CN103267820A - 一种污泥中多种雌激素的共检测方法 - Google Patents

Abstract

一种污泥中多种雌激素的共检测方法，所述方法为采用加速溶剂萃取-固相萃取-超高效液相-串联质谱联用对污泥中各种雌激素的共检测方法，具体步骤为将采集的污泥样品进行前处理后采用加速溶剂萃取，将雌激素从污泥样品中提取出来，采用固相萃取柱对提取液富集净化，再以含5%氨水的乙腈溶液将雌激素从HLB柱上洗脱下来，得到待测液，结合内标法，采用超高效液相色谱-串联质谱联用对样品中的各种雌激素进行检测。本方法对五种雌激素的检测限低于0.8ng/g，回收率高、灵敏度高、重复性好，且操作简便、节省溶剂，满足污泥中多种痕量存在的雌激素的同时检测。

Description

一种污泥中多种雌激素的共检测方法

技术领域

本发明涉及一种复杂基质固体样品中雌激素的检测技术，特别是涉及采用加速溶剂萃取-固相萃取-超高效液相-串联质谱联用（PLE-SPE-UPLC-MS/MS）对污泥中雌激素的共检测方法。

背景技术

雌激素可产生内分泌干扰作用，引起生物体生殖能力下降及其后代的健康与成活率下降等问题。人与动物卵巢分泌的天然类固醇类雌激素雌酮（E1）、17β-雌二醇（E2）、雌三醇（E3），以及作为口服避孕药主要成分的合成雌激素17α-乙炔基雌二醇（EE2），会随着粪尿排放进入污水处理系统或农田土壤中。双酚A（BPA）是生产聚碳酸酯和环氧树脂等的重要原料，广泛应用于工业中。已有学者对不同样品中雌激素的浓度水平做了研究，主要是液体样品，如污水厂进出水、地表水和尿液等。但对于底泥、污泥等固体样品中雌激素的研究目前还比较少。由于污泥可被用作肥料，雌激素就有可能因此进入到食物链中，因此控制雌激素在污泥中的含量非常重要。污泥中雌激素的含量和很多因素有关，其分析难度大于水相中的雌激素。因此，建立一种回收率高、灵敏度高、重复性好且操作简便的前处理技术和仪器分析技术，用于快速、精确地同时检测污泥中多种痕量存在的雌激素，成为研究的关键。

不同的技术已被用于萃取固体样品中的雌激素，最常见的是超声萃取（USE）。近年来，新兴的萃取技术如加速溶剂萃取（PLE）的使用，可减少萃取时间和溶剂消耗，并且取得更好的回收率。在富集净化方法中，发展最成熟、运用最广泛的是固相萃取技术（SPE），操作简单、重复性好、易于实现自动化等优点。对于雌激素的测定仪器，气相色谱（GC）是一项常用的分离技术，但是需要衍生化步骤。相较于GC，液相色谱（LC）更具有通用性，无需衍生化，因而被广泛的应用在雌激素的检测中。与质谱（MS）或更先进的串联质谱（MS/MS）联用，可极大的降低检测限、排除测定假阳性，无需衍生化，具有灵敏度高、选择性好等优点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对污泥中多种雌激素进行同时定量检测的方法，该方法回收率高、灵敏度高、操作简便、快速、节省溶剂，降低了基质干扰作用，解决了污泥样品基质复杂，雌激素痕量存在，其前处理技术难度大等问题。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：

一种污泥中多种雌激素的共检测方法，所述方法为采用加速溶剂萃取-固相萃取-超高效液相-串联质谱联用对污泥中的多种雌激素进行同时定量检测。

其中，该方法具体包括如下步骤：

（1）对采集的污泥进行前处理，并加入内标物，采用加速溶剂萃取的方式提取污泥中的雌激素，得到雌激素提取液；

（2）将上述提取液稀释后通过固相萃取柱净化后得到待分析样液；

（3）将上述样液浓缩后采用超高效液相色谱-串联质谱进行分析后，得到各种雌激素与内标物峰面积的比值；

配置各种雌激素系列浓度的标准溶液，并在所有标准溶液内加入等量的内标物，采用超高效液相-串联质谱对标准溶液进行分析，以雌激素与内标物峰面积的比值为横坐标，雌激素的浓度为纵坐标，进行回归，得到标准曲线；

将步骤（3）得到的分析数据与标准曲线进行比较，即可得到污泥样品中各种雌激素的浓度。

其中，步骤（1）中所述加速溶剂萃取的萃取溶剂为体积比1:1的甲醇和丙酮混合液。

其中，步骤（1）中所述污泥的前处理是指将采集的污泥进行冷冻干燥、研磨以及筛选处理。

其中，步骤（1）中所述内标物为雌激素的同位素，内标物的加入方式为采用浸泡加标方式，内标物的加入量为1～100ng/g，优选50ng/g。

其中，步骤（2）中所述固相萃取柱在使用前先采用甲醇和超纯水活化。

其中，步骤（2）中所述提取液通过固相萃取柱后，再用含5%氨水的乙腈溶液进行洗脱，最后将洗脱液用定量浓缩仪浓缩。

其中，步骤（3）中所述超高效液相色谱的色谱条件为色谱柱是EclipsePlus-C18色谱柱，流动相A为2mmol/L醋酸铵水溶液，流动相B为甲醇，采用梯度洗脱：0min(10%B)→0.5min(10%B)→7min(80%B)→7.5min(25%B)，流速是0.3ml/min，柱温30℃，进样量为5μL。

其中，步骤（3）中所述串联质谱采用的质谱仪为三重四级杆质谱仪，串联质谱的质谱条件为带有喷射流离子聚焦的电喷雾离子源，负离子模式，干燥气体温度325℃，干燥气流量6L/min，喷雾气压35psi，鞘气温度350℃，鞘气流量9L/min，毛细管电压4000V，喷嘴电压500V，采用多重反应监测模式（MRM），五种雌激素和内标物的MRM参数见表1。

表1雌激素质谱条件

其中，步骤（4）中所述系列标准溶液中内标物的浓度均为1～100μg/L，优选50μg/L。

有益效果：相比于现有技术，本发明的方法采用加速溶剂萃取进行萃取，萃取效率高，操作简便，萃取快速，安全可靠；采用固相萃取进行富集净化，重复性好，易于实现自动化；采用超高效液相-串联质谱联用进行检测，检测限低，灵敏度高，选择性好，无需衍生化；总之，本发明提供的方法检测限低、灵敏度高、重复性好、操作简便且成本低，可以快速分析污泥中多种雌激素的含量。

采用同样的污泥样品，分成等量的三组（1、2、3），分别往（1、2、3）样品中加入已知量各种雌激素，在配置标准溶液时，（1、2、3）三组内标物的加入量分别为20、50、100ng/g，通过本发明的方法测得样品中各种雌激素的浓度，即可得知本发明方法的回收率和检测限。本方法的回收率和检测限如表2所示。

表2本发明方法的回收率和检测限

附图说明

图1为污泥中多种雌激素共检测方法流程图；

图2为雌激素E1、E2、E3、EE2及BPA的标准曲线图；

其中，E1为雌酮、E2为17β-雌二醇、E3为雌三醇、EE2为17α-乙炔基雌二醇、BPA为双酚A；

图3为各雌激素标准样品的超高效液相-串联质谱谱图；

图4为各雌激素实际样品的超高效液相-串联质谱谱图。

具体实施方式

选取江苏南京城北污水处理厂，采集二沉池的的活性污泥，对该污泥中多种雌激素同时进行定量检测，首先将采集的污泥进行冷冻干燥、研磨、再过0.125mm筛，取1g，用浸泡加标的方式加入50ng/g的内标物E2-d₄（此内标物为17β-雌二醇中4个氢被4个氘取代后的物质），将样品在室温下隔夜晾干，采用加速溶剂萃取（PLE）提取污泥中的雌激素，萃取溶剂为体积比为1:1的甲醇和丙酮混合液，萃取温度为100℃，静态萃取时间为10min，循环两次，淋洗体积为60%，吹扫时间为120s，得到20mL的雌激素提取液，然后采用定量浓缩仪将提取液浓缩至1mL左右，再用超纯水稀释至100mL，用盐酸调节提取液的pH=4；接着，将提取液通过固相萃取柱进行富集净化，固相萃取柱在使用前需要用甲醇和超纯水活化，该活化步骤为先用5mL甲醇、再用10mL超纯水以流速3mL/min对固相萃取柱进行活化，固相萃取柱活化后，将提取液以5mL/min过柱，过柱后，用10mL超纯水以3mL/min的流速淋洗，真空干燥30min以去除水分，再用10mL含5%氨水的乙腈溶液以1mL/min的流速洗脱，最后将洗脱液用定量浓缩仪浓缩至1mL，该浓缩液即为待分析样液；最后，将样液采用超高效液相色谱-串联质谱进行分析，得到了各种雌激素与内标物峰面积的比值；用分析天平准确称取各种雌激素，溶于色谱级甲醇中，配置成各种雌激素的系列浓度标准溶液，在所有标准溶液内加入等量的内标物E2-d₄，使内标物的浓度均为50μg/L，采用超高效液相色谱-串联质谱对标准溶液进行分析，以雌激素与内标物峰面积的比值为横坐标，雌激素的浓度为纵坐标，进行回归，得到标准曲线；将得到的各种雌激素与内标物峰面积的比值与标准曲线进行比较，即可得到污泥样品中各种雌激素的浓度，结果如表3所示。

表3实际样品中五种目标雌激素的浓度

注：n.d.表示未检出。

Claims (7)

1.一种污泥中多种雌激素的共检测方法，其特征在于：所述方法为采用加速溶剂萃取-固相萃取-超高效液相-串联质谱联用对污泥中的雌激素进行同时定量检测。

2.根据权利要求1所述的污泥中多种雌激素的共检测方法，其特征在于：该方法具体包括如下步骤：

（1）对采集的污泥进行前处理，并加入内标物，采用加速溶剂萃取的方式提取污泥中的雌激素，得到雌激素提取液；

（2）将上述提取液稀释后通过固相萃取柱净化后得到待分析样液；

（3）将上述样液浓缩后采用超高效液相色谱-串联质谱进行分析，得到各种雌激素与内标物峰面积的比值；

配置各种雌激素系列浓度的标准溶液，并在所有标准溶液内加入等量的内标物，采用超高效液相-串联质谱对标准溶液进行分析，以雌激素与内标物峰面积的比值为横坐标，雌激素的浓度为纵坐标，进行回归，得到标准曲线；

将得到的分析数据与标准曲线进行比较，即可得到污泥样品中各种雌激素的浓度。

3.根据权利要求2所述的污泥中多种雌激素的共检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述加速溶剂萃取的萃取溶剂为体积比1:1的甲醇和丙酮混合液。

4.根据权利要求2所述的污泥中多种雌激素的共检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述污泥的前处理是指将采集的污泥进行冷冻干燥、研磨以及筛选处理。

5.根据权利要求2所述的污泥中多种雌激素的共检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述内标物为雌激素的氘代物，内标物的加入方式为采用浸泡加标方式，内标物的加入量为1～100ng/g。

6.根据权利要求2所述的污泥中多种雌激素的共检测方法，其特征在于：步骤（2）中所述固相萃取柱在使用前先采用甲醇和超纯水活化。

7.根据权利要求2所述的污泥中多种雌激素的共检测方法，其特征在于：步骤（2）中所述提取液通过固相萃取柱后，再用含5%氨水的乙腈溶液洗脱，最后将洗脱液用定量浓缩仪浓缩。

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