CN117169390B - 一种测定血液中安妥的方法、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定血液中安妥的方法、试剂盒及应用，属于血药浓度测定技术领域，所述测定血液中安妥的方法，包括以下步骤：血液样品与乙腈混合，震荡提取，与分散固相萃取剂和除水剂混合，涡旋振荡，过滤，得血液预处理样品；配制系列浓度的安妥标准工作溶液；进行液相色谱串联质谱法检测；所述分散固相萃取剂为PSA吸附剂、EMREMR‑lipid吸附剂和PLS吸附剂的混合物，所述除水剂为无水硫酸镁和无水硫酸钠的混合物。本发明通过优化分散固相萃取、样品预处理和LC‑MS/MS检测条件，建立快速、准确的分散固相萃取‑LC‑MS/MS法测定血液样品中安妥药物的新方法。

Description

一种测定血液中安妥的方法、试剂盒及应用

技术领域

本发明属于血药浓度测定技术领域，尤其涉及一种测定血液中安妥的方法、试剂盒及应用。

背景技术

安妥，化学名为1-萘基硫脲，又名α-萘硫脲，化学性质稳定，不易变质，是一种硫脲类急性杀鼠剂，选择性强，主要用于防治褐家鼠及黄毛鼠，对其他鼠种毒性较低。但因安妥而发生的中毒事件仍然时有发生。目前安妥的快速检测方法主要是利用双溴苯醌氯酰亚胺或碘化铋钾显色反应进行检测，但检出限高，容易出现假阳性结果，结构相近的有机硫类鼠药会有相似的显色。也有报道采用QuEChERS净化包(含MgSO₄、PSA和C18)进行净化，气质联用法进行测定，但因安妥沸点较高，气化困难，检测灵敏度低。液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)是目前理想的血药浓度测定方法，但生物样品处理和净化方法是各实验室之间血药含量测定质量控制的主要难点。目前样品预处理主要有液液萃取法(LLE)、固相萃取法(SPE)、柱切换法和分散固相萃取法(d-SPE)等。液液萃取法和固相萃取法较为普及，但液液萃取法有机试剂使用量大，污染环境。固相萃取法所使用的固相萃取小柱成本高，并且操作人员的熟练程度较大程度地影响实验室间的精密度。柱切换法目前预处理柱填料比较单一，使用有局限性。分散固相萃取法(d-SPE)在血液提取和净化中也有较多的应用(金米聪等，一种测定血液中苯巴比妥的方法、试验盒及应用，ZL202010091510.X)，但由于待测目标物化学性质的差异，针对特定的目标化合物必须根据其化学性质进行分散固相萃取填料类型、重量比等萃取净化条件的特异性优化，才能获得具有实验室间比对试验质量控制良好的检测方法。目前已见有公开报道的血液中安妥含量的液相色谱-串联质谱联用法(LC-MS/MS)(蔡欣欣等，超高效液相色谱三重四极杆质谱法同时快速测定血浆和尿液中11种杀鼠剂，分析化学，2010，38(10)：1411-1416)测定，经实践证实，方法存在灵敏度偏低，生物检材用量大，分析时间长或样品预处理操作繁琐等缺点，因此难以满足临床和司法鉴定对于血液中安妥含量的灵敏、简单、快速、准确的检测需求。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出了一种测定血液中安妥的方法、试剂盒及应用，通过优化分散固相萃取、样品预处理条件和LC-MS/MS检测条件，建立快速、准确、绿色的分散固相萃取-液相色谱串联质谱法测定血液样品中安妥药物的新方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种测定血液中安妥的方法，包括以下步骤：

血液样品与乙腈混合，震荡提取，得提取液；将所述提取液与分散固相萃取剂和除水剂混合，涡旋振荡，过滤，得血液预处理样品；

配制系列浓度的安妥标准工作溶液；

液相色谱采用乙腈-甲酸水溶液作为流动相，质谱采用负离子电喷雾离子化的多反应监测，对所述血液预处理样品进行LC-MS/MS检测；

所述分散固相萃取剂为PSA吸附剂、EMR-lipid吸附剂和PLS吸附剂的混合物，所述除水剂为无水硫酸镁和无水硫酸钠的混合物。

优选的，所述血液样品为血浆或血清，所述血液样品与乙腈的混合体积比为1:2，所述震荡提取的时间为5min。

优选的，所述分散固相萃取剂用量和除水剂用量以血液样品计量，所述血液样品与分散固相萃取剂的比例为1mL：(5～10mg)，所述血液样品与除水剂的比例为1mL：(250～500mg)；所述分散固相萃取剂中PSA吸附剂：EMR-lipid吸附剂：PLS吸附剂的质量比为1:0.5:1，所述除水剂中无水硫酸镁：无水硫酸钠的质量比为4:1。

优选的，所述涡旋振荡的时间为5min。

优选的，所述过滤采用滤膜，所述滤膜的孔径为0.22μm。

优选的，所述配制系列浓度的安妥标准工作溶液，包括以下步骤：

采用1.0mg/mL安妥标准储备液，以乙腈为稀释液配制8个梯度，分别为0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0μg/L。

优选的，所述液相色谱条件为：流动相A：体积比30:70的乙腈-0.1％甲酸水溶液；色谱柱：Shim-packXR-ODSⅢ；流速：300μL/min；进样量：5μL；

所述质谱条件为：采用负离子电喷雾离子化；定量检测方式：多反应监测模式；气帘气压力：20psi；碰撞气压力：7psi；雾化气压力：50psi；辅助气压力：50psi；去簇电压：-60V；入口电压：-15V；碰撞能量：-20eV；碰撞室出口电压：-15V；离子喷雾电压：-5000V；离子源温度：600℃。

本发明还提供了一种应用上述方法测定血液中安妥的试剂盒，包括不同浓度的安妥标准溶液、乙腈、分散固相萃取剂、除水剂、体积比为10:90的甲酸水溶液、乙腈和10％甲酸体积比为4:1溶液、体积比30:70的乙腈-0.1％甲酸水溶液以及质控品；

所述分散固相萃取剂为PSA吸附剂、EMR-lipid吸附剂和PLS吸附剂的混合物，所述除水剂为无水硫酸镁和无水硫酸钠的混合物。

优选的，所述质控品由空白血浆添加安妥标准物质制得，所述质控品含有低、中、高三个浓度水平的质控血浆，其浓度分别与标准溶液八个梯度中第一、第四和第七个梯度浓度相一致，并通过检测确定靶值。

本发明还提供了所述测定血液中安妥的方法或所述测定血液中安妥的试剂盒在检测安妥含量中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

本发明所述测定血液中安妥的方法采用分散固相萃取法，以PSA吸附剂、EMR-lipid吸附剂和PLS吸附剂为分散固相萃取剂除去血液中的杂质，无水硫酸镁和无水硫酸钠为除水剂除去血液中的水分，降低基质对测定的影响，通过优化分散固相萃取、样品预处理条件和LC-MS/MS检测条件，建立快速、准确、绿色的分散固相萃取LC-MS/MS法测定血液样品中安妥药物的新方法，并取得了较为满意的结果。

本发明通过对样品预处理方法和LC-MS/MS条件的优化，建立了一种检测血液样品中安妥的方法。本发明中使用的样品预处理方法，比用乙腈直接提取血液中的安妥更加高效，且操作简便，并能有效沉淀蛋白，基本上可完全消除基质效应。LC-MS/MS测定，快速准确，结果客观易于分析，可对中毒病人血液中安妥的含量变化进行实时监测，可为安妥类杀鼠剂药物中毒的临床诊断治疗提供科学的依据。

本发明的方法分别选择一对定性离子(安妥：m/z 202.9→m/z 186.0)和一对定量离子(安妥：m/z 202.9→m/z 144.1)，以其相对保留时间和定性离子对作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量。同时，本发明所述方法应用三个水平的质控品考察方法的准确性、有效性，避免检测结果失真。

本发明实现了应用LC-MS/MS技术对血液样本中的安妥精确检测的目的，用两对离子分别进行定量和定性保证了检测物的特异性，降低了干扰物影响，该方法操作简便快速，通量高成本低，有效检测临床中毒病人体内的安妥药物水平，对安妥药物的中毒的临床诊断治疗具有重要的指导意义，易于临床推广及普及。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例2中安妥在Waters BEH C18(100mm×2.1mm i.d.,1.7μm)色谱柱中的分离色谱图；

图2为实施例2中安妥在Waters Premier BEH C18(100mm×2.1mm i.d.,1.7μm)色谱柱中的分离色谱图；

图3为实施例2中安妥在HSS T3(100mm×2.1mm i.d.,1.8μm)色谱柱中的分离色谱图；

图4为实施例2中安妥在Shim-pack XR-ODSⅡ(75mm×2.0mm i.d.,1.6μm)色谱柱中的分离色谱图；

图5为实施例2中安妥在Shim-pack XR-ODSⅢ(75mm×2.0mm i.d.,1.6μm)色谱柱中的分离色谱图；

图6为实施例2中安妥在Agela Technologies Venusil MP C18(150mm×2.1mmi.d.,3.0μm)色谱柱中的分离色谱图；

图7为实施例2中安妥在Agilent HILIC Plus(100mm×4.6mm i.d.,3.5μm)色谱柱中的分离色谱图；

图8为实施例2中安妥在流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液体积比为10:90的响应值色谱图；

图9为实施例2中安妥在流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液体积比为20:80的响应值色谱图；

图10为实施例2中安妥在流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液体积比为30:70的响应值色谱图；

图11为实施例2中安妥在流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液体积比为40:60的响应值色谱图；

图12为实施例3中安妥在不同离子喷雾电压下的质谱响应强度；

图13为实施例3中安妥在不同离子源温度时的质谱响应强度。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明中所述的“份”如无特别说明，均按质量份计。

本发明实施例所涉及到的试剂和材料及实验仪器如下：

A.试剂和材料

安妥标准储备液(1.0mg/L，坛墨质检标准物质中心)，空白血浆(取自宁波某三甲医院)，乙腈、甲醇(LC/MS级，赛默飞世尔科技有限公司)，乙酸铵(HPLC级，德国默克公司)，氨水(HPLC级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，蒸馏水(屈臣氏集团有限公司)，甲酸(HPLC级，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，PSA吸附剂(N-丙基乙二胺，粒径40-50μm，英芮诚生化科技有限公司)，PLS吸附剂(吡咯烷酮-苯乙烯聚合物，Pyrolidone link styrolbeads，粒径40-50μm，苏州英芮诚生化科技有限公司)，石墨烯(粒径400-500nm，英芮诚生化科技有限公司)，C18吸附剂(粒径10μm，北京迪马科技有限公司)，EMR-lipid吸附剂(增强型脂质去除吸附剂，EnhancedMatrix Removal-lipid，Bond Elut EMR-Lipid增强型脂质去除剂，安捷伦科技(中国)有限公司)，无水硫酸镁、无水硫酸钠、氯化钠(AR，国药集团化学试剂有限公司)，滤头(0.22μm，浙江哈迈科技有限公司)，一次性注射器(常州悦康医疗器材有限公司)，10mL聚丙烯离心管(浙江拱东医疗科技有限公司)。

B.实验仪器

UFLCXR超快速液相色谱仪带100位自动进样器(日本岛津公司)、AB6500液相色谱-串联质谱联用仪(美国AB Sciex公司)带电喷雾电离源、DIGITALVORTEX-涡旋混合器(美国Sigma公司)、XS205型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多集团公司)、3-30K型冷冻离心机(美国Sigma公司)。

实施例1

血液样品中安妥含量的测定

1.1标准储备液的配制

准确吸取安妥标准储备液(1.0mg/L)100μL于2mL容量瓶中，乙腈定容，配制成50.0μg/L的标准储备液。

1.2标准溶液系列的配制

准确吸取安妥标准储备液(50.0μg/L)，配制成浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0μg/L的标准溶液系列。

1.3色谱条件

色谱柱：Shim-pack XR-ODSⅢ(75mm×2.0mm i.d.,1.6μm)；流速：300μL/min；柱温：40℃；流动相：乙腈-0.1％甲酸水溶液(30:70，V/V)；进样体积：5μL。

1.4质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)，负离子模式；定量检测方式：多反应监测模式(MRM)；气帘气压力：20psi；碰撞气压力：7psi；雾化气压力：50psi；辅助气压力：50psi；去簇电压：-60V；入口电压：-15V；碰撞能量：-20eV；碰撞室出口电压：-15V；离子喷雾电压：-5000V；离子源温度：650℃；定量离子对和定性离子对分别为m/z 202.9→m/z 144.1和m/z 202.9→m/z186.0。

1.5样品测定

取1.0mL血浆样品至10mL聚丙烯离心管中，加入2mL乙腈振荡提取5min，8000r/min离心5min，取上清加至含5mgPSA、EMR和PLS的混合物和500mg无水硫酸镁和无水硫酸钠的混合物的10mL新离心管中，涡旋振荡5min，8000r/min离心5min，取上清，0.22μm滤膜过滤后进样，LC-MS/MS检测。

实施例2

色谱条件的选择

2.1色谱柱的选择

本发明试验了7种不同公司生产的C18色谱柱，分别是Waters BEH C18柱(100mm×2.1mm i.d.,1.7μm)，Waters Premier BEH C18柱(100mm×2.1mm i.d.,1.7μm)，HSS T3柱(100mm×2.1mm i.d.,1.8μm)，Shim-pack XR-ODSⅡ柱(75mm×2.0mm i.d.,1.6μm)，Shim-pack XR-ODSⅢ柱(75mm×2.0mm i.d.,1.6μm)，Agela Technologies Venusil MP C18柱(150mm×2.1mm i.d.,3.0μm)，Agilent HILIC Plus柱(100mm×4.6mm i.d.,3.5μm)对安妥药物的分离影响。安妥在7根色谱柱中的色谱图如图1所示，结果表明：Shim-pack XR-ODSⅢ柱(75mm×2.0mm i.d.,1.6μm)响应值最高，分离效果较好。结合综合情况，选择Shim-packXR-ODSⅢ柱(75mm×2.0mm i.d.,1.6μm)。

2.2流动相的选择

本发明试验了不同种类流动相对安妥色谱分离的影响，主要采用7种流动相进行了试验(乙腈-水、乙腈-0.1％甲酸水溶液、乙腈-5mM乙酸铵水溶液、乙腈-5mM乙酸铵-0.1％甲酸水溶液、乙腈-0.2％氨水、甲醇-水、甲醇-0.1％甲酸水溶液)。结果表明：乙腈-0.1％甲酸水溶液体系的响应值最高，峰形较好，结合综合情况选择乙腈-0.1％甲酸水溶液。同时试验了不同体积比(10:90、20:80、30:70、40:60)乙腈-0.1％甲酸水溶液对色谱分离和灵敏度等的影响。图8～11为4种不同比例的流动相进行分离时的安妥药物色谱图，结果表明：流动相比例为30:70时，总体出峰时间最为合适，效果更佳，结合综合情况选择流动相乙腈-0.1％甲酸水溶液体积比为30:70。

实施例3

质谱条件的选择

3.1离子喷雾电压的选择

本发明试验了不同离子喷雾电压对各目标化合物的响应情况，主要试验以下各电压：-2500、-3500、-4500、-5000、-5500V，结果见图12，表明离子喷雾电压为-5000V时效果最佳。

3.2离子源温度的选择

本发明试验了不同离子源温度对各目标化合物的响应情况，主要对以下6种离子源温度进行选择：300、400、500、600、650、700℃，结果见图13，表明离子源温度为600℃时总体效果更佳。

实施例4

分散固相萃取条件的选择

4.1分散固相萃取剂的选择

本发明试验了不同分散固相萃取剂对血浆基质的吸附情况，主要对以下5种吸附剂进行选择：PSA吸附剂、PLS吸附剂、石墨烯、C18吸附剂和EMR-lipid吸附剂。不同类型的吸附剂对安妥吸附净化回收率和基质效应的影响，基质效应的计算公式如下：基质效应＝[(样品曲线的斜率/标准曲线的斜率)-1]×100％。加标回收率的计算公式如下：加标回收率＝(加标试样测定值-试样测定值)/加标量×100％。结果如下表1所示。结果表明：PSA吸附剂、PLS吸附剂、C18吸附剂和EMR-lipid吸附剂具有较好的吸附效果，但存在一定的基质抑基效应；石墨烯也有较好的吸附效果，基质抑基较低，但共吸附现象比较明显，回收率偏低；当采用PSA吸附剂：PLS吸附剂(质量比1：1)、PSA吸附剂：C18吸附剂：PLS吸附剂(质量比1：0.5：1)混合吸附剂时，回收率也不是十分理想，而且有一定的基质抑基效应；当选用PSA吸附剂：EMR-lipid吸附剂：PLS吸附剂(质量比1：0.5：1)混合吸附剂作为分散固相萃取剂时，回收率和基质效应评价数据均符合方法建立的要求。结合综合情况选择重量比为1：0.5：1的PSA吸附剂/EMR-lipid吸附剂/PLS吸附剂混合物。

表1不同类型的吸附剂对安妥吸附净化回收率和基质效应的影响

注：EMR-lipid吸附剂简称EMR，PSA吸附剂简称PSA，PLS吸附剂简称PLS，C18吸附剂简称C18。

4.2分散固相萃取剂用量的选择

本发明试验了不同用量分散固相萃取剂对样品净化效果的影响，主要对以下4种用量进行选择：5、10、20、30mg。不同用量的质量比为1：0.5：1的PSA吸附剂、EMR-lipid吸附剂和PLS吸附剂的混合物对血液中安妥吸附净化回收率的影响如下表2所示，结果表明选择PSA吸附剂、EMR-lipid吸附剂和PLS吸附剂混合物作为分散固相萃取剂，用量为5mg时回收率较高。

表2不同用量分散固相萃取剂对血液中安妥吸附净化回收率的影响

4.3除水剂的选择

本发明试验了不同除水剂的吸水情况，主要对以下4种除水剂进行选择：无水硫酸镁、无水硫酸钠、氯化钠、无水硫酸镁和无水硫酸钠的混合物(质量比为4：1)。不同类型的除水剂对安妥吸附净化回收率的影响如下表3所示，结果显示：无水硫酸钠的回收率最高，为122.4％，说明仅采用无水硫酸钠时，具有较大的基质增强效应；当选择质量比为4：1的无水硫酸镁和无水硫酸钠的混合物为除水剂时，回收率为97.4％，结果较为理想。

表3不同类型的除水剂对安妥吸附净化回收率的影响

4.4除水剂用量的选择

本发明试验了不同用量的无水硫酸镁和无水硫酸钠混合物(质量比为4：1)作为除水剂的吸水情况，主要对以下6种用量的除水剂进行选择：100、200、300、400、500、600mg。不同用量的除水剂对安妥吸附净化回收率的影响如下表4所示，结果显示：选择500mg除水剂较为合适。

表4不同用量的除水剂对安妥吸附净化回收率的影响

除水剂用量(mg)	回收率(％)
		100	110.4
200	107.2
		300	110.4
400	104.3
		500	101.6
600	93.7

4.5滤膜的选择

本发明试验了不同厂家或材质的滤膜的过滤情况，主要对以下4种滤膜进行选择：HAMAG Technologies PTFE膜(0.22μm)、ANPELPTFE膜(0.22μm)、ANPELAcrodisc GHP膜(0.22μm)、CHROMSPEC NYL膜(0.22μm)。不同滤膜对安妥吸附净化回收率的影响如下表5所示，结果显示：HAMAG Technologies PTFE膜(0.22μm)回收率最高，更适合用于过滤。

表5不同滤膜对安妥吸附净化回收率的影响

滤膜类型	回收率(％)
		HAMAG Technologies PTFE膜(0.22μm)	98.9
ANPEL PTFE膜(0.22μm)	94.3
		ANPEL Acrodisc GHP膜(0.22μm)	80.5
CHROMSPEC NYL膜(0.22μm)	95.6

实施例5

方法的线性方法、相关系数和检出限

准确吸取一定量的混合标准储备液(50.0μg/L)，配制成浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0μg/L的标准溶液系列，按照优化后的色谱和质谱条件进样进行LC-MS/MS分析，获得不同质量浓度下安妥的峰面积，以峰面积(y)对质量浓度(x，μg/L)进行线性回归，回归方程为y＝1.428×10⁵x+1.226×10³。该方法线性良好，相关系数(r)为0.9999，以信噪比3：1时相应的浓度为检出限，检出限为0.015μg/L，以信噪比10：1时相应的浓度为定量检出限，定量检出限为0.05μg/L。

实施例6

方法的回收率和精密度

采用低、中、高三个浓度水平(0.05、1.0、50.0μg/L)的质控血浆，按优化后的条件处理，进样分析，得到其回收率为85.3％～96.4％。采用低、中、高三个浓度水平(0.05、1.0、50.0μg/L)的质控血浆，按本发明的样品处理和测定方法平行测定6次，得到其日内精密度为4.2～5.6％。

实施例7

方法的实验室间比对试验

采用低、中、高三个浓度水平(0.05、1.0、50.0μg/L)的质控血浆，分别分发给5家具有检测条件的实验室在3天内采用5种不同的分散固相萃取剂(其它测定条件均与本发明一致)进行血浆中安妥含量的6次重复检测，结果见下表6，由表6可知采用本发明方法，5家实验室的低、中、高三个质控品的测定值偏离质控理论值最小，相对偏差较小，精密度也最好。

表6不同实验室在3天内进行血浆中安妥含量的重复检测结果

注：EMR-lipid吸附剂简称EMR，PSA吸附剂简称PSA，PLS吸附剂简称PLS，C18吸附剂简称C18。

本发明建立了血液中安妥药物的分散固相萃取-液相色谱串联质谱测定方法。综合上述实验，最终安妥试样以5mg PSA吸附剂、EMR-lipid吸附剂和PLS吸附剂的混合物为分散固相萃取剂，500mg无水硫酸镁和无水硫酸钠混合物为除水剂，在Shim-pack XR-ODSⅢ(75mm×2.0mm i.d.,1.6μm)色谱柱上，以乙腈-0.1％甲酸水(30:70，V/V)为流动相分离，电喷雾负离子模式下多反应监测模式(MRM)定量测定。本发明建立的方法快速简便，稳定性好，回收率高，实验室间比对试验质量控制结果满意，可用于血液中安妥药物的临床快速检测。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种测定血液中安妥的方法，其特征在于：包括以下步骤：

血液样品与乙腈混合，震荡提取，得提取液；将所述提取液与分散固相萃取剂和除水剂混合，涡旋振荡，过滤，得血液预处理样品；

配制系列浓度的安妥标准工作溶液；

液相色谱采用乙腈-甲酸水溶液作为流动相，质谱采用负离子电喷雾离子化的多反应监测，对所述血液预处理样品进行LC-MS/MS检测；

所述分散固相萃取剂为PSA吸附剂、EMR-lipid吸附剂和PLS吸附剂的混合物，所述除水剂为无水硫酸镁和无水硫酸钠的混合物；

所述分散固相萃取剂用量和除水剂用量以血液样品计量，所述血液样品与分散固相萃取剂的比例为1mL：（5~10mg），所述血液样品与除水剂的比例为1mL：（250~500mg）；所述分散固相萃取剂中PSA吸附剂：EMR-lipid吸附剂：PLS吸附剂的质量比为1:0.5:1，所述除水剂中无水硫酸镁：无水硫酸钠的质量比为4:1；

所述液相色谱条件为：流动相：体积比30:70的乙腈-0.1%甲酸水溶液；色谱柱：C18色谱柱。

2.根据权利要求1所述的一种测定血液中安妥的方法，其特征在于：所述血液样品为血浆或血清，所述血液样品与乙腈的混合体积比为1:2，所述震荡提取的时间为5min。

3.根据权利要求1所述的一种测定血液中安妥的方法，其特征在于：所述涡旋振荡的时间为5min。

4.根据权利要求1所述的一种测定血液中安妥的方法，其特征在于：所述过滤采用滤膜，所述滤膜的孔径为0.22μm。

5.根据权利要求1所述的一种测定血液中安妥的方法，其特征在于：所述配制系列浓度的安妥标准工作溶液，包括以下步骤：

采用1.0mg/mL安妥标准储备液，以乙腈为稀释液配制8个梯度，分别为0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0μg/L。

6.根据权利要求1所述的一种测定血液中安妥的方法，其特征在于：所述液相色谱条件为：色谱柱：Shim-pack XR-ODS Ⅲ；流速：300μL/min；进样量：5μL；

所述质谱条件为：采用负离子电喷雾离子化；定量检测方式：多反应监测模式；气帘气压力：20psi；碰撞气压力：7psi；雾化气压力：50psi；辅助气压力：50psi；去簇电压：-60V；入口电压：-15V；碰撞能量：-20eV；碰撞室出口电压：-15V；离子喷雾电压：-5000V；离子源温度：600℃；安妥的定量离子对为m/z 202.9→m/z 144.1。

7.一种应用权利要求1~6任一项所述方法测定血液中安妥的试剂盒，其特征在于：包括不同浓度的安妥标准溶液、乙腈、分散固相萃取剂、除水剂、体积比为10:90的甲酸水溶液、乙腈和10％甲酸体积比为4:1溶液、体积比30:70的乙腈-0.1%甲酸水溶液以及质控品；

所述分散固相萃取剂为PSA吸附剂、EMR-lipid吸附剂和PLS吸附剂的混合物，所述除水剂为无水硫酸镁和无水硫酸钠的混合物。

8.根据权利要求7所述测定血液中安妥的试剂盒，其特征在于：所述质控品由空白血浆添加安妥标准物质制得，所述质控品含有低、中、高三个浓度水平的质控血浆，其浓度分别与标准溶液八个梯度中第一、第四和第七个梯度浓度相一致，并通过检测确定靶值。

9.一种权利要求1~6任一项所述测定血液中安妥的方法或权利要求7或8所述测定血液中安妥的试剂盒在检测安妥含量中的应用。