CN105116060A - 一种油菜素内酯的快速高效检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种油菜素内酯的快速高效检测方法，它包括以下步骤：以新鲜的葡萄果实为材料，用液氮快速研磨成粉末状，加入80-95％甲醇、同位素内标2H3油菜素内酯、2H3油菜素甾酮，低温超声提取，静置2-5h后过滤，取滤渣加80-95％甲醇再浸提1-2h，过滤，合并两次滤液；物理吸附除水后，依次过C18柱、sephadex？LH-20柱、silica柱，甲醇洗脱得到富集的样品液；加入苯硼酸，进行衍生反应，冷却后浓缩至干；使用乙腈复溶，供液相色谱测定；选用乙腈和水作为流动相，乙腈和水的体积比为(6︰4)～(9︰1)，洗脱方式为等度洗脱，收集目的峰。该方法快速有效、基线稳定，对油菜素内酯分离良好。
Description
技术领域
本发明涉及植物有效成分检测技术领域，具体涉及一种葡萄果实中油菜素内酯的快速高效检测方法。
背景技术
油菜素内酯(brassinosteroids,BRs)又称芸苔素内酯、芸苔素甾醇类激素。天然油菜素内酯是一种最新植物内源激素，1970年，由美国学者J.W.米切尔首次从油菜花粉中分离出，主要有效成分为具类固醇结构的BR。其生理活性大大超过现有的五种激素，是国际上公认为活性最高的高效、广谱、无毒的植物生长调节剂，已被誉为第六激素。油菜素内酯广泛存在于被子植物、裸子植物和某些低等植物中，从在植物体内的分布来看存在于根、茎、叶、花、粉、雌蕊、果实和种子中，其中花粉中含有较丰富的芸苔素内酯。油菜素内酯促进植物伸长的效果非常显著，其作用浓度要比生长素低好几个数量级。其作用机理与生长素相似，YoPP等(1981)发现油菜素内酯与生长素有正协同作用。通过促进细胞膜系统质子泵对氢离子的泵出，导致自由空间酸化，使细胞壁松弛从而促进生长。同时，油菜素内酯还能抑制生长素氧化酶的活性，提高植物内源生长素的含量，所以，当油菜素内酯与生长素同时使用时，有明显的加成效果。
目前，测定油菜素内酯的检测方法多为高效液相色谱紫外检测、气相色谱法、液相色谱一质谱联用法、气相色谱一质谱联用法、薄层色谱等，国内有关油菜素内酯检测方法的专利主要有：中国专利CN201210486507.3公开了一种植物样品中内源性油菜素甾醇的定量检测方法，在提取过程中加入同位素内标2H3油菜素内酯和2H3油菜素甾酮，除水后样品溶液过活化后的双层固相萃取小柱，解吸后收集上样流出液和解吸液，以除去样品中的溶剂，以乙醚溶解样品，定容后的样品进入高效液相色谱-电喷雾-串联质谱分析；中国专利201310131422.8公开了一种植物样品中内源性油菜素甾醇的样品前处理方法，在提取过程中加入同位素内标2H3油菜素内酯和2H3油菜素甾酮，除水后用活化后的硼亲和材料萃取样品溶液，清洗硼亲和材料，再以解吸液解吸硼亲和材料上的油菜素甾醇，收集解吸液，去除解吸液中的有机溶剂，进而实现内源性油菜素甾醇的样品前处理。提取所用的溶剂为甲醇、乙腈、异丙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、乙醚、丙酮或甲酸中的一种或几种。除水所用材料是采用由碳材料、亲水材料、疏水材料通过不同方式组合以化学或物理方式构建的硅胶颗粒、磁性材料、无定型材料、凝胶、填充柱或整体柱。硼亲和材料为含有硼酸基团的硅胶颗粒、磁性材料、无定型材料、凝胶、填充柱或整体柱中的一种。检测油菜素甾醇的仪器包括：液相色谱-光学检测器、液相色谱-质谱仪联用、毛细管电泳-光学检测器联用，或者毛细管电泳-质谱仪联用。但上述方法及专利均未涉及有关葡萄果实中油菜素内酯的测定方法。
因此，本领域迫切需要提供一种快速有效的、基线稳定、分离良好的葡萄果实中油菜素内酯的HPLC方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的状况，提供了一种快速有效的、基线稳定、分离良好的葡萄果实中油菜素内酯的检测方法。
本发明所采用的技术方案为：
一种油菜素内酯的快速高效检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以新鲜的葡萄果实为材料，用液氮快速研磨成粉末状，以葡萄果实的重量为计算基准按4-5mL/g的量比加入80-95％甲醇作为浸提液，并同时加入同位素内标2H3油菜素内酯3-5ng/g和2H3油菜素甾酮3-5ng/g，低温超声提取30-60min，接着4℃冰箱静置2-5h，然后过滤，取滤渣以葡萄果实的重量为计算基准按0.3-0.5mL/g的量比加80-95％甲醇浸提液，浸提1-2h，然后过滤，合并两次过滤的滤液；
(2)除水：对步骤(1)得到的滤液进行物理吸附除水，得到上柱液；
(3)上柱液过C18柱，进行样品吸附，使用40mmol/L的醋酸铵缓冲液(pH值6.5)作为洗脱液洗脱得到吸附液，吸附液过sephadexLH-20柱进行除杂，使用甲醇作为洗脱液得到洗脱产物后，再过silica柱，甲醇洗脱得到富集的样品液；
(4)按0.5mg/mL的量比在样品液中加入苯硼酸，于60-80℃水浴衍生反应20-40min，冷却后经旋转蒸发仪浓缩至干；
(5)使用乙腈进行复溶，得到浓度为0.5-5μg/mL的上样液，供液相色谱测定；
(6)液相色谱测定：选用乙腈和水作为流动相，乙腈和水的体积比为(6︰4)～(9︰1)，选择的激发波长为280nm、发射波长为700nm或激发波长为310nm、发射波长为375nm，选择的检测器为荧光检测器，洗脱方式为等度洗脱，根据标准液图谱收集目的峰。
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：
(1)优化了目标产物的提取工艺，增加了目标产物的提取率、缩短了目标产物的提取时间；
(2)优化了检测方法，使产峰的理论塔板数大大提高，且出峰时间也大大缩短，与杂质峰分离的很好，试剂用量和人力得到了大大的节省，真正达到了HPLC快速、高效的、准确的目的。
附图说明
图1所示的是本发明实施例3中的HPLC图谱，其中A标样图、B样品图；
图2所示的是本发明实施例4中的HPLC图谱，其中A标样图、B样品图；
图3所示的是本发明实施例5中的HPLC图谱，其中A标样图、B样品图；
图4所示的是本发明实施例6中的HPLC图谱，其中A标样图、B样品图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。下列实例中未标明具体条件的实验方法，通常按照规定条件或者按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：
准确称取10.00g葡萄果实，液氮迅速研磨至粉末状，加入40ml80％甲醇后加同位素内标2H3油菜素内酯40ng和2H3油菜素甾酮40ng，低温下超声萃取60min后于4℃冰箱静置2h，过滤后滤渣重新加4ml甲醇(80％)浸提液浸提1h，过滤，合并提取液。利用氮吹除去浸提液中的水分，上柱液过C18柱，进行样品吸附，使用40mmol/L的醋酸铵缓冲液(pH值6.5)作为洗脱液洗脱得到吸附液，吸附液过sephadexLH-20柱进行除杂，使用甲醇作为洗脱液得到洗脱产物后，再过silica柱，用10ml甲醇洗脱得到富集的样品液，加入5mg9-菲硼酸，于70℃水浴中衍生20min，冷却后经旋转蒸发仪浓缩至干，用乙腈定容至1μg/mL，待测。
实施例2：
准确称取10.00g葡萄果实，液氮迅速研磨至粉末状，加入40ml甲醇(95％)后加同位素内标2H3油菜素内酯40ng和2H3油菜素甾酮40ng，与低温下超声30min后于4℃冰箱静置5h，过滤，滤渣加入10ml甲醇(95％)重新置于4℃冰箱静置1h后过滤，合并提取液。利用氮吹除去浸提液中的水分，上柱液过C18柱，进行样品吸附，使用40mmol/L的醋酸铵缓冲液(pH值6.5)作为洗脱液洗脱得到吸附液，吸附液过sephadexLH-20柱进行除杂，使用甲醇作为洗脱液得到洗脱产物后，再过silica柱，用10ml甲醇洗脱得到富集的样品液，加入5mg9-菲硼酸，于70℃水浴中衍生20min，冷却后经旋转蒸发仪浓缩至干，用乙腈定容至1μg/mL，待测。
实施例3-6：
对实施例1的待测样品进行HPLC检测，具体试验条件如下：
仪器和色谱条件：
仪器：Waters高效液相色谱仪，配有1525二元HPLC泵、717+自动进样器、474荧光检测器、Empower色谱工作站；
色谱柱：C18柱(150mm×4.6mm.i.d)；
流动相A：双蒸水；
流动相B：乙腈；
流速：1m/min；
检测波长：激发波长为280nm，发射波长为700nm或者选择310nm和375nm分别作为激发波长和发射波长；
柱温：37℃。
标准溶液：精确称取0.0250g油菜素内酯标准品用乙腈定容至25ml，得到浓度为100μg/ml的油菜素内酯的标准储备液然后稀释到4μg/ml，作为目的峰收集的图谱参照。
实施例3：
液相色谱测定：选用乙腈和水作为流动相，乙腈和水的体积比为6︰4，选择的激发波长为280nm、发射波长为700nm，选择的检测器为荧光检测器，洗脱方式为等度洗脱，根据标准液图谱收集目的峰。在此条件下样品的保留时间为16分钟左右，基线漂移，理论塔板数达到17893，图谱如图1所示。
实施例4：
液相色谱测定：选用乙腈和水作为流动相，乙腈和水的体积比为7︰3，选择的激发波长为280nm、发射波长为700nm，选择的检测器为荧光检测器，洗脱方式为等度洗脱，根据标准液图谱收集目的峰。在此条件下样品的保留时间为11.38min，分离度1.18，理论塔板数达到12893，图谱如图2所示。
实施例5：
液相色谱测定：选用乙腈和水作为流动相，乙腈和水的体积比为8︰2，选择的激发波长为310nm、发射波长为375nm，选择的检测器为荧光检测器，洗脱方式为等度洗脱，根据标准液图谱收集目的峰。在此条件下样品的保留时间为9分钟左右，分离效果良好，理论塔板数达到11600，图谱如图3所示。
实施例6：
液相色谱测定：选用乙腈和水作为流动相，乙腈和水的体积比为9︰1，选择的激发波长为310nm、发射波长为375nm，选择的检测器为荧光检测器，洗脱方式为等度洗脱，根据标准液图谱收集目的峰。在此条件下样品的保留时间为7分钟左右，分离效果良好，理论塔板数达到12000，图谱如图4所示。
本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合植物有效成分提取的市售产品。
以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
Claims (1)
1.一种油菜素内酯的快速高效检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以新鲜的葡萄果实为材料，用液氮快速研磨成粉末状，以葡萄果实的重量为计算基准按4-5mL/g的量比加入80-95％甲醇作为浸提液，并同时加入同位素内标2H3油菜素内酯3-5ng/g和2H3油菜素甾酮3-5ng/g，低温超声提取30-60min，接着4℃冰箱静置2-5h，然后过滤，取滤渣以葡萄果实的重量为计算基准按0.3-0.5mL/g的量比加80-95％甲醇浸提液，浸提1-2h，然后过滤，合并两次过滤的滤液；
(2)除水：对步骤(1)得到的滤液进行物理吸附除水，得到上柱液；
(3)上柱液过C18柱，进行样品吸附，使用40mmol/L的醋酸铵缓冲液作为洗脱液洗脱得到吸附液，吸附液过sephadexLH-20柱进行除杂，使用甲醇作为洗脱液得到洗脱产物后，再过silica柱，甲醇洗脱得到富集的样品液；
(4)按0.5mg/mL的量比在样品液中加入苯硼酸，于60-80℃水浴衍生反应20-40min，冷却后经旋转蒸发仪浓缩至干；
(5)使用乙腈进行复溶，得到浓度为0.5-5μg/mL的上样液，供液相色谱测定；
(6)液相色谱测定：选用乙腈和水作为流动相，乙腈和水的体积比为(6︰4)～(9︰1)，选择的激发波长为280nm、发射波长为700nm或激发波长为310nm、发射波长为375nm，选择的检测器为荧光检测器，洗脱方式为等度洗脱，收集目的峰。
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