CN112526048A

CN112526048A - 一种快速检测环境沉积物中高血压药物痕量残留的方法

Info

Publication number: CN112526048A
Application number: CN202011338545.5A
Authority: CN
Inventors: 姚理; 马艳芳; 周漪波; 窦文渊; 石燕丽; 姚智锴; 巫培山; 段星春
Original assignee: Guangdong Institute Of Analysis (china National Analytical Center Guangzhou)
Current assignee: Guangdong Institute Of Analysis (china National Analytical Center Guangzhou)
Priority date: 2020-11-25
Filing date: 2020-11-25
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2040-11-25
Also published as: CN112526048B

Abstract

本发明公开了一种快速检测环境沉积物中高血压药物痕量残留的方法。该方法，包括如下步骤：(1)样品前处理：向沉积物样品中加入微生物抑制剂，冷冻干燥，得到前处理后的样品；(2)提取：向样品中依次加入内标溶液、高纯水、乙腈和盐析试剂，手摇震荡提取，离心后取上清液，加入分散固相萃取试剂，手摇震荡净化，离心后取上清液浓缩，用甲醇重新定容混合均匀，过微孔滤膜，转移至进样小瓶，得到待测样品溶液；(3)配制标准工作溶液；(4)超高效液相色谱‑三重四级杆串联质谱仪检测。本发明提出的方法灵敏度高，针对性强，简单快速，能够准确定量环境沉积物中的痕量高血压药物，为高血压药物的环境含量调查和风险评估提供方法支持。

Description

一种快速检测环境沉积物中高血压药物痕量残留的方法

技术领域

本发明涉及环境分析技术领域，具体涉及一种快速检测环境沉积物中高血压药物痕量残留的方法。

背景技术

高血压是一种常见的心血管疾病，近年来发病人数持续增加，据推算，中国现有高血压病患人数约2.45亿(胡盛寿等，《中国心血管病报告2018》概要。中国循环杂志，2019,34(03),209-220.)。血压控制不好会引起高血压肾病、心脏病以及心脑血管动脉硬化等疾病，因此高血压患者需要长期服用药物维持血压稳定。美托洛尔、普萘洛尔、阿替洛尔、厄贝沙坦和硝苯地平是5种常用的高血压药物，通过阻滞β受体、抑制血管紧张素受体或阻滞钙离子内流达到降低血压的作用，基本信息如表1所示。

表1 5种高血压药物的基本信息

许多高血压药物并不能完全被人体吸收代谢，而是随排泄物进入城市污水处理系统或直接排入乡村水体，不能被城市污水处理厂处理完全的部分最终随污水厂出水持续排入受纳水环境，并通过食物链传递在各级水生生物体内累积。研究表明，痕量浓度水平的高血压药物就能对水生生物造成生殖和发育毒性，其潜在风险不容忽视。

目前有关高血压药物检测方法研究主要关注的环境介质是水，对于它们在沉积物中的检测方法研究较少。已报道的检测方法一般采用超声萃取或者加速溶剂萃取，并通过固相萃取进一步净化，这些方法需要借助专门的提取和净化设备，流程繁琐。由于沉积物作为有机物的储存库是环境水体的重要组成部分，进入水环境中的高血压药物能够被沉积物吸附，然后持续缓慢向水中释放，因此，沉积物中高血压药物的污染状况调查十分必要。为了获得水环境沉积物中高血压药物的浓度水平和迁移转化规律，有必要建立一种灵敏高效，快速准确的提取和分析方法，用于水环境中痕量高血压药物的定性定量分析。

发明内容

本发明旨在针对现有技术存在的问题，提供一种快速检测环境沉积物中5种高血压药物痕量残留的方法，该方法操作简单、灵敏度高、准确度高，能快速提取和检测环境沉积物中5种高血压药物。

本发明提供了一种快速检测环境沉积物中高血压药物痕量残留的方法，包括如下步骤：

(1)样品前处理：向采集的沉积物样品中加入微生物抑制剂，冷冻干燥，研磨均匀并过筛，得到前处理后的样品；

(2)提取：向前处理后的样品中先加入内标溶液，再加入高纯水和乙腈，然后加入盐析试剂，手摇震荡提取，离心后取上清液，加入分散固相萃取试剂，手摇震荡净化，离心后取上清液浓缩，用甲醇重新定容混合均匀，过微孔滤膜，转移至进样小瓶，得到待测样品溶液；

(3)配制标准工作溶液：分别精密称取美托洛尔、普萘洛尔、阿替洛尔、厄贝沙坦、硝苯地平和2种同位素内标物质的标准物质，分别配制成标准储备溶液，通过梯度稀释配制得到标准工作溶液，以内标法建立标准工作曲线；所述的同位素内标物质为阿替洛尔-d₇和美托洛尔-d₇；

(4)超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪检测：步骤(2)中的样品溶液和步骤(3)中的标准工作溶液氮气下轻轻吹至近干，用含5mM乙酸铵和甲酸的质量分数为0.2％的水溶液与甲醇的混合溶液(v/v＝2/8)重新溶解，然后在相同条件下，通过超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪测定；

超高效液相色谱条件为：色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(50mm×2.1mm，1.8μm)，柱温为40℃，流速为0.3mL/min，进样体积为5μL；流动相为含5mmol/L乙酸铵和0.2％甲酸的A相水溶液和B相甲醇，总运行时间8min，后运行时间4min，用于平衡液相色谱柱，梯度洗脱程序如表2所示：

表2液相色谱梯度洗脱程序

质谱条件为：离子源为电喷雾离子源(ESI+)；扫描模式为多反应监测模式MRM；干燥气温度为350℃；干燥气流速为8L/min；鞘气温度为350℃；鞘气流速为12L/min；雾化器压力为45psi；喷嘴电压为500V；毛细管电压为4500V；

选择特定的一组母离子和子离子作为定量离子，同时选择特定的一组母离子和子离子作为定性离子；所述的母离子为目标物质和一个氢离子的加和离子；5种高血压药物保留时间、母离子、子离子、碎裂电压、碰撞能及所采用的同位素内标如表3所示，带*的为定量离子所选用的子离子；

表3 5种高血压药物及其同位素内标的质谱条件

以目标高血压药物定量离子对的峰面积与对应同位素内标定量离子对的峰面积的相对比值Y为纵坐标，标准曲线工作溶液相对浓度X为横坐标，建立标准工作曲线；通过样品溶液中目标高血压药物定量离子对的峰面积与对应同位素内标定量离子对的峰面积的相对比值，得到样品溶液中目标高血压药物的浓度，从而获得沉积物样品中目标高血压药物的含量。

步骤(1)中，使用冷冻干燥仪将样品冻干，样品研磨后过0.074mm筛子；步骤(2)中微孔滤膜为0.22μm孔径的有机相滤膜。

优选地，步骤(1)所述的微生物抑制剂为叠氮化钠，叠氮化钠的加入量为每500mL的沉积物样品加入1g叠氮化钠。

优选地，步骤(2)所述的内标溶液为阿替洛尔-d₇和美托洛尔-d₇。内标溶液为含有1mg/L的阿替洛尔-d₇和1mg/L的美托洛尔-d₇的甲醇溶液。

优选地，步骤(2)所述的高纯水的加入量为每1g样品加入5.0-6.0mL高纯水，乙腈的加入量为每1g样品加入10.0mL乙腈，乙腈中含有质量分数为1％的乙酸。

优选地，步骤(2)所述的盐析试剂由无水硫酸镁和无水乙酸钠组成，所述的无水硫酸镁和无水乙酸钠的质量比为7:1.5。以1g检测样品为准，盐析试剂的加入量为7g无水硫酸镁和1.5g无水乙酸钠。

优选地，步骤(2)所述的分散固相萃取试剂由无水硫酸镁、PSA和C18组成，所述的无水硫酸镁、PSA和C18的质量比为20:4:3。以1g检测样品为准，分散固相萃取试剂的加入量为1000mg无水硫酸镁、200mg PSA和150mg C18。

优选地，手摇震荡提取，离心后取上清液的具体步骤为：手摇震荡提取90s，然后3040g条件下离心15min，取8.0mL上清液。

优选地，手摇震荡净化，离心后取上清液浓缩的具体步骤为：手摇震荡净化30s，然后3040g条件下离心15min，取5mL上清液浓缩。

优选地，步骤(3)所述的标准工作曲线的梯度浓度分别为5.0μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L和200μg/L。

本发明的有益效果是：

1、目前我国关于沉积物中常见高血压药物的相关监测技术尚处于起步阶段，本发明首次提供了环境沉积物中高血压药物痕量残留的快速检测方法，填补了本领域的空白；本发明方法灵敏度高，涉及的5种目标高血压药物在环境沉积物中检测限范围为0.13～0.49ng/g。

2、现在常用的超声萃取/固相萃取净化或者加速溶剂萃取/固相萃取净化方法流程复杂，耗时长，消耗溶剂量大，需要借助专门的仪器设备进行操作，对于大批量样品的筛查分析需要耗费大量人力物力；本发明方法能同时快速提取环境沉积物中多种高血压药物，操作简单，不需要专门的提取设备，耗时短，所需溶剂少。

3、本发明定性定量科学准确，在5～200μg/L范围内，涉及的5种目标高血压药物回归方程线性相关系数r²均大于0.99，r²范围为0.9951～0.9997；目标高血压药物在5ng/g、20ng/g、50ng/g添加浓度水平的环境沉积物中回收率范围为85％～119％，实验室内相对标准偏差1％～10％，能够准确定量环境沉积物中的痕量高血压药物。

4、患者常用的高血压药物种类较多，化合物物理化学性质差别较大，难以用一种方法同时分析多种不同类型的高血压药物，本发明针对常见的高血压药物种类，采用水和乙腈的混合溶剂，通过硫酸镁和乙酸钠的混合盐析试剂提取，使得多种痕量高血压药物都能得到充分提取；本发明提出的方法灵敏度高，操作简单，快速准确，适用范围广，可用于大批量样品的高通量分析，为高血压药物的环境含量调查和风险评估提供方法支持。

附图说明

图1为本发明的检测方法流程图；

图2为5种高血压药物标准溶液工作曲线(浓度范围5μg/L～200μg/L)；

图3为沉积物中5种高血压药物及其同位素内标混合标准溶液的总离子流图(加标浓度50ng/g)；

图4为沉积物中5种高血压药物的二级质谱图(加标浓度20ng/g)；

图5为沉积物中2种同位素内标高血压药物的二级质谱图(加标浓度50ng/g)；

图6为沉积物中5种高血压药物的提取离子图(加标浓度20ng/g)；

图7为沉积物中2种同位素内标高血压药物的提取离子图(加标浓度为50ng/g)；

图8为环境沉积物中检出的4种目标高血压药物及其对应的同位素内标物质的提取离子图(内标加标浓度50ng/g)。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。除特别说明，本发明使用的设备和试剂为本技术领域常规市购产品。

下述实施例中使用的仪器与试剂：

美托洛尔、普萘洛尔和阿替洛尔标准品购自Dr.Ehrenstorfer公司，厄贝沙坦、硝苯地平、美托洛尔-D₇和阿替洛尔-D₅购自Toronto Research Chemicals公司；色谱纯乙腈和甲醇购自Merk公司，色谱纯乙酸、甲酸和乙酸铵购自CNW公司，分析纯无水硫酸镁、无水乙酸钠、PSA和封端C18购自Agilent公司；0.22μm有机相滤头购自安谱公司；所用水为符合GB/T6682规定的一级水；

分析仪器为超高效液相色谱/串联质谱仪(UPLC-MS/MS，1290/6460)，购自Agilent公司。

实施例1

本实施例选取沉积物为环境样品代表，提供一种沉积物样品中5种目标高血压药物的加标回收率、灵敏度检测实验，包括以下步骤：

(1)样品前处理

采集500mL沉积物样品，加入1g叠氮化钠抑制微生物，冷冻干燥后，弃去杂质，研磨均匀并过0.074mm筛。

(2)提取

向前处理后的1g样品中加入50μL浓度为1mg/L的内标混合溶液，加入6mL高纯水和10mL乙腈(含1％乙酸)，加入含7g无水硫酸镁和1.5g无水乙酸钠的混合盐析试剂，手摇震荡提取90s，置于3040g条件下离心15min，然后取8mL上清液，加入含1000mg无水硫酸镁、200mgPSA和150mg C18的混合分散固相萃取试剂，手摇震荡净化30s，置于3040g条件下离心15min，然后取5mL上清液，置于氮气下轻轻吹干，浓缩至近干，重新用500μL定容，涡旋10s混合均匀，提取液过0.22μm孔径的有机相微孔滤膜，并转移至进样小瓶，得到待测样品溶液，提取流程图如图1所示。

(3)配制标准工作溶液

分别精密称取5种高血压药物美托洛尔、普萘洛尔、阿替洛尔、厄贝沙坦、硝苯地平和2种同位素内标物质阿替洛尔-d₇和美托洛尔-d₇的标准物质，分别用甲醇配制成浓度为100mg/L的标准储备溶液，将标准储备溶液稀释成1mg/L的标准工作溶液，最后配制成浓度分别为5.0μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L和200μg/L的标准工作溶液，其中内标物质浓度为50μg/L。以内标法建立标准溶液工作曲线，如图2所示。

(4)超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪检测

步骤(2)中的样品溶液和步骤(3)中的标准工作溶液氮气下轻轻吹至近干，用含5mM乙酸铵和0.2％甲酸的水溶液与甲醇的混合溶液(v/v＝2/8)重新溶解，然后在相同条件下，通过超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪测定。

超高效液相色谱条件为：色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(50mm×2.1mm，1.8μm)，柱温为40℃，流速为0.3mL/min，进样体积为5μL；流动相为含5mmol/L乙酸铵和0.2％甲酸的A相水溶液和B相甲醇，总运行时间8min，后运行时间4min，用于平衡液相色谱柱，5种高血压药物及其同位素内标混合标准溶液的总离子流图如图3所示，梯度洗脱程序如表4所示：

表4液相色谱梯度洗脱程序

选择特定的一组母离子和子离子作为定量离子，同时选择特定的一组母离子和子离子作为定性离子；所述的母离子为目标物质和一个氢离子的加和离子；5种高血压药物保留时间、母离子、子离子、碎裂电压、碰撞能及所采用的同位素内标见表5，带*的为定量离子所选用的子离子，5种高血压药物的二级质谱图如图4所示，2种同位素内标高血压药物的二级质谱图5所示；

表5 5种高血压药物及其同位素内标的质谱条件

定性鉴定：在相同的仪器条件下分析，若样品中目标高血压药物的色谱峰保留时间与标准工作溶液中对应目标高血压药物的保留时间一致，监测的定性定量离子对均出现，并且离子对丰度比与标准工作溶液一致，则判断样品中存在这种目标高血压药物。

定量分析：以目标高血压药物定量离子对的峰面积与对应同位素内标定量离子对的色谱峰面积的相对比值Y为纵坐标，标准曲线工作溶液相对浓度X为横坐标，建立标准工作曲线，标准工作溶液相关系数r²>0.99；通过样品溶液中目标高血压药物定量离子对的色谱峰面积与对应同位素内标定量离子对的色谱峰面积的相对比值，得到样品溶液中目标高血压药物的浓度，从而获得沉积物样品中目标高血压药物的含量。

加标回收率和重复性

回收率采用3次平行加标，考察高、中、低三个加标浓度，加标方法为：在不含目标高血压药物的沉积物样品中加入适量5种目标高血压药物的混合标准中间液，使各高血压药物的加标浓度分别为5ng/g、20ng/g和50ng/g，然后加入50μL浓度为1mg/L的混合同位素内标标准中间液，按上述步骤进行提取和检测，5种高血压药物的提取离子图如图6所示，2种同位素内标高血压药物的提取离子图如图7所示。将测定的浓度与理论添加浓度进行比较，得到5种高血压药物的加标回收率，通过计算3个平行加标样的相对标准偏差考察方法重复性。

本发明方法对沉积物中5种目标高血压药物的加标回收率和重复性结果如表6所示，可以看出，5种目标高血压在5ng/g～50ng/g添加浓度水平上的加标回收率范围为85％～119％，5种高血压药物在5ng/g、20ng/g和50ng/g加标浓度下的平均回收率分别为104.6％、109.6％和106.8％，平行样相对标准偏差RSD均小于10％，说明本方法回收率高，重复性好，可用于实际样品的检测。

检出限和检测限

以3倍信噪比(S/N)对应的浓度为检出限，以10倍S/N对应的浓度为检测限，具体操作为：向不含目标高血压药物的沉积物样品中加入5ng的混合标准工作液(0.1mg/L，50μL)，按上述步骤进行提取和检测。利用仪器配置的软件计算出该加标浓度下的S/N值，用该加标浓度与各高血压药物的S/N值相比，所获比值的3倍为方法检出限，所获比值的10倍为方法检测限。本发明方法对沉积物中5种目标高血压药物的检出限和检测限结果如表6所示，5种目标高血压药物的检出限范围为0.04ng/g～0.15ng/g，检测限范围为0.13ng/g～0.49ng/g，5种目标高血压药物的检测限均低于0.5ng/g，说明本方法灵敏度高，能用于环境沉积物样品中高血压药物的痕量检测。

表6 QuEChERS提取条件下，5种高血压药物在沉积物中的加标回收率(％±标准偏差)、检出限和检测限

^a平均值±相对标准偏差(％)(n＝3)。

实施例2

本实施例比较了QuEChERS方法与已报道的超声萃取/固相萃取和加速溶剂萃取/固相萃取方法对5种目标高血压药物的提取效果，结果如表7所示。

表7不同提取条件下，5种高血压药物在沉积物中的加标回收率(％)

注：粗体表示回收率范围超过70％～120％。

由表7得出，沉积物样品中5种目标高血压药物通过QuEChERS提取、超声萃取结合固相萃取净化和加速溶剂萃取结合固相萃取净化的回收率范围分别为82％～110％，0％～1153％和0％～131％。整体来看，QuEChERS提取对5种目标高血压药物均具有较好的提取效果，超声萃取结合固相萃取净化和加速溶剂萃取结合固相萃取净化不能提取阿替洛尔，对厄贝沙坦的回收率较低，相比其他两种常用的提取方法，QuEChERS提取方法操作简单，快速，不需要借助专门的提取设备，对5种目标高血压药物的提取回收率高、重复性好，因此，最终本发明最优的选择为QuEChERS提取方法。

实施例3

本实施例提供一种检测沉积物样品中5种目标高血压药物含量的分析调查结果，包括以下步骤：

(1)样品前处理

(2)提取

同实施例1；

(3)配制标准工作溶液

同实施例1；

(4)超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪检测

同实施例1；

(5)检测结果

采用本发明开发的QuEChERS提取、超高效液相色谱/串联质谱法，在海珠湖底的沉积物中共检测出4种目标高血压药物，检出的4种目标高血压药物及其对应的同位素内标物质的提取离子图如图8所示，检测的4种目标高血压药物浓度结果如表8所示。

表8环境沉积物样品中检出的目标高血压药物含量(ng/g干重)

注：<MQLs表示有检出，但是检测结果低于方法定量限。

由表8得出，检出的4种目标高血压药物含量范围为<MQLs～9.22ng/g，平行样标准偏差SD均小于0.27ng/g，其中厄贝沙坦的检出浓度最高，目标高血压药物的检出与其使用量及吸附降解等环境行为有关。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种快速检测环境沉积物中高血压药物痕量残留的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(4)超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪检测：步骤(2)中的样品溶液和步骤(3)中的标准工作溶液氮气下轻轻吹至近干，用含5mM乙酸铵和甲酸的质量分数为0.2％的水溶液与甲醇的混合溶液重新溶解，然后在相同条件下，通过超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪测定；

超高效液相色谱条件为：色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(50mm×2.1mm，1.8μm)，柱温为40℃，流速为0.3mL/min，进样体积为5μL；流动相为含5mmol/L乙酸铵和0.2％甲酸的A相水溶液和B相甲醇，总运行时间8min，后运行时间4min，用于平衡液相色谱柱，梯度洗脱程序如表1所示：

表1 液相色谱梯度洗脱程序

选择特定的一组母离子和子离子作为定量离子，同时选择特定的一组母离子和子离子作为定性离子；所述的母离子为目标物质和一个氢离子的加和离子；5种高血压药物保留时间、母离子、子离子、碎裂电压、碰撞能及所采用的同位素内标如表2所示，带*的为定量离子所选用的子离子；

表2 5种高血压药物及其同位素内标的质谱条件

2.根据权利要求1所述的快速检测环境沉积物中高血压药物痕量残留的方法，其特征在于，步骤(1)所述的微生物抑制剂为叠氮化钠，叠氮化钠的加入量为每500mL的沉积物样品加入1g叠氮化钠。

3.根据权利要求1所述的快速检测环境沉积物中高血压药物痕量残留的方法，其特征在于，步骤(2)所述的内标溶液为阿替洛尔-d₇和美托洛尔-d₇。

4.根据权利要求1所述的快速检测环境沉积物中高血压药物痕量残留的方法，其特征在于，步骤(2)所述的高纯水的加入量为每1g样品加入5.0-6.0mL高纯水，乙腈的加入量为每1g样品加入10.0mL乙腈，乙腈中含有质量分数为1％的乙酸。

5.根据权利要求1所述的快速检测环境沉积物中高血压药物痕量残留的方法，其特征在于，步骤(2)所述的盐析试剂由无水硫酸镁和无水乙酸钠组成，所述的无水硫酸镁和无水乙酸钠的质量比为7:1.5。

6.根据权利要求1所述的快速检测环境沉积物中高血压药物痕量残留的方法，其特征在于，步骤(2)所述的分散固相萃取试剂由无水硫酸镁、PSA和C18组成，所述的无水硫酸镁、PSA和C18的质量比为20:4:3。

7.根据权利要求1所述的快速检测环境沉积物中高血压药物痕量残留的方法，其特征在于，手摇震荡提取，离心后取上清液的具体步骤为：手摇震荡提取90s，然后3040g条件下离心15min，取8.0mL上清液。

8.根据权利要求1所述的快速检测环境沉积物中高血压药物痕量残留的方法，其特征在于，手摇震荡净化，离心后取上清液浓缩的具体步骤为：手摇震荡净化30s，然后3040g条件下离心15min，取5mL上清液浓缩。

9.根据权利要求1所述的快速检测环境沉积物中高血压药物痕量残留的方法，其特征在于，步骤(3)所述的标准工作曲线的梯度浓度分别为5.0μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L和200μg/L。