菜籽样品进行蒸馏水洗涤、晾晒，且所述研磨过筛为40目筛，并将收集得到的菜籽粉末样品转移到聚丙烯试管中保存。
4.根据权利要求1所述的一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法，其特征在于，将所述步骤II中的水浴处理替换为在20～40℃下水浴超声处理20min。
5.根据权利要求1或4任一所述的一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法，其特征在于，所述步骤II的离心处理的具体步骤为8000rmp离心处理20min。
6.根据权利要求1所述的一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法，其特征在于，所述步骤III中的固相萃取柱为C18柱，微孔滤膜为0.22μm的有机相滤膜。
7.根据权利要求1所述的一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法，其特征在于，所述步骤IV中液相色谱-质谱联用仪液相色谱的分析条件为：5mM甲酸铵的水和甲醇溶液按7：3(v/v)作为流动相，流速为0.3mL/min，色谱柱为内径100mm×2.5mm，粒径1.7μm的C18色谱柱。
8.根据权利要求7所述的一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法，其特征在于，所述步骤IV中液相色谱-质谱联用仪质谱的分析条件为：采用HESI源，鞘气流速＝30L/min；辅助气体流量＝10L/min；吹扫气流量＝1L/min；喷雾电压＝4.30kV；毛细管温度＝320℃；且扫描范围为300-500m/z。
9.根据权利要求8所述的一种菜籽硫代葡萄糖苷的提取检测方法，其特征在于，所述步骤IV得到的检测数据为基于全扫描模式下确定的菜籽硫代葡萄糖苷组分的m/z值和在MS2模式下得到的硫代葡萄糖苷碎片。
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