CN105203654A - 一种用于测定中兽药散剂中11种非法添加药物含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于测定兽药散剂中11种非法添加药物含量的方法，包括以下步骤：(1)采用有机溶剂超声提取方法对待测兽药散剂进行预处理，有机溶剂为甲醇-水，甲醇和水的体积比为0.9-1.1:0.9-1.1；(2)通过液相色谱-串联质谱法对提取液中的喹乙醇、利巴韦林、金刚烷胺、金刚乙胺、地塞米松、氯霉素、己烯雌酚、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林和呋喃唑酮进行检测。本发明的样品预处理简单，以甲醇/水(50+50)作为提取试剂超声提取，过滤膜后即可上机检测，且回收率良好；本发明的方法具有更低的检出限，喹乙醇、利巴韦林、金刚烷胺、金刚乙胺、地塞米松、氯霉素、呋喃它酮、呋喃唑酮的检出限为50μg/kg；呋喃妥因、呋喃西林和己烯雌酚的检出限为100μg/kg。

Description

一种用于测定中兽药散剂中11种非法添加药物含量的方法

技术领域

本发明涉及一种用于测定中兽药散剂中11种非法添加药物含量的方法。

背景技术

中兽药具有毒副作用相对较小、在动物源性食品中无残留或残留量少和不易产生耐药性等优点，其产品日益受到畜禽养殖者的重视，许多畜禽养殖企业已将中兽药作为预防、治疗疾病及促进动物生长的重点使用对象。目前一些不法分子利用兽药监管中存在的漏洞，通过非法添加疗效确定且使用广泛的化学药物，使疗效缓和的中兽药具有速效等优点，这些化学成分通过食物链传递，最终对人体健康产生严重危害，中兽药中非法添加化学药物的检测逐渐受到人们的重视。

关于中兽药中非法添加药物的检测方法，目前有薄层色谱法、红外光谱法、毛细管电泳法、原子吸收法、液相色谱法等，但上述方法存在操作繁琐，灵敏度低或准确性差等问题。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种用于测定中兽药散剂中11种非法添加药物含量的方法。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：

一种用于测定中兽药散剂中11种非法添加药物含量的方法，包括以下步骤：

(1)采用有机溶剂超声提取方法对待测中兽药散剂进行预处理，有机溶剂为甲醇-水，甲醇和水的体积比为0.9-1.1:0.9-1.1；

(2)通过液相色谱-串联质谱法对提取液中的喹乙醇、利巴韦林、金刚烷胺、金刚乙胺、地塞米松、氯霉素、己烯雌酚、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林和呋喃唑酮进行检测。

优选的，所述甲醇-水中，甲醇和水的体积为1:1。

以甲醇/水(1:1)作为提取试剂超声提取，过滤膜后即可上机检测，预处理简单易于操作，且回收率良好。虽然利用有机溶剂进行提取有机物质是公知常识，但是，不同的有机溶剂的提取效果不同，且有些有机溶剂会对后续的检测产生干扰。经过反复试验发现，大部分常用的有机溶剂都不能对这11种物质进行有效提取，或对后续的检测产生较大干扰，即得到的回收率普遍较小，且检测的谱图杂峰较多，不能精确反应待测物质的含量。本发明中选用体积比为1：1左右的甲醇-水作为提取液，对这11中非法添加物质都能进行很有效地提取，且不会对后续检测造成干扰，而甲醇的比例过大或过小都不能取得好的效果。

虽然有些有些地方会用到甲醇/水作为提取剂，但是待提取的对象不同，如，动植物组织中的相关物质的提取。虽然甲醇提取有机物是利用相似相溶的原理，甲醇/水的量足够多时，可以将待提取对象中的相关物质提取完全，但是，仍旧存在如下问题：待提取对象的不同，会导致提取到甲醇/水中的物质的种类及含量不同，无法保证提取的这些物质中不会存在干扰物质，或将待测物质屏蔽，或与待测物质产生相同的实验结果，或不能与待测物质完全分离产生干扰，进而使实验结果偏大或偏小，这些都是不可预期的，所以，本发明选择提取剂时，是大范围实验，不断排除，大部分的有机溶剂都不能产生令人满意的实验结果，而最后选择甲醇和水的体积比为1:1的甲醇/水也是不经意的一个发现，该甲醇/水不仅使实验结果令人满意，还大大提高了实验结果的重现性，所以该处的甲醇/水存在意料不到的技术效果。

优选的，步骤(1)中，所述中兽药散剂和甲醇-水的比例为(0.4-0.6)g：(4.5-5.5)ml。试验证明，当中兽药散剂和甲醇-水为以上比例时，能更有效利用甲醇-水，保证有效提取的同时，防止了甲醇-水的浪费。

优选的，步骤(1)中，所述超声时间为15-45min，优选为30min；超声的温度为25-35℃，优选为30℃。

优选的，步骤(1)中，将超声提取后的溶液进行过滤，有机滤膜的孔径为0.22或0.45μm，优选0.22μm。

超声波提取是利用超声波具有的机械效应，空化效应和热效应，通过增大介质分子的运动速度、增大介质的穿透力以提取生物有效成分。利用超声波技术来强化提取分离过程，可有效提高提取分离率，缩短提取时间、节约成本。上述超声条件经过实验验证使提取分离率最高。经过实验分析，所述滤膜的孔径为0.22μm，滤膜过滤可以有效除去杂质，以免影响检测结果的准确性。

优选的，步骤(2)中，液相色谱-串联质谱法的色谱条件为：采用十八烷基健合硅胶柱(C18柱)，流动相由A相和B相组成，A相为水，B相为乙腈，采用梯度洗脱。

进一步优选的，所述C18柱的粒径5μm，柱内径为2.1或4.6mm，柱长为50、150或250mm；优选色谱柱为C182.1×150mm，5μm；柱温为30℃，进样量：5μL。

更进一步优选的，喹乙醇、利巴韦林、金刚烷胺、金刚乙胺、地塞米松、氯霉素、呋喃它酮和呋喃唑酮的检测条件：流速：0.2mL/min；梯度洗脱程序：0-2min，B相保持5％；2-8min，B相从5％升至95％；8.1-10min，B相降至5％；10min后停止；

呋喃妥因、呋喃西林和己烯雌酚的检测条件：流速：0.3mL/min，梯度洗脱程序：0-5min，B相从20％升至50％；5-7min，B相从50％升至95％；7-8min，B相保持95％；8.1-10minB相降至5％；10min后停止。

由于兽药粉剂中的这11种非法添加物中，有些物质的极性相差很小，难以保证在有限的时间内将每种物质进行有效分离，所以，很难根据其性质确定流动相以及流动相的配比，而流动相的种类很多，每种流动相的浓度也有很大差别，所以，流动相的确定和梯度洗脱都是需要反复试验，需要发明人根据其多年工作经验，不断调整才能得到的。试验证明，当流动相为以上两种，梯度洗脱程序为以上程序时，可以有效将这11种物质进行分离，使这11种物质之间没有相互干扰，保证了试验结果的准确性。

优选的，步骤(2)中，液相色谱-串联质谱法的质谱条件为：

喹乙醇、利巴韦林、金刚烷胺、金刚乙胺、地塞米松、氯霉素、呋喃它酮和呋喃唑酮的检测条件：离子源：API-ES；毛细管电压：3000V；雾化压力：35psi；干燥气温度：325℃；干燥气流量：10L/min；离子极性：正；质量扫描模式：MRM模式(多反应监测模式)；

呋喃妥因、呋喃西林和己烯雌酚的检测条件：离子源：API-ES；毛细管电压：3000V；雾化压力：30psi；干燥气温度：300℃；干燥气流量：10L/min；离子极性：负；质量扫描模式：MRM模式(多反应监测模式)。

本发明方法还包括用各种非法添加的药物的标准品绘制标准曲线，并由此计算待测兽药散剂中非法添加药物的含量，具体方法如下：取11种化学药物的对照品储备液，配制一系列不同质量浓度的混合标准液，于上述条件和设定的11种非法添加药物的质谱参数下分别进样测定，绘制11种非法添加药物的标准曲线，得到线性方程、相关系数和线性范围。

虽然在相关文献中已经公开了很多中兽药散剂中的非法添加药物，但是公开的非法添加药物的数量很多，现有技术中还没有人提出将本发明中的11种物质的含量进行检测，喹乙醇、利巴韦林、地塞米松、己烯雌酚、呋喃它酮、呋喃妥因以及呋喃唑酮都没有使用液相色谱串联质谱的方法检测过，所以，这几种物质是否可以被该方法检测存在不可预期性，即使可以使用该方法进行检测，由于没有现有的技术作为参考，很难确定每种物质利用该方法进行检测的条件。

既然这些物质单独存在时是否能使用该方法进行检测都是未知的，而多种物质同时存在时，由于不同物质的极性不同或相差较小；或者不同物质之间存在相互作用，使物质的极性发生改变，进而使原本可以分离的物质不能分离等，这些都是制约使用液相色谱串联质谱方法进行同时检测的因素。所以，这11种物质是否能够同时检测或分几次才能检测出来都是未知的，如过这些物质不能同时被检测，就会使实验的进行更加困难，这都需要发明人的反复试验进行探索才能最终确定。所以使用本发明的方法来检测中兽药散剂中的这11种物质不是显而易见的。

本发明的有益效果为：

1、本发明的样品预处理简单，以甲醇/水(50+50)作为提取试剂超声提取，过滤膜后即可上机检测，且回收率良好，平均回收率为90.2％～111％；

2、本发明的方法具有更低的检出限，喹乙醇、利巴韦林、金刚烷胺、金刚乙胺、地塞米松、氯霉素、呋喃它酮、呋喃唑酮的检出限为50μg/kg；呋喃妥因、呋喃西林和己烯雌酚的检出限为100μg/kg，可以实现对中兽药散剂中这些非法添加药物更准确地检测。

附图说明

图1为利巴韦林提取离子流谱图；

图2为喹乙醇提取离子流谱图；

图3为金刚烷胺提取离子流谱图；

图4为金刚乙胺提取离子流谱图；

图5为呋喃它酮提取离子流谱图；

图6为呋喃妥因提取离子流谱图；

图7为呋喃西林提取离子流谱图；

图8为呋喃唑酮提取离子流谱图；

图9为地塞米松提取离子流谱图；

图10为己烯雌酚提取离子流谱图；

图11为氯霉素提取离子流谱图；

图12和图13为检测实际样品中11种非法添加药物的总离子流图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

仪器与试剂：快速分离液相色谱-串联四极杆质谱仪(6410B，安捷伦科技有限公司)，超纯水仪(Simplicity，默克密理博公司)，超声波提取仪(KQ-250B，昆山市超声仪器有限公司)、漩涡混合器(VORTEX-5，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)。

喹乙醇、氯霉素、己烯雌酚、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮购于农业部环境保护科研监测所；金刚烷胺购自百灵威科技有限公司；金刚乙胺、地塞米松购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；利巴韦林购自Sigma公司；甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯试剂，购自Tedia公司；娃哈哈饮用纯净水，购自杭州娃哈哈集团有限公司。

实施例1

1、色谱条件优化

本研究选用2.1×150mm，5μm的C18色谱柱在相对较短时间内保证11种非法添加药物的有效分离。实验比较甲醇-水、乙腈-水体系作为流动相对11种非法添加药物的分离效果的影响，结果表明待测化合物在乙腈-水流动相中的选择性优于甲醇-水体系且由于待测化合物极性差异较大，实验采用梯度洗脱方式获得理想的色谱分离效果，单个运行过程时间仅需10min。

2、质谱条件优化

表111种非法添加药物的优化质谱条件(带*者为定量离子)

采用流动注射方式，在正离子和负离子模式下对每种化合物进行一级质谱扫描获得其分子离子峰；在确定各类化合物的准分子离子峰后分别对其进行二级质谱分析，获得其碎片离子信息，确定定量离子和辅助定性离子。通过优化碎裂电压(Fragmentor，V)、碰撞电压(CollisionEnergy，eV)等参数，使11种非法添加药物的准分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大；对毛细管电压、雾化压力、干燥气温度、干燥气流量等进行优化，使每种待测化合物的离子化效率达到最佳。

(1)喹乙醇、利巴韦林、金刚烷胺、金刚乙胺、地塞米松、氯霉素、呋喃它酮、呋喃唑酮检测条件：离子源：API-ES；毛细管电压：3000V；雾化压力：35psi；干燥气温度：325℃；干燥气流量：10L/min；离子极性：正；质量扫描模式：MRM模式。

(2)呋喃妥因、呋喃西林、己烯雌酚测条件：离子源：API-ES；毛细管电压：3000V；雾化压力：30psi；干燥气温度：300℃；干燥气流量：10L/min；离子极性：负；质量扫描模式：MRM模式。其它质谱参数见表1；11种非法添加药物的提取离子流谱图见图1至图11所示。

3、样品前处理优化

待测11种非法添加药物溶于甲醇、乙腈等有机试剂，实验选用甲醇/水(50+50)作为提取试剂，加入金刚乙胺-D4和氯霉素-D5内标后，振荡混匀后超声提取30min，过0.22μm有机滤膜后进样检测，结果显示甲醇/水体系对11种非法添加药物的提取效率高达90％以上。且样品无需进一步净化，直接用于HPLC-MS/MS检测，即可较好的提取中兽药散剂中非法添加药物。

4、线性范围与检出限

将11种非法添加药物的标准溶液添加到空白基质中做标准曲线，配制浓度为50、100、200、500、1000、2000、5000μg/kg的标准溶液(含金刚烷胺-D4浓度均为1000μg/kg和氯霉素-D5浓度均为400μg/kg)，绘制11种非法添加药物的标准曲线，相关系数均大于0.99(见表2)。该方法中喹乙醇、利巴韦林、金刚烷胺、金刚乙胺、地塞米松、氯霉素、呋喃它酮、呋喃唑酮的检出限为50μg/kg(S/N≥3)，呋喃妥因、呋喃西林、己烯雌酚检出限为100μg/kg(S/N≥3)。

5、回收率与精密度

实验考察了该方法的回收率及精密度，在空白样品中添加3个不同水平(200、1000、5000μg/kg)的11种非法添加药物按实验方法测定回收率，每个水平重复测定6次。结果显示，11种非法添加药物的平均回收率为90.2％～111％，相对标准偏差均小于8.24％(见表3)。

表3方法加标回收率及精密度

实施例2

实际样品分析

实验对白头翁散、止痢散、清瘟败毒散、银翘散、穿心莲散、黄连解毒散、扶正解毒散、消食平胃散、荆防败毒散、公英散、清肺止咳散、五皮散、七补散、桑菊散等35份市售中兽药散剂进行HPLC-MS/MS检测(样品总离子流图见图12和图13所示)，检测结果显示待测中兽药散剂中均未检出11类非法添加药物。

结论

本文采用高效液相色谱串联质谱技术建立了中兽药散剂中11种非法添加药物的分析方法。该方法操作简便快速、灵敏度高、专属性强、重复性好，可以同时测定11种非法添加药物，实现了其高通量分析，可满足中兽药散剂中11种非法添加药物的监控要求。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于测定兽药散剂中11种非法添加药物含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)采用有机溶剂超声提取方法对待测兽药散剂进行预处理，有机溶剂为甲醇-水，甲醇和水的体积比为0.9-1.1:0.9-1.1；

(2)通过液相色谱-串联质谱法对提取液中的喹乙醇、利巴韦林、金刚烷胺、金刚乙胺、地塞米松、氯霉素、己烯雌酚、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林和呋喃唑酮进行检测。

2.根据权利要求1所述的用于测定兽药散剂中11种非法添加药物含量的方法，其特征在于：步骤(1)中，甲醇-水中的甲醇和水的体积比为1:1。

3.根据权利要求1所述的用于测定兽药散剂中11种非法添加药物含量的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述兽药散剂和甲醇-水的比例为(0.4-0.6)g：(4.5-5.5)ml。

4.根据权利要求1所述的用于测定兽药散剂中11种非法添加药物含量的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述超声时间为15-45min；超声的温度为25-35℃。

5.根据权利要求1所述的用于测定兽药散剂中11种非法添加药物含量的方法，其特征在于：步骤(1)中，将超声提取后的溶液进行过滤，有机滤膜的孔径为0.22μm或0.45μm。

6.根据权利要求1所述的用于测定兽药散剂中11种非法添加药物含量的方法，其特征在于：步骤(2)中，液相色谱-串联质谱法的色谱条件为：采用十八烷基健合硅胶柱，流动相由A相和B相组成，A相为水，B相为乙腈，采用梯度洗脱。

7.根据权利要求6所述的用于测定兽药散剂中11种非法添加药物含量的方法，其特征在于：所述C18柱的粒径为5μm，柱内径为2.1mm或4.6mm，柱长为50mm、150mm或250mm；柱温为30℃，进样量：5μL。

8.根据权利要求7所述的用于测定兽药散剂中11种非法添加药物含量的方法，其特征在于：所述C18柱的粒径为5μm，柱内径为2.1mm，柱长为150mm。

9.根据权利要求6或7所述的用于测定兽药散剂中11种非法添加药物含量的方法，其特征在于：

喹乙醇、利巴韦林、金刚烷胺、金刚乙胺、地塞米松、氯霉素、呋喃它酮和呋喃唑酮的检测条件：流速：0.2mL/min；梯度洗脱程序：0-2min，B相保持5％；2-8min，B相从5％升至95％；8.1-10min，B相降至5％；10min后停止；

呋喃妥因、呋喃西林和己烯雌酚的检测条件：流速：0.3mL/min，梯度洗脱程序：0-5min，B相从20％升至50％；5-7min，B相从50％升至95％；7-8min，B相保持95％；8.1-10minB相降至5％；10min后停止。

10.根据权利要求9所述的用于测定兽药散剂中11种非法添加药物含量的方法，其特征在于：步骤(2)中，液相色谱-串联质谱法的质谱条件为：

喹乙醇、利巴韦林、金刚烷胺、金刚乙胺、地塞米松、氯霉素、呋喃它酮和呋喃唑酮的检测条件：离子源：API-ES；毛细管电压：3000V；雾化压力：35psi；干燥气温度：325℃；干燥气流量：10L/min；离子极性：正；质量扫描模式：MRM模式；

呋喃妥因、呋喃西林和己烯雌酚的检测条件：离子源：API-ES；毛细管电压：3000V；雾化压力：30psi；干燥气温度：300℃；干燥气流量：10L/min；离子极性：负；质量扫描模式：MRM模式。