CN113237978A - 一种番茄中金刚烷胺和金刚乙胺的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于物质检测技术领域，尤其提供了一种番茄中金刚烷胺和金刚乙胺的检测方法。本发明采用PSA吸附剂、C18吸附剂和无水硫酸镁作为净化的试剂，能够吸附提取液中对目标物有干扰的杂质，解决了基质干扰较严重的技术问题，提高了检测准确度；采用液相色谱串联质谱检测，大大提高检测方法的灵敏度。进一步地，本发明提供的检测方法所用溶剂少，成本低。进一步地，本发明通过进一步限定液相色谱串联质谱检测参数，提高了检测方法的准确度、精密度和灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及物质检测技术领域，尤其涉及一种番茄中金刚烷胺和金刚乙胺的检测方法。
背景技术
金刚烷胺(Amantadine，AMT)是饱和三环癸烷的氨基衍生物，又称金刚烷胺、三环癸胺等，合成于1960年，首先作为抗病毒药使用，是第一个获得FDA批准的抗流感病毒药物。金刚乙胺(Rimantadine，RMT)是将金刚烷胺的氨基用乙胺基代替所得药物，该药作为抗病毒药于1993年被美国批准用于A型流感病毒的预防和治疗。养殖过程中大量使用的金刚烷胺和金刚乙胺大部分随粪尿排出，导致粪尿中抗生素(比如金刚烷胺和金刚乙胺)含量较高。我国养殖废弃物正成为环境中抗生素的重要来源而受到各界的关注。养殖废弃物在综合利用过程中，导致大量抗生素进入地表水，造成河流抗生素污染。土壤中抗生素可被番茄等农作物吸收累积。残留的抗生素被作物吸收后在食物链中发生迁移累积，给生态安全和人类健康带来潜在的风险。文献报道的都是动物源食品中金刚烷胺和金刚乙胺测定方法；测定方法主要包括气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法和液质联用法，上述测定方法灵敏度低。前处理方法多采用SPE固相萃取柱净化法，上述前处理方法操作繁琐、基质干扰大。同时，目前还未见植物源食品尤其是番茄中金刚烷胺和金刚乙胺的残留检测方法的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种番茄中金刚烷胺和金刚乙胺的检测方法。本发明提供的检测方法中的样品前处理方法操作简单，所得待测溶液的基质干扰小；且采用液相色谱串联质谱对待测溶液进行检测，提高了检测灵敏度。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种番茄中金刚烷胺和金刚乙胺的检测方法，包括以下步骤：
将待测番茄样品、D15-金刚烷胺、吸水剂和提取剂混合，进行提取，得到提取液；
将所述提取液进行净化，得到待测溶液；
将所述待测溶液进行液相色谱串联质谱检测，得到待测番茄样品中金刚烷胺和金刚乙胺的含量；
所述净化的试剂包括PSA吸附剂、C18吸附剂和无水硫酸镁。
优选地，所述提取剂为甲酸体积浓度为0.1％的甲酸乙腈溶液。
优选地，所述吸水剂包括氯化钠和/或无水硫酸钠。
优选地，所述待测番茄样品、D15-金刚烷胺、吸水剂和提取剂的用量比为(20～25)g：(5～10)ng：(5～7)g：(40～50)mL。
优选地，所述提取在涡旋震荡的条件下进行，所述涡旋震荡的转速为3000～5000rpm，时间为3～7min。
优选地，所述提取液、PSA吸附剂、C18吸附剂和无水硫酸镁的用量比为(5～10)mL：(100～200)mg：(100～200)mg：(25～50)mg。
优选地，所述净化后，还包括将所得净化体系进行固液分离，对所得上清液进行氮吹后，复溶，得到预溶液；将所述预溶液固液分离，将所得清液过滤，得到待测溶液。
优选地，所述复溶的试剂为体积浓度为20％的乙腈水溶液。
优选地，所述液相色谱串联质谱检测的参数包括液相色谱检测参数和质谱检测参数；所述液相色谱检测参数包括：
色谱柱：UPLC ACQUITY BEH，50×2.1mm，1.7μm或性能相当的色谱柱；
流动相A：乙腈；
流动相B：体积浓度为0.05～0.1％的甲酸水溶液；
洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的程序为：
0～0.5min：5.0％流动相A；
0.5～1.5min：5.0～62％流动相A；
1.5～2.5min：62％流动相A；
2.5～3.5min：62～5％流动相A；
3.0～4.0min：5.0％流动相A；
流速：0.3～0.5mL/min；
柱温：30～40℃；
进样量：2.0～5.0μL。
优选地，所述质谱检测参数包括：
离子源：ESI+；
毛细管电压：3.0～4.0kV；
离子源温度：100～110℃；
脱溶剂气温度：320～350℃；
脱溶剂气流量：800L/h；
锥孔反吹气流量：40～50L/h；
锥孔电压：25～30V；
扫描方式：多反应监测。
本发明提供了一种番茄中金刚烷胺和金刚乙胺的检测方法，包括以下步骤：将待测番茄样品、D15-金刚烷胺、吸水剂和提取剂混合，进行提取，得到提取液；将所述提取液进行净化，得到待测溶液；将所述待测溶液进行液相色谱串联质谱检测，得到待测番茄样品中金刚烷胺和金刚乙胺的含量；所述净化的试剂包括PSA吸附剂、C18吸附剂和无水硫酸镁。
本发明采用PSA吸附剂、C18吸附剂和无水硫酸镁作为净化的试剂，能够吸附提取液中对目标物有干扰的杂质，解决了基质干扰较严重的技术问题，提高了检测准确度；采用液相色谱串联质谱检测，大大提高检测方法的灵敏度。
进一步地，本发明提供的检测方法所用溶剂少，成本低。
进一步地，本发明通过进一步限定液相色谱串联质谱检测的参数，提高了检测方法的准确度、精密度和灵敏度。
附图说明
图1为浓度为5.0ng/mL的金刚烷胺和金刚乙胺的基质标准工作溶液的总离子流图。
具体实施方式
本发明提供了一种番茄中金刚烷胺和金刚乙胺的检测方法，包括以下步骤：
将待测番茄样品、D15-金刚烷胺、吸水剂和提取剂混合，进行提取，得到提取液；
将所述提取液进行净化，得到待测溶液；
将所述待测溶液进行液相色谱串联质谱检测，得到待测番茄样品中金刚烷胺和金刚乙胺的含量。
在本发明中，如无特殊说明，本发明所用原料均优选为市售产品。
本发明将待测番茄样品、D15-金刚烷胺、吸水剂和提取剂混合，进行提取，得到提取液。
在本发明中，所述待测番茄样品在与D15-金刚烷胺、吸水剂和提取剂混合前，优选进行预处理；所述预处理优选包括：将所述番茄样品进行绞碎；本发明对所述绞碎的参数不做具体限定，只要能够将番茄样品打成浆液形式即可。
在本发明中，所述吸水剂优选为氯化钠和/或无水硫酸钠，进一步优选为氯化钠。在本发明中，所述吸水剂能够吸收待测番茄样品中的水分，水分被吸水剂吸收后，形成饱和的盐溶液，以便于提取剂能够充分的提取样品中的目标物。
在本发明中，所述D15-金刚烷胺优选以D15-金刚烷胺溶液的形式使用；所述D15-金刚烷胺溶液的溶剂优选为甲醇；所述D15-金刚烷胺溶液的浓度优选为100ng/mL。
在本发明中，所述提取剂优选为体积浓度为0.1％的甲酸乙腈溶液。
在本发明中，所述待测番茄样品、D15-金刚烷胺、吸水剂和提取剂的用量比为(20～25)g：(5～10)ng：(5～7)g：(40～50)mL，进一步优选为25g：5ng：7g：50mL。
在本发明中，所述提取优选在涡旋震荡的条件下进行，所述涡旋震荡的转速优选为3000～5000rpm，进一步优选为5000rpm；所述涡旋震荡的时间优选为3～7min，进一步优选为3min。
得到提取液后，本发明将所述提取液进行净化，得到待测溶液。
在本发明中，所述净化的试剂包括PSA吸附剂、C18吸附剂和无水硫酸镁。在本发明中，所述PSA吸附剂的粒径优选为30～50μm；所述C18吸附剂的粒径优选为3～4μm；所述无水硫酸镁的粒径优选为30～50μm。本发明对所述PSA吸附剂、C18吸附剂和无水硫酸镁的加入顺序不做具体限定。
在本发明中，所述提取液、PSA吸附剂、C18吸附剂和无水硫酸镁的用量比优选为(5～10)mL：(100～200)mg：(100～200)mg：(25～50)mg，进一步优选为10mL：200mg：200mg：50mg。
在本发明中，所述净化优选在涡旋的条件下进行，所述涡旋的转速优选为4000～5000rpm，进一步优选为5000rpm；时间优选为2～5min，进一步优选为2min。
本发明中，所述净化的试剂可以吸附杂质，吸附对目标物有干扰的杂质。
所述净化后，本发明优选还包括将所得净化体系进行固液分离，对所得上清液进行氮吹后，复溶，得到预溶液；将所述预溶液固液分离，将所得清液过滤，得到待测溶液。
在本发明中，所述固液分离的方式优选为离心，所述离心的转速优选为5000～8000rpm，进一步优选为8000rpm；时间优选为3～5min，进一步优选为5min。
在本发明中，所述氮吹的温度优选为40℃。在本发明中，所述氮吹优选在水浴的条件下进行。
在本发明中，所述复溶的试剂优选为体积浓度为20％的乙腈水溶液。在本发明中，所述复溶的方式优选为涡旋，所述涡旋的转速优选为5000～10000rpm，时间优选为1min。
在本发明中，所述预溶液固液分离的方式优选为离心，所述离心的转速优选为8000rpm，时间优选为5min。
得到待测溶液后，本发明将所述待测溶液进行液相色谱串联质谱检测，得到待测番茄样品中金刚烷胺和金刚乙胺的含量。
在本发明中，所述液相色谱串联质谱检测的参数优选包括液相色谱检测参数和质谱检测参数。在本发明中，所述液相色谱检测参数优选包括：色谱柱：UPLCACQUITYBEH，50×2.1mm，1.7μm或性能相当的色谱柱；
流动相A：乙腈；
流动相B：体积浓度为0.05～0.1％的甲酸水溶液，进一步优选为体积浓度为0.1％的甲酸水溶液；
洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的程序为：
0～0.5min：5.0％流动相A；
0.5～1.5min：5.0～62％流动相A；
1.5～2.5min：62％流动相A；
2.5～3.5min：62～5％流动相A；
3.0～4.0min：5.0％流动相A；
流速：0.3～0.5mL/min，进一步优选为0.3mL/min；
柱温：30～40℃，进一步优选为30℃；
进样量：2.0～5.0μL，进一步优选为5.0μL。
在本发明中，所述质谱检测参数优选包括：
离子源：ESI+；
毛细管电压：3.0～4.0kV，进一步优选为4.0kV；
离子源温度：100～110℃，进一步优选为110℃；
脱溶剂气温度：320～350℃，进一步优选为350℃；
脱溶剂气流量：800L/h；
锥孔反吹气流量：40～50L/h，进一步优选为50L/h；
锥孔电压：25～30V，进一步优选为30V；
扫描方式：多反应监测。
在本发明中，所述多反应监测的离子对信息优选包括：金刚烷胺152.5/134.9，152.5/92.8；金刚乙胺180.2/162.8，180.2/81.0；D15-金刚烷胺167.3/150.3。
下面结合实施例对本发明提供的番茄中金刚烷胺和金刚乙胺的检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
提取：称取25.00g番茄样品于100mL具塞试管中，加100ng/mL的D15-金刚烷胺标准工作液(溶剂为甲醇)50μL，加入7gNaCl和50mL甲酸体积浓度为0.1％的甲酸乙腈溶液，于5000rpm涡旋震荡提取3min，得到提取液。
净化：取10mL提取液加入到预先放置有200mgPSA吸附剂(30～50μm)、200mgC18吸附剂(粒径为3～4μm)和50mg无水硫酸镁(粒径为30～50μm)的50mL离心管中，于5000rpm涡旋2min；然后于8000rpm离心5min，上清液转至100mL鸡心瓶中，40℃水浴下氮气吹干，用2mL体积浓度为20％的乙腈水溶液溶解残渣，于5000rpm涡旋1min复溶，于8000r/min离心5min，取上清液，用有机滤膜过滤，得到待测溶液，供上机测定。
标准工作溶液的配制：分别称取10mg金刚烷胺和金刚乙胺标准品于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，分别得到1.0μg/mL的金刚烷胺和金刚乙胺标准溶液。
基质标准工作溶液的配制：对番茄空白样品按“提取”和“净化”处理后，将“净化”过程中于氮气吹干后的待净化液中分别加入2μL、5μL、10μL、20μL和100μL1.0μg/mL的金刚烷胺和金刚乙胺标准溶液，采用初始流动相(乙腈和体积浓度为0.1％的甲酸水溶液按照体积比5：95的混合液)定容至1.0mL，得到系列浓度(分别为2.00ng/mL、5.00ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、100ng/mL)的金刚烷胺和金刚乙胺的基质标准工作溶液。
将系列金刚烷胺和金刚乙胺的基质标准工作溶液和待测溶液分别进行液相色谱串联质谱检测。
液相色谱串联质谱检测的参数包括液相色谱检测参数和质谱检测参数；
所述液相色谱检测参数包括：
色谱柱：UPLC ACQUITY BEH，50×2.1mm，1.7μm；流动相A：乙腈；流动相B：体积浓度为0.1％的甲酸水溶液；梯度洗脱程序为：0～0.5min：5.0％流动相A；0.5～1.5min：5.0～62％流动相A；1.5～2.5min：62％流动相A；2.5～3.5min：62～5％流动相A；3.0～4.0min：5.0％流动相A；流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：5.0μL。
质谱检测参数包括：
离子源：ESI+；毛细管电压：4.0kV；离子源温度：110℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：800L/h；锥孔反吹气流量50L/h；锥孔电压：30V；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子对信息：金刚烷胺152.5/134.9，152.5/92.8；金刚乙胺180.2/162.8，180.2/81.0；D15-金刚烷胺167.3/150.3。
图1为浓度为5.0ng/mL的金刚烷胺和金刚乙胺的基质标准工作溶液的总离子流图，从图1可以看出：金刚烷胺和金刚乙胺的两种物质得到很好的分离。
1、标准曲线
基于系列金刚烷胺和金刚乙胺的基质标准工作溶液的浓度和峰面积，建立金刚烷胺和金刚乙胺的浓度-峰面积方程，结果分别为：
金刚烷胺的浓度-峰面积方程：y＝112287x-54315，r为0.999。
金刚乙胺的浓度-峰面积方程：y＝92029x-19836，r为0.997。
2、定量限和检出限
基于10倍信噪比，计算金刚烷胺和金刚乙胺的定量限，结果为金刚烷胺和金刚乙胺的定量限均为2.0μg/kg。
基于3倍信噪比，计算金刚烷胺和金刚乙胺的检出限，结果为金刚烷胺和金刚乙胺的检出限均为1.0μg/kg。
3、准确度和精密度试验
在不含有金刚烷胺和金刚乙胺的番茄样品中添加三个不同含量水平的金刚烷胺和金刚乙胺标准溶液，然后按照上述提取和净化过程来分析添加后的样品中金刚烷胺和金刚乙胺的含量水平。
结果如表1所示。
表1准确度和精密度试验结果(n＝5)
从表1可以看出：金刚烷胺所得添加回收率为91.0％～98.5％，RSD为1.77％～3.05％；金刚乙胺所得添加回收率为89.0％～98.2％，RSD为0.13％～1.89％。表明该检测方法具有良好的准确度和精密度。
4、实际样品的检测
取60批次不同番茄样品按照“提取”和“净化”，得到待测溶液，采用液相色谱串联质谱检测的参数进行检测，结果为：5份番茄样品中检测到金刚烷胺，最大含量为5.3μg/kg；2份番茄样品中检测到金刚乙胺，最大含量为2.0μg/kg，53份番茄样品中未检出。
5、提取剂优化
分别采用乙腈、甲酸体积浓度为0.1％的甲酸乙腈溶液和体积浓度为0.1％的乙酸乙腈溶液作为提取剂，按照“提取”的步骤进行处理，得到提取溶液。
按照公式1计算提取液中金刚烷胺和金刚乙胺的提取率：
公式1中：
W-----待测样品中金刚烷胺和金刚乙胺的含量，(μg/kg)；
M-----试样溶液中金刚烷胺和金刚乙胺的浓度，单位为(ng/mL)；
m-----供试试样的质量，单位为g；
V1------提取溶液体积；单位为mL；
V2------分取溶液体积；单位为mL；
V------定容体积；单位为mL。
具体到本实施例中，M为待测溶液中金刚烷胺和金刚乙胺的浓度，单位为(ng/mL)；m为供试试样的质量，为25.00g；V1为提取液体积，50mL；V2为分取溶液体积，10mL；V为定容体积，2mL。
结果为：乙腈提取剂对金刚烷胺的提取效率为75.8％，对金刚乙胺的提取效率为78.2％；甲酸体积浓度为0.1％的甲酸乙腈溶液提取剂对金刚烷胺的提取效率为92.3％，对金刚乙胺的提取效率为93.0％；乙酸体积浓度为0.1％的乙酸乙腈溶液提取剂对金刚烷胺的提取效率为82.8％，对金刚乙胺的提取效率为83.9％。综上，选择甲酸体积浓度为0.1％的甲酸乙腈溶液作为提取剂。
6、净化的试剂的优化
分别采用酸性氧化铝、弗罗里硅土和PSA吸附剂、C18吸附剂和无水硫酸镁作为净化的试剂，对以甲酸体积浓度为0.1％的甲酸乙腈溶液为提取剂所得提取液进行净化，得到待测溶液。
结果为：以酸性氧化铝为净化的试剂，得到的待测溶液的杂峰数量为3；以弗罗里硅土为净化的试剂，得到的待测溶液的杂峰数量为4；采用PSA吸附剂、C18吸附剂和无水硫酸镁作为净化的试剂得到的待测溶液的杂峰数量少，即干扰少，因此选用PSA吸附剂、C18吸附剂和无水硫酸镁作为净化的试剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种番茄中金刚烷胺和金刚乙胺的检测方法，包括以下步骤：
将待测番茄样品、D15-金刚烷胺、吸水剂和提取剂混合，进行提取，得到提取液；
将所述提取液进行净化，得到待测溶液；
将所述待测溶液进行液相色谱串联质谱检测，得到待测番茄样品中金刚烷胺和金刚乙胺的含量；
所述净化的试剂包括PSA吸附剂、C18吸附剂和无水硫酸镁。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述提取剂为甲酸体积浓度为0.1％的甲酸乙腈溶液。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述吸水剂包括氯化钠和/或无水硫酸钠。
4.根据权利要求1或2或3所述的检测方法，其特征在于，所述待测番茄样品、D15-金刚烷胺、吸水剂和提取剂的用量比为(20～25)g：(5～10)ng：(5～7)g：(40～50)mL。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述提取在涡旋震荡的条件下进行，所述涡旋震荡的转速为3000～5000rpm，时间为3～7min。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述提取液、PSA吸附剂、C18吸附剂和无水硫酸镁的用量比为(5～10)mL：(100～200)mg：(100～200)mg：(25～50)mg。
7.根据权利要求1或6所述的检测方法，其特征在于，所述净化后，还包括将所得净化体系进行固液分离，对所得上清液进行氮吹后，复溶，得到预溶液；将所述预溶液固液分离，将所得清液过滤，得到待测溶液。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述复溶的试剂为体积浓度为20％的乙腈水溶液。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱检测的参数包括液相色谱检测参数和质谱检测参数；所述液相色谱检测参数包括：
色谱柱：UPLCACQUITYBEH，50×2.1mm，1.7μm或性能相当的色谱柱；
流动相A：乙腈；
流动相B：体积浓度为0.05～0.1％的甲酸水溶液；
洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的程序为：
0～0.5min：5.0％流动相A；
0.5～1.5min：5.0～62％流动相A；
1.5～2.5min：62％流动相A；
2.5～3.5min：62～5％流动相A；
3.0～4.0min：5.0％流动相A；
流速：0.3～0.5mL/min；
柱温：30～40℃；
进样量：2.0～5.0μL。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述质谱检测参数包括：
离子源：ESI+；
毛细管电压：3.0～4.0kV；
离子源温度：100～110℃；
脱溶剂气温度：320～350℃；
脱溶剂气流量：800L/h；
锥孔反吹气流量：40～50L/h；
锥孔电压：25～30V；
扫描方式：多反应监测。
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