CN112285240B - 基于固相萃取-液质联用的生物样品中浙贝母三种活性成分的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于固相萃取‑液质联用的生物样品中浙贝母三种活性成分的检测方法，该检测方法涉及分析化学在生物医学中的应用。具体步骤为，取生物样品，加入到预活化的MCX固相萃取小柱中，用水和甲醇洗涤除杂后，用氨水‑甲醇溶液洗脱样品，洗脱液真空离心浓缩干燥。浓缩后用甲醇复溶，经过滤后进行液相色谱质谱联用仪器分析。本发明的检测方法利用固相萃取结合高分辨率仪器，灵敏度高、干扰少，对生物样品中的三种贝母活性成分进行分析，为贝母给药后体内活性成分药代动力学的研究提供方法。

Description

基于固相萃取-液质联用的生物样品中浙贝母三种活性成分 的检测方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，特别是涉及用于对血浆、尿液和粪便这三种样品中的浙贝母活性成分进行检测的一种检测方法，具体地说是基于固相萃取-液质联用的生物样品中浙贝母三种活性成分的检测方法。

背景技术

浙贝母是百合科、贝母属中一种多年生草本植物，主产地在浙江，主要功能为清热散结，化痰止咳。浙贝母的药效成分为甾体类生物碱，最具有代表性的为浙贝甲素和浙贝乙素，在祛痰镇咳、降压活血、抗炎、抗氧化等方面具有重要的药用价值。

目前对于浙贝甲素，浙贝乙素和贝母辛的测定方法主要由比色法，非水滴定法，薄层色谱法和高效液相色谱-蒸发光散射法(HPLC-ELSD)等。由于生物碱对紫外吸收较弱，因此大部分文献都采用HPLC-ELSD测定生物碱。在最新的2015版中国药典中，同样是采用HPLC-ELSD法测定浙贝母中的浙贝甲素和浙贝乙素。但是这种方法灵敏度低，干扰因素较多，对于含量低的生物样本的测定无能为力。固相萃取技术主要用于样本的分离和纯化，其能有效的将分析物与干扰组分分离，减少杂质的干扰。液相色谱质谱联用方法灵敏度高，线性范围宽，定量准确。因此固相萃取和液质联用技术的联合使用被广泛用于生物样品中活性成分的测定。目前Ma等人采用液相色谱质谱联用技术对血浆中的浙贝甲素和浙贝乙素进行了检测，并未涉及其它生物碱成分。另外对尿液及粪便中贝母生物碱的分离检测，尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的现状，而提供前处理简单，重复性好，灵敏度高，适用于生物样品中贝母生物碱分析研究的一种基于固相萃取-液质联用的生物样品中浙贝母三种活性成分的检测方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

基于固相萃取-液质联用的生物样品中浙贝母三种活性成分的检测方法,该检测方法包括以下步骤：

1)、大鼠灌胃给药贝母提取物，剂量为0.5-1 g/kg，给药后1小时眼丛动脉取全血0.3-1 mL于含有肝素钠的抗凝管中, 离心后取上清血浆，同时给药后0-4小时收集尿液和粪便样本；

2)、取步骤1)中收集的液体样本50-200µL；固体样本0.05-0.1g，每g固体样本加入30-40mL甲醇提取，涡旋离心后，取上清液移入收集管，真空离心浓缩，得浓缩干燥样本，用0.5-1mL水复溶；所述的液体样本为收集的血浆样本和尿液样本，所述的固体样本为收集的粪便样本；

3)、将上述液体样本和提取后的固体样本加入到预先用3mL甲醇和3mL水活化处理后的MCX混合型阳离子交换柱中，而后依次用6mL水和6mL甲醇洗涤，弃去洗涤液，再用3mL氨水-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，真空离心浓缩，得浓缩干燥样本；

4)、将步骤3)得到的浓缩干燥样本再用甲醇溶液涡旋复溶，然后经滤膜过滤后，在一定的条件下进行液相色谱质谱联用仪分析；

5)、在与步骤4)相同的条件下，将标准样品溶液进行液相色谱质谱联用仪分析，所述的标准样品为浙贝甲素，浙贝乙素，贝母辛，通过标准样品获得的质量数，保留时间和二级碎片，对血浆、尿液和粪便样品中是否含有上述标准样品中的物质进行定性；

6)、标准曲线样本溶液制备：将步骤5)中标准样品溶液逐级稀释，分别加入到空白血浆、空白尿液和空白粪便提取物中制备至少2个以上不同浓度的样品，采用与步骤3)相同处理方法进行处理并进行液相色谱质谱联用仪分析，建立线性曲线，根据对应的线性曲线进行血浆、尿液和粪便样品中各贝母活性成分的定量。

为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：

上述的步骤4)中的条件为采用的液相检测条件和采用的质谱检测条件；

所述的液相检测条件为：C18色谱柱规格2.1×150 mm×1.7 μm，流速0.3 mL/min，柱温40℃，进样体积为2 μL；液相色谱流动相A为含0.1%的甲酸水溶液，B相为纯乙腈，采用梯度程序洗脱，初始时为20%B相，保持2分钟；随后在5分钟内香型升高到55%B相；接着在0.1分钟内升高到90%B相，并冲洗系统3分钟，然后再0.1分钟内恢复到20%B相，平衡2分钟；

所述的质谱检测条件为：采用ESI正离子模式，喷雾电压3kV，毛细管温度为150℃，干燥气流速为1000 L/h，干燥气温度为400 ℃；方法采用MS^E采集模式，高低碰撞能量分别设置为30 和5 eV，扫描范围为100-1500 m/z。

上述的步骤3)中氨水-甲醇溶液的浓度为3%-10%。

上述的步骤2)中，将血浆、尿液和粪便样本浓缩干燥12-24小时至完全干燥后再进行称重。

上述的步骤4)中浓缩干燥样本用甲醇复溶，每1mg提取浓缩干燥样本用50-200 µL的甲醇溶液。

与现有技术相比，本检测方法结合分析化学的提取，浓缩及高效液相色谱-高分辨质谱分离检测技术，对检测对象的血浆、尿液及粪便中的贝母生物碱成分进行定性和定量分析。浙贝甲素，浙贝乙素和贝母辛的检测限能达到0.1 ng/mL，线性范围能达到3个数量级，线性相关系数r²>0.99，采用保留时间，一级精确质量数和二级质谱碎片信息进行定性，采用对应的标准样品的线性曲线进行定量。本方法简单，高效，灵敏，可对生物样品中的贝母生物碱成分进行定性定量检测，为浙贝母活性成分体内代谢研究提供方法。

附图说明

图1 标准溶液中浙贝甲素，浙贝乙素和贝母辛的提取离子谱图；

图2 大鼠血浆样品中浙贝甲素，浙贝乙素和贝母辛的提取离子谱图；

图3 大鼠尿液样品中浙贝甲素，浙贝乙素和贝母辛的提取离子谱图；

图4 大鼠粪便样品中浙贝甲素，浙贝乙素和贝母辛的提取离子谱图。

具体实施方式

本发明的目的是提供生物样品中贝母生物碱成分的测定方法，其前处理简单，重复性好，灵敏度高，适用于生物样品中贝母生物碱的分析研究。本检测方法以大鼠为检测对象，在本实施例中所谓的大鼠为无生命的大鼠模型，以便教学分析应用。

本发明基于固相萃取-液质联用的生物样品中浙贝母三种活性成分的检测方法,该检测方法包括以下步骤：

1)、大鼠灌胃给药贝母提取物，剂量为0.5-1 g/kg，给药后1小时眼丛动脉取全血0.3-1 mL于含有肝素钠的抗凝管中, 离心后取上清血浆，同时给药后0-4小时收集尿液和粪便样本；

2)、取步骤1)中收集的液体样本50-200µL；固体样本0.05-0.1g，每g固体样本加入30-40mL甲醇提取，涡旋离心后，取上清液移入收集管，真空离心浓缩，得浓缩干燥样本，用0.5-1mL水复溶；所述的液体样本为收集的血浆样本和尿液样本，所述的固体样本为收集的粪便样本；

3)、将上述液体样本和提取后的固体样本加入到预先用3mL甲醇和3mL水活化处理后的MCX混合型阳离子交换柱中，而后依次用6mL水和6mL甲醇洗涤，弃去洗涤液，再用3mL氨水-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，真空离心浓缩，得浓缩干燥样本；

4)、将步骤3)得到的浓缩干燥样本再用甲醇溶液涡旋复溶，然后经滤膜过滤后，在一定的条件下进行液相色谱质谱联用仪分析；所谓的一定的条件包括采用的液相检测条件和采用的质谱检测条件。其中：

液相检测条件为：C18色谱柱规格2.1×150 mm×1.7 μm，流速0.3 mL/min，柱温40℃，进样体积为2 μL；液相色谱流动相A为含0.1%的甲酸水溶液，B相为纯乙腈，采用梯度程序洗脱，初始时为20%B相，保持2分钟；随后在5分钟内香型升高到55%B相；接着在0.1分钟内升高到90%B相，并冲洗系统3分钟，然后再0.1分钟内恢复到20%B相，平衡2分钟；

质谱检测条件为：采用ESI正离子模式，喷雾电压3kV，毛细管温度为150℃，干燥气流速为1000 L/h，干燥气温度为400 ℃；方法采用MSE采集模式，高低碰撞能量分别设置为30 和5 eV，扫描范围为100-1500 m/z。

5)、在与步骤4)相同的条件下，将标准样品溶液进行液相色谱质谱联用仪分析，所述的标准样品为浙贝甲素，浙贝乙素，贝母辛，通过标准样品获得的质量数，保留时间和二级碎片，对血浆、尿液和粪便样品中是否含有上述标准样品中的物质进行定性；

6)、标准曲线样本溶液制备：将步骤5)中标准样品溶液逐级稀释，分别加入到空白血浆、空白尿液和空白粪便提取物中制备至少2个以上不同浓度的样品，采用与步骤3)相同处理方法进行处理并进行液相色谱质谱联用仪分析，建立线性曲线，根据对应的线性曲线进行血浆、尿液和粪便样品中各贝母活性成分的定量。

上述的步骤3)中氨水-甲醇溶液的浓度为3%-10%；

上述的步骤2)中，将血浆、尿液和粪便样本浓缩干燥12-24小时至完全干燥后再进行称重；

上述的步骤4)中浓缩干燥样本用甲醇复溶，每1mg提取浓缩干燥样本用50-200 µL的甲醇溶液。以下利用大鼠模型，对本发明进一步说明：当然在采用有生命的大鼠进行试验时方法与采用大鼠模型一致。

实施例一：血浆样本中浙贝甲素，浙贝乙素和贝母辛的检测。

3只大鼠分别灌胃给药贝母提取物，给药剂量为 1 g/kg，给药后1小时眼丛动脉分别取0.5 mL全血于含有肝素钠的抗凝管中, 离心后各取50 µL上清血浆混合，将血浆样本加入到MCX混合型阳离子交换柱（预先用3mL甲醇和3mL水活化处理）中，而后依次用6mL水和6mL甲醇洗涤，弃去洗涤液，再用3mL3%氨水-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，真空离心浓缩45℃下浓缩12小时，得浓缩干燥样本，浓缩样本用50 µL 甲醇溶液复溶，涡旋混匀后，经0.22 μm滤膜过滤后进行液相色谱质谱联用仪分析。

液相色谱分离采用C18色谱柱，色谱柱规格为2.1×150 mm×1.7 μm，流速0.3 mL/min，柱温40℃，进样体积为2 μL；液相色谱流动相A为含0.1%的甲酸水溶液，B相为纯乙腈，采用梯度程序洗脱，初始时为20%B相，保持2分钟；随后在5分钟内线性升高到55%B相；接着在0.1分钟内升高到90%B相，并冲洗系统3分钟，然后再0.1分钟内恢复到20%B相，平衡2分钟。采用高分辨质谱ESI源正离子模式，喷雾电压3kV，毛细管温度为150℃，干燥气流速为1000 L/h，干燥气温度为400 ℃。方法采用MS^E采集模式，高低碰撞能量分别设置为30 和5eV，扫描范围为100-1500 m/z。

根据检测到的保留时间，一级精确质量数和二级质谱碎片信息，发现大鼠给药浙贝母1小时后，在血浆中能检测到浙贝甲素，浙贝乙素和贝母辛，所得的峰面积经线性曲线定量，得到浙贝甲素，浙贝乙素和贝母辛在血浆中的含量分别为9.29、16.74、19.63 ng/mL。

实施例二：尿液样本中浙贝甲素，浙贝乙素和贝母辛的检测

3只分别大鼠灌胃给药浙贝母提取物，给药剂量为 0.5 g/kg，给药后0-4小时收集尿液，3000 rmp离心后取100 µL上清尿液，将尿液样本加入到MCX混合型阳离子交换柱（预先用3mL甲醇和3mL水活化处理）中，而后依次用6mL水和6mL甲醇洗涤，弃去洗涤液，再用3mL10%氨水-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，真空离心浓缩45℃下浓缩18小时，得浓缩干燥样本，浓缩样本用100 µL 甲醇溶液复溶，经0.22 μm滤膜过滤后进行液相色谱质谱联用仪分析。根据结果显示，在尿液样本中能检测到浙贝甲素，浙贝乙素和贝母辛，含量分别为194.97、312.07、25.67 ng/mL。本实施例中采用的液相检测条件和采用的质谱检测条件与实施例一相同，不再重述。

实施例三：粪便样本中浙贝甲素，浙贝乙素和贝母辛的检测

3只分别大鼠灌胃给药浙贝母提取物，给药剂量为 0.5 g/kg，给药后0-4小时收集粪便样本，干燥后研磨混匀，取0.1 g粪便样本，加入3mL甲醇提取，涡旋离心后，取上清液移入收集管，真空离心浓缩45℃下浓缩24小时，得浓缩干燥样本，用0.5mL水复溶得粪便样本。将粪便样本加入到MCX混合型阳离子交换柱（预先用3mL甲醇和3mL水活化处理）中，而后依次用6mL水和6mL甲醇洗涤，弃去洗涤液，再用3mL8%氨水-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，真空离心浓缩45℃下浓缩24小时，得浓缩干燥样本，浓缩样本用100 µL 甲醇溶液复溶，涡旋混匀后，经0.22 μm滤膜过滤后进行液相色谱质谱联用仪分析。根据结果显示，在粪便样本中能检测到浙贝甲素，浙贝乙素和贝母辛，含量分别为213.22、148.40、142.15 ng/mL。本实施例中，采用的液相检测条件和采用的质谱检测条件也与实施例一相同，不再重述。

实施例四：分析方法的评价

准确称量并用甲醇分别配置0.5 mg/mL的浙贝甲素，浙贝乙素和贝母辛标准溶液，吸取各标准溶液混合，再稀释成一系列浓度后，分别加入到空白血浆、空白尿液和空白粪便中，进行固相萃取和液相色谱质谱仪检测。根据实际样本含量及仪器灵敏度情况选择线性范围，以浓度为横坐标坐标，以峰面积为纵坐标制作标准曲线，方法的定量限、检测限、线性相关系数见表1，该方法可对血浆，尿液，粪便中的浙贝甲素，浙贝乙素和贝母辛可以进行准确定量。

表1线性范围、回归方程、相关系数

本发明的最佳实施例已阐明，由本领域普通技术人员做出的各种变化或改型都不会脱离本发明的范围。

Claims (1)

1.基于固相萃取-液质联用的生物样品中浙贝母三种活性成分的检测方法,其特征是：该检测方法包括以下步骤：

1)、大鼠灌胃给药贝母提取物，剂量为0.5-1g/kg，给药后1小时眼丛动脉取全血0.3-1mL于含有肝素钠的抗凝管中,离心后取上清血浆，同时给药后0-4小时收集尿液和粪便样本；

2)、取步骤1)中收集的液体样本50-200µL；固体样本0.05-0.1g，每g固体样本加入30-40mL甲醇提取，涡旋离心后，取上清液移入收集管，真空离心浓缩，得浓缩干燥样本，用0.5-1mL水复溶；所述的液体样本为收集的血浆样本和尿液样本，所述的固体样本为收集的粪便样本；将血浆、尿液和粪便样本浓缩干燥12-24小时至完全干燥后再进行称重；

3)、将上述液体样本和提取后的固体样本加入到预先用3mL甲醇和3mL水活化处理后的MCX混合型阳离子交换柱中，而后依次用6mL水和6mL甲醇洗涤，弃去洗涤液，再用3mL氨水-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，真空离心浓缩，得浓缩干燥样本；所述氨水-甲醇溶液的浓度为3%-10%；

4)、将步骤3)得到的浓缩干燥样本再用甲醇溶液涡旋复溶，每1mg提取浓缩干燥样本用50-200µL的甲醇溶液，然后经滤膜过滤后，在一定的条件下进行液相色谱质谱联用仪分析；所谓的一定的条件包括采用的液相检测条件和采用的质谱检测条件；其中：所述的液相检测条件为：C18色谱柱规格2.1×150mm×1.7μm，流速0.3mL/min，柱温40℃，进样体积为2μL；液相色谱流动相A为含0.1%的甲酸水溶液，B相为纯乙腈，采用梯度程序洗脱，初始时为20%B相，保持2分钟；随后在5分钟内线性 升高到55%B相；接着在0.1分钟内升高到90%B相，并冲洗系统3分钟，然后在 0.1分钟内恢复到20%B相，平衡2分钟；所述的质谱检测条件为：采用ESI正离子模式，喷雾电压3kV，毛细管温度为150℃，干燥气流速为1000L/h，干燥气温度为400℃；方法采用MS^E采集模式，高低碰撞能量分别设置为30和5eV，扫描范围为100-1500m/z；

5)、在与步骤4)相同的条件下，将标准样品溶液进行液相色谱质谱联用仪分析，所述的标准样品为浙贝甲素，浙贝乙素，贝母辛，通过标准样品获得的质量数，保留时间和二级碎片，对血浆、尿液和粪便样品中是否含有上述标准样品中的物质进行定性；

6)、标准曲线样本溶液制备：将步骤5)中标准样品溶液逐级稀释，分别加入到空白血浆、空白尿液和空白粪便提取物中制备至少2个以上不同浓度的样品，采用与步骤3)相同处理方法进行处理并进行液相色谱质谱联用仪分析，建立线性曲线，根据对应的线性曲线进行血浆、尿液和粪便样品中各贝母活性成分的定量。

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