CN102901778A

CN102901778A - 检测乳或乳制品中氯霉素的预处理方法及乳或乳制品中氯霉素检测方法

Info

Publication number: CN102901778A
Application number: CN2011102139890A
Authority: CN
Inventors: 崔涛; 张雪峰; 常建军; 李梅; 刘卫星
Original assignee: Inner Mongolia Mengniu Dairy Group Co Ltd
Current assignee: Inner Mongolia Mengniu Dairy Group Co Ltd
Priority date: 2011-07-29
Filing date: 2011-07-29
Publication date: 2013-01-30

Abstract

本发明涉及一种检测乳或乳制品中氯霉素的预处理方法：在样品中加入样品提取剂得到样品提取液，将样品提取液依次经涡旋处理、超声处理和离心处理后取得一上清液，吹干上清液后所得物质用浓度为10%的甲醇溶液溶解，得到第一溶解液；依次用甲醇、超纯水流过固相提取小柱，然后将第一溶解液经固相提取小柱净化和富集，再用超纯水流过固相提取小柱后抽干固相提取小柱；向抽干后的固相提取小柱中分别加入同等比例的甲醇和乙酸乙酯洗脱，收集的洗脱液吹干后，用浓度为50%的甲醇溶液溶解得到第二溶液，将第二溶液经涡旋处理后再用微孔滤膜过滤。采用这种方法可以提高检测的回收率，且可有效消除杂质干扰。

Description

检测乳或乳制品中氯霉素的预处理方法及乳或乳制品中氯霉素检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测乳及乳制品中抗生素含量的方法，尤其涉及一种检测乳或乳制品中氯霉素的预处理方法，还涉及一种乳及乳制品中氯霉素残留量的检测方法。

背景技术

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)属氯霉素类抗生素（Chloramphenicols，CAPs），是兽医临床常用的抗生素，其主要毒副作用是抑制造血机能，会引起不可逆转的再生障碍性贫血。

目前为了检测乳或乳制品中的氯霉素，通常的预处理方法是利用固相萃取方法，用以提取和净化样本中的氯霉素。但是采用通常的预处理方法，检测回收率不高，不能有效的消除杂质干扰。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测乳或乳制品中氯霉素的预处理方法，采用此方法可以提高检测回收率，有效消除杂质干扰。

本发明的另一个目的是提供一种乳或乳制品中氯霉素的检测方法，采用此方法检测灵敏度高，检测时间短。

本发明提供了一种检测乳或乳制品中氯霉素的预处理方法，其包括以下步骤：

在样品中加入样品提取剂得到样品提取液，将样品提取液依次经涡旋处理、超声处理和离心处理后取得一上清液，吹干上清液后所得物质用浓度为10%的甲醇溶液溶解，得到第一溶解液；

依次用甲醇、超纯水流过固相提取小柱，然后将第一溶解液经固相提取小柱净化和富集，再用超纯水流过固相提取小柱后抽干固相提取小柱；

向抽干后的固相提取小柱中分别加入同等比例的甲醇和乙酸乙酯用于洗脱，收集的洗脱液吹干后，用浓度为50%的甲醇溶解得到第二溶液，将第二溶液经涡旋处理后再用微孔滤膜过滤。

在检测乳或乳制品中氯霉素的预处理方法的一种示意性实施方式中，样品提取剂为乙酸乙酯。

在检测乳或乳制品中氯霉素的预处理方法的一种示意性实施方式中，在第一个步骤中用氮气吹干上清液。

本发明还提供了一种乳或乳制品中氯霉素的检测方法，其包括以下步骤：

a）制备氯霉素标准溶液，利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪检测，从而生成氯霉素的标准曲线图；

b）利用上述预处理方法制备预处理溶液；

c）利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪在与步骤a）相同的条件下检测预处理溶液，得到一检测结果；

d）将步骤c）中获得的检测结果与步骤a）中得到的标准曲线进行对比，通过计算确定样品中的氯霉素含量。

乳或乳制品中氯霉素的检测方法的一种示意性实施方式中，步骤a）中的氯霉素标准溶液为5种不同浓度的氯霉素标准溶液，5种不同浓度的氯霉素标准溶液的浓度分别为5.0ng/mL、1.0ng/mL、0.5ng/mL、0.3ng/mL、0.1ng/mL。

检测乳或乳制品中氯霉素的预处理方法中，离心处理后得到上清液被吹干后得到的物质用10%的甲醇溶液溶解，10%的甲醇溶液可以充分溶解氯霉素，减少其在处理过程中的损失，同时10%的甲醇溶液在净化过程中不会影响固相提取小柱的吸附，因而可以提高检测的回收率。而且在第一溶液经固相提取小柱净化和富集后，用超纯水淋洗固相提取小柱，可除去固相提取小柱中富集的极性物质，可消除有机溶剂的干扰，提高预处理方法的回收率和准确度。另外，利用同等比例的甲醇和乙酸乙酯洗脱，甲醇的极性为6.6，乙酸乙酯的极性为4.3，采用上述溶液可以更加针对目标物的极性，使洗脱更完全，洗脱更干净，以提高最终检测的回收率。

附图说明

以下附图仅对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。

图1是氯霉素的总离子流谱图,其横坐标表示时间（min）,纵坐标表示离子流响应信号强度的大小。

图2是氯霉素子离子中定量离子的色谱图，其横坐标表示时间（min）, 纵坐标表示离子流响应信号强度的大小。

图3是氯霉素子离子中定性离子的色谱图，其横坐标表示时间（min）, 纵坐标表示离子流响应信号强度的大小。

图4是氯霉素的标准曲线图，其横坐标表示氯霉素的浓度，单位为纳克/毫升(ng/mL)，纵坐标表示离子响应信号强度。

具体实施方式

下面将结合具体实施方案对本发明的方法做更详细的说明。本领域技术人员应当理解，下述实施例均用于对本发明所要求保护的范围进行实例性的描述，以此概括本发明的各参数的相对范围，因而不能将之理解为对本发明的一种具体限制。

在本文中，样品包括乳样品或乳制品样品，以下实施例采用的是牛奶样品，但本领域技术人员可以理解，也可以在采用其他样品。

实施例1

1）标准溶液的配制：

精密称取氯霉素标准品各10mg，用甲醇定容于100mL棕色容量瓶中，混匀，得到氯霉素浓度为0.1mg/mL的标准储备溶液，放置于-18℃冷柜避光保存，至少可以保存4个星期。使用时，稀释成5.0ng/mL、1.0ng/mL、0.5 ng/mL、0.3 ng/mL、0.1ng/mL的标准溶液。也可以制备不同于上述浓度的多个标准溶液。

2）流动相的配制：

流动相A：甲醇

流动相B：0.1%甲酸水溶液

3）预处理方法：

称取牛奶样品5.00g，加入15mL乙酸乙酯，经涡旋设备处理1min，放入超声机中进行超声处理20min，在14000r/min下进行离心处理10min后，取10mL上清液，置于氮吹管中，在50℃下，用氮气吹干，再用5.5mL的浓度为10%的甲醇溶液溶解，得到第一溶解液。

用5.0mL甲醇以1.0～2.0mL/min的流速通过固相提取小柱，再用5.0mL超纯水以1.0～2.0mL/min的流速过柱，将第一溶液在流速为1.0～2.0mL/min的条件下经固相提取小柱净化和富集，然后用5.0mL的超纯水以1.0～2.0mL/min的流速过此柱，用真空泵将固相提取小柱抽干；

向富集目标物质的固相提取小柱中分别加入3mL甲醇和3mL乙酸乙酯洗脱，洗脱流速1.0～2.0mL/min，收集洗脱液，用氮气在45℃水浴下吹干，用1.0mL的50%甲醇溶液溶解得到第二溶解液，第二溶解液涡旋后，经0.22um微孔滤膜过滤得到预处理溶液。

4）色谱条件：

色谱柱：沃特斯（Waters）公司的ACQUITY UPLC BEH C18柱（50mm×2.1mm I.D.,1.7μm）；

柱温：30℃；

流速：0.35mL/min；

进样体积：10μL；

流动相：A（甲醇）；B（0.1%甲酸水）；

流动相比例：45∶55；

采用等度洗脱。

5）质谱条件：

电离方式：电喷雾电离（ESI）；

电离电压：3.00KV；

锥孔电压：30V；

源温度：120℃；

去溶剂气温度：450℃；

去溶剂气流量：600L/hr；

采集方式：多反应监测（MRM）。

6）检测步骤：

a)标准曲线的绘制：利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪测定不同浓度的氯霉素标准溶液。提取总离子流如图1所示，其横坐标为时间（min），纵坐标表示离子流响应信号强度的大小，因折合为氯霉素目标化合物的离子流强度占总离子流的百分比，所以无单位。由图1可以看出氯霉素的保留时间为0.87min。

从图1的总离子流图中提取氯霉素的母离子与各自定量子离子的离子对色谱图，结果见图2和图3，其横坐标为时间（min），纵坐标表示离子响应信号强度的大小。图2是氯霉素子离子中定量离子的色谱图，图3是氯霉素子离子中定性离子的色谱图。.

利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪测定不同浓度的氯霉素标准溶液（5.0ng/mL、1.0ng/mL、0.5 ng/mL、0.3 ng/mL、0.1ng/mL），根据所得数据，绘制标准曲线图，结果见图4。图4为氯霉素标准曲线图，横坐标表示浓度，单位为纳克/毫升（ng/mL）,纵坐标表示响应信号强度的大小。

根据氯霉素的标准曲线图，确定线性方程及线性相关系数，以信噪比等于3时对应的浓度为检出限，具体结果见表2。

表2 氯霉素的线性方程及检出限

化合物	线性方程（y=ax+b）	线性相关系数（r）	检出限（S/N≥3）（ug/Kg）
				氯霉素	Y=24.09X-1.49	0.9999	0.05

采用多反应监测（MRM）采集方式，在实验浓度范围内，相关系数r=0.9999，结果氯霉素平均回收率为91.8-99.6%，精密度的相对标准偏差（RSD）为5.59%。

b）样品测定：

利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱检测制备好的待测样品，得到氯霉素的图谱，将结果套入标准曲线方程，得到样品中氯霉素的含量为0.2μg/Kg。

在上述检测方法的步骤3）预处理方法中，在第一溶液经固相提取小柱净化和富集后，用超纯水淋洗固相提取小柱，可除去固相提取小柱中富集的极性物质，可消除有机溶剂的干扰，提高预处理方法的回收率和准确度。另外，利用同等比例的甲醇和乙酸乙酯洗脱，甲醇的极性为6.6，乙酸乙酯的极性为4.3，采用上述溶液可以更加针对目标物的极性，使洗脱更完全，洗脱更干净，以提高最终检测的回收率。

在上述检测方法的步骤3）预处理方法中，样品提取剂采用的是乙酸乙酯，乙酸乙酯可以很好的提取出乳样品中的氯霉素，且乙酸乙酯的沸点较低，便于蒸发，可以使检测过程更快捷简便，但是本领域技术人员可以理解，也可以采用其他样品提取剂。

实施例2

将浓度为1.0μg/Kg的氯霉素加标样品分别用超纯水、5%的甲醇溶液、10%的甲醇溶液、15%的甲醇溶液、20%的甲醇溶液溶解，分别得到5种不同的第一溶液。

取5个固相提取小柱，分别用5.0mL甲醇以1.0～2.0mL/min的流速通过各固相提取小柱，再用5.0mL超纯水以1.0～2.0mL/min的流速通过各固相提取小柱，将上述五种不同的第一溶液在流速为1.0～2.0mL/min的条件下分别经5个固相提取小柱净化和富集，然后用5.0mL的超纯水以1.0～2.0mL/min的流速通过各固相提取小柱，用真空泵将固相提取小柱抽干；向富集目标物质的固相提取小柱中分别加入3mL甲醇和3mL乙酸乙酯洗脱，洗脱流速为1.0～2.0mL/min，收集洗脱液，用氮气在45℃水浴下吹干，用1.0mL的50%甲醇溶液溶解，涡旋，经0.22um微孔滤膜过滤后得到5种预处理溶液用于检测，通过检测后得知，5种预处理溶液的平均回收率分别为：66.7%、80.9%、95.6%、75.4%、73.5%，由此可见，吹干上清液后所得物质用10%的甲醇溶液溶解可以提高检测的回收率。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1. 检测乳或乳制品中氯霉素的预处理方法，其包括以下步骤：

在样品中加入样品提取剂得到样品提取液，将所述样品提取液依次经涡旋处理、超声处理和离心处理后取得一上清液，吹干所述上清液后所得物质用浓度为10%的甲醇溶液溶解，得到第一溶解液；

依次用甲醇、超纯水流过固相提取小柱，然后将所述第一溶解液经所述固相提取小柱净化和富集，再用超纯水流过所述固相提取小柱后抽干所述固相提取小柱；

向抽干后的所述固相提取小柱中分别加入同等比例的甲醇和乙酸乙酯洗脱，收集的洗脱液吹干后，用浓度为50%的甲醇溶液溶解得到第二溶液，将所述第二溶液经涡旋处理后再用微孔滤膜过滤。

2. 根据权利要求1所述的检测乳或乳制品中氯霉素的预处理方法，其中所述样品提取剂为乙酸乙酯。

3. 根据权利要求1所述的检测乳或乳制品中氯霉素的预处理方法，其中，在第一个步骤中用氮气吹干所述上清液。

4. 乳或乳制品中氯霉素的检测方法，其包括以下步骤：

a）制备多种不同浓度的氯霉素标准溶液，利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪检测，从而生成氯霉素的标准曲线图；

b）利用权利要求1至3所述的预处理方法制备预处理溶液；

c）利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪在与步骤a）相同的条件下检测所述预处理溶液，得到一检测结果；

d）将步骤c）中获得的所述检测结果与步骤a）中得到的所述标准曲线进行对比，通过计算确定所述样品中的氯霉素含量。

5. 根据权利要求4所述的乳或乳制品中氯霉素的检测方法，其中，所述步骤a）中的所述氯霉素标准溶液为5种不同浓度的氯霉素标准溶液，所述5种不同浓度的氯霉素标准溶液的浓度分别为5.0ng/mL、1.0ng/mL、0.5ng/mL、0.3ng/mL、0.1ng/mL。