CN112014509A - 同步测定样品中血管紧张素i和醛固酮的方法 - Google Patents

同步测定样品中血管紧张素i和醛固酮的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112014509A
CN112014509A CN202010918000.5A CN202010918000A CN112014509A CN 112014509 A CN112014509 A CN 112014509A CN 202010918000 A CN202010918000 A CN 202010918000A CN 112014509 A CN112014509 A CN 112014509A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
solid phase
phase extraction
ald
ang
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010918000.5A
Other languages
English (en)
Inventor
郭玮
潘柏申
李国庆
王蓓丽
陈方俊
彭颖斐
黄超
刘丹
王真昕
胡玉懿
程子韵
张曦
温冬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jusbio Sciences Shanghai Co ltd
Shanghai Aibocaisi Analytical Instrument Trading Co ltd
Zhongshan Hospital Fudan University
Original Assignee
Jusbio Sciences Shanghai Co ltd
Shanghai Aibocaisi Analytical Instrument Trading Co ltd
Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jusbio Sciences Shanghai Co ltd, Shanghai Aibocaisi Analytical Instrument Trading Co ltd, Zhongshan Hospital Fudan University filed Critical Jusbio Sciences Shanghai Co ltd
Priority to CN202010918000.5A priority Critical patent/CN112014509A/zh
Publication of CN112014509A publication Critical patent/CN112014509A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/36—Control of physical parameters of the fluid carrier in high pressure liquid systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
    • G01N30/724—Nebulising, aerosol formation or ionisation
    • G01N30/7266—Nebulising, aerosol formation or ionisation by electric field, e.g. electrospray
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
    • G01N30/8679—Target compound analysis, i.e. whereby a limited number of peaks is analysed
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/062—Preparation extracting sample from raw material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Library & Information Science (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本文涉及同步测定样品中血管紧张素I和醛固酮的方法。具体地，本文提供一种同步测定样品中血管紧张素I(Ang I)和醛固酮(Ald)含量的方法，包括：(a)固相萃取处理样品；和(b)通过液相色谱串联质谱分析经(a)处理的样品，确定其中Ang I的量与Ald的量；其中，所述质谱采用正离子模式和负离子模式切换的方式扫描。本文还提供用于同步测定样品中血管紧张素I和醛固酮含量的系统，以及获得样品中醛固酮含量与肾素活性比值(ARR)的方法及系统。

Description

同步测定样品中血管紧张素I和醛固酮的方法
技术领域
本发明一般涉及样品中血管紧张素I和醛固酮的测定；具体地，涉及通过液相色谱-串联质谱法进行样品中血管紧张素I和醛固酮的同步测定。
背景技术
中国高血压患者总人数已突破3.3亿，按病因可分为原发性和继发性高血压。其中原发性醛固酮增多症(primary aldosteronism，PA)是继发性高血压中最常见的病因，在年轻高血压人群中约占10％。PA临床表现为高血压和(或)低血钾的临床综合征，其为一种“可治愈的高血压”，若能早期筛查诊断，通过手术或药物治疗使血压回到正常水平，则可降低患者心血管事件的发生率，改善患者预后。
肾素是由肾小球旁器释放的一种蛋白水解酶，能催化肝脏分泌进入血浆中的血管紧张素原转变成血管紧张素I(Ang I)，从而增加醛固酮(Ald)的生成。醛固酮是由肾上腺皮质球状带分泌的盐皮质激素，主要生理功能是保钠排钾，通过调节血容量维持体液水盐平衡。临床上推荐使用醛固酮/肾素活性比值(ARR)作为PA的初筛方法，再使用生理盐水抑制试验、开博通试验等作为确认试验。在这些临床实验中，准确检测肾素活性－醛固酮浓度至关重要。
血浆肾素活性水平非常低，仅为ng级，醛固酮更低，为pg级，对检测方法的灵敏度要求很高。放射免疫法和化学发光法检测直接肾素浓度是目前临床常用的两种肾素检测方法。免疫法可实现自动化操作，检测快速、成本低，但单次仅能检测一种靶标激素，特异性差、尤其是女性患者易出现交叉反应。内分泌激素水平在机体病理状态下波动范围大，易出现极高/低值，而免疫分析法在此类情况下准确性与重复性的不足，令其在功能性试验中无法正确反映患者的激素水平动态波动，从而影响临床诊断的灵敏度及特异性。
已有的用于PA筛查的质谱检测方法仅适用于对单一目标物质的分别测定，且前处理操作复杂，或致力于检测其它指标。目前还没有关于同步检测血浆中Ang I和Ald的报道。这主要是由于这两个化合物在体内的含量极低，样品往往存在干扰，且检测模式不同(正离子、负离子)对前处理和LC-MS/MS方法的要求严格。
发明内容
本发明开发并建立了质谱技术同步检测Ang I和Ald的方法和系统，能够结合多重反应监测技术，利用液相色谱串联质谱平台准确定量肾素活性，早期快速筛查PA，从而能够更好地为临床提供有效、准确的信息，为快速筛查诊断PA创造条件。本发明的技术方案便于大规模、高通量地操作，具有高灵敏度、高准确度和高特异性。
一方面，本文提供一种同步测定样品中血管紧张素I(Ang I)和醛固酮(Ald)含量的方法，包括：
(a)固相萃取处理样品；和
(b)通过液相色谱串联质谱分析经(a)处理的样品，确定其中Ang I的量与Ald的量；
其中，所述质谱采用正离子模式和负离子模式切换的方式扫描。
另一方面，本文提供一种用于同步测定样品中血管紧张素I(Ang I)和醛固酮(Ald)含量的系统，包括：
(i)固相萃取模块，其具有固相萃取装置和用于固相萃取装置的试剂；和
(ii)液相色谱串联质谱模块，其具有配备有色谱柱的液相色谱分析装置，和串联质谱分析装置，其中所述液相色谱串联质谱模块经配置以分析经固相萃取模块处理的样品，用于确定其中Ang I的量与Ald的量；
其中，所述串联质谱分析装置被设置以具有正离子模式和负离子模式切换的扫描方式。
另一方面，本文提供一种获得样品中醛固酮(Ald)含量与肾素活性(PRA)比值(ARR)的方法，包括：
(a)孵育样品；
(b)固相萃取处理经(a)孵育的样品；
(c)通过液相色谱串联质谱分析经(b)处理的样品，确定样品的Ang I含量与Ald含量，其中，所述质谱采用正离子模式和负离子模式切换的方式扫描；
(d)根据式(I)计算肾素活性(PRA)：
Figure BDA0002665716810000031
其中C1AngI为经(a)孵育的样品的Ang I含量，C0AngI为未经(a)孵育的样品的Ang I含量，t为(a)中孵育时间；和
(e)根据式(II)计算ARR：
Figure BDA0002665716810000032
其中CAld为经(a)孵育的样品的Ald含量，PRA为(d)中计算所得值。
另一方面，本文提供一种用于获得样品中醛固酮(Ald)含量与肾素活性(PRA)比值(ARR)的系统，包括：
(i)孵育模块，其具有孵育腔室和任选的一种或多种孵育试剂，用于孵育样品；
(ii)固相萃取模块，其具有固相萃取装置和用于固相萃取装置的试剂；
(iii)液相色谱串联质谱模块，其具有配备有色谱柱的液相色谱分析装置，和串联质谱分析装置，其中所述液相色谱串联质谱模块经配置以分析经固相萃取模块处理的样品，用于确定其中Ang I的量与Ald的量，其中，所述串联质谱分析装置被设置以具有正离子模式和负离子模式切换的扫描方式；和
(iv)计算模块，其经配置以接收来自液相色谱串联质谱模块的关于样品中分析物组分Ang I、Ald的量的数据，其具有存储器和处理器，其中存储器包含关于样品中分析物组分Ang I、Ald的量的数据，和处理器可执行的指令，所述处理器可执行的指令配置为：
(1)根据式(I)计算PRA：
Figure BDA0002665716810000033
其中C1AngI为经所述孵育模块孵育的样品的Ang I含量，C0AngI为未经所述孵育模块孵育的样品的Ang I含量，t为样品在所述孵育模块中的孵育时间；和
(2)根据式(II)计算ARR：
Figure BDA0002665716810000034
其中CAld为经所述孵育模块孵育的样品的Ald含量。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。
图1：显示通过本发明方案检测人血浆样品的Ang I和Ald的色谱图，具体分别为Ang I(左上)、Ang I内标(右上)、Ald(左下)、Ald内标(右下)。
图2：显示实施例2(2)中患者某一次ARR测定的图谱。
具体实施方式
本申请中科技术语的含意与本领域技术人员的普遍理解一致，除非另做说明。本申请中，“一”或其与各种量词的组合既包括单数含意也包括复数含意，除非特别说明。本申请中，对于同一参数或变量，当给出多个数值、数值范围、或其组合予以说明时，相当于具体揭示了这些数值、范围端值以及由它们任意组合而成的数值范围。本申请中，任一数值不论是否带有“约”之类的修饰词，一律涵盖本领域技术人员能够理解的约略范围，例如正负10％、5％等。本文中，每一“实施方式”均同等地指代且涵盖了本申请各项方法和各项系统的实施方式。本申请中，任意实施方式中一项或多项技术特征可以与任何一个或多个其他实施方式中的一项或多项技术特征自由组合，由此得到的实施方式同样属于本申请公开的内容。
一方面，本发明提供一种同步测定样品中血管紧张素I(Ang I)和醛固酮(Ald)含量的方法。
本文中，“同步测定”意在表示针对同一样品的测定。例如，对于液相色谱串联质谱检测而言，于一次运行中(例如，一次进样)完成Ang I的量和Ald的量的测定。本文中的同步测定不包括同时或不同时对于多于一份样品(包括同一来源的多份等分样品)的测定。
本文中，“样品”可包括生物样品、衍生自生物的样品或含分析物组分的样品，例如，包含血管紧张素I和醛固酮的任何样品。样品的一般实例包括：血液、血液组分如血浆、血清、淋巴液、组织间隙液、脑脊液，它们的衍生物。样品还可包括标准品样品(例如，含有给定浓度的标准品的样品)。在一些实施方式中，样品可包括血浆样品和标准品样品。
术语“血管紧张素”又称“血管紧张肽”，是一类具有强缩血管和刺激肾上腺皮质分泌醛固酮等作用的肽类物质，参与血压及体液的调节。可分为血管紧张素I-VII。“血管紧张素I”(Angiotensin I，Ang I)是一种十肽蛋白质，它在体内由血管紧张素原(属α球蛋白)水解而成，随血液流经肺循环时，受肺所含的转化酶作用，被水解为血管紧张素II。术语“醛固酮”(Aldosterone，Ald)是一种增进肾脏对于离子及水分子再吸收作用的类固醇类激素(盐皮质激素家族)，主要作用于肾脏，进行钠离子及水分子的再吸收。
本文中，述及某种物质的含量时，一般指该物质的质量分数，也即质量百分比浓度，例如以纳克/毫升(ng/mL)或皮克/毫升(pg/mL)计。
本发明的同步测定样品中Ang I和Ald的量的方法包括固相萃取，作为样品处理步骤，主要用于样品的分离、纯化和浓缩。
本文中，术语“固相萃取”(Solid phase extraction，SPE)是指这样的过程：其中化学混合物中的一种或多种组分由于溶于或悬浮于溶液(即，流动相)的组分对溶液所经过的固体或经过周围的固体(即，固定相或固相)的亲和性而被分离。在一些情况中，随着流动相流动经过固相，流动相中不需要的组分可被固相保留，而流动相中分析物组分则被纯化。在另一些情况中，随着流动相流动经过固相，流动相中分析物组分可被固相保留，而流动相中不需要的组分则流动通过固相。在这些情况中，随后需要利用第二流动相将被保留的分析物组分从固相洗脱，用于进一步的处理或分析。在一些实施方式中，本文中的固相萃取采用固相萃取装置进行。固相萃取装置(例如SPE柱)作为萃取装置(例如萃取柱)可通过单一或混合模式机制运行。混合模式机制在同一柱中应用离子交换和疏水保留；例如，混合模式SPE柱的固相可显示强阴离子交换和疏水保留；或可显示为强阳离子交换和疏水保留。
在一些实施方式中，所述方法中的固相萃取可采用反相固相萃取模式。本文中，术语“反相固相萃取”是利用固定相上非极性的吸附剂(例如，碳水化合物或聚合物)，将有机溶质从极性相(例如，水)中分离出来，非极性物质间作用力为范德华引力，吸附剂对溶质的亲和性主要依靠其疏水性。在一些实施方式中，固相萃取可包括反相固相萃取装置(例如反相固相萃取柱)。在一些实施方式中，固相萃取可包括反相固相萃取装置(例如反相固相萃取柱)或反相/离子交换混合固相萃取装置(例如，反相/离子交换混合固相萃取柱，如强阴离子交换SPE柱)。在一些示例性的实施方式中，固相萃取采用极性增强聚合物柱(PEP)(如官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱)或亲水亲油平衡柱(HLB)等。
在一些实施方式中，固相萃取可包括上样、淋洗、洗脱步骤。在一些实施方式中，固相萃取还可包括(例如，上样前)柱活化的步骤。在一些实施方式中，所述活化可采用甲醇进行。在一些实施方式中，固相萃取还可包括(例如，上样前)柱平衡的步骤。在一些实施方式中，所述平衡可采用纯水或甲酸水溶液(例如，浓度不高于5％、不高于4％、不高于3％、不高于2％或不高于1％的甲酸水溶液)进行。在一些实施方式中，固相萃取可包括活化、平衡、上样、淋洗、洗脱步骤。在一些实施方式中，固相萃取可包括一次或多次(例如，两次、三次、四次)淋洗。在一些实施方式中，固相萃取可包括采用甲醇水溶液和正己烷进行两次或更多次淋洗。在一些实施方式中，固相萃取可包括采用20％-30％的甲醇水溶液和正己烷进行两次或更多次淋洗。在一些实施方式中，固相萃取还可任选地包括用大气流吹干柱。在一些实施方式中，固相萃取可包括洗脱样品。在一些实施方式中，样品的洗脱采用甲醇进行。
Ald作为体内众多类固醇激素的一种，体内含量极低，且样品中存在较多干扰物。希望在固相萃取过程中尽可能地去除Ald的干扰物，例如，通过淋洗来尽可能地去除非目标物质。此外，发现Ang I对于能够较好去除Ald干扰物质的淋洗液较为敏感，即，常常在去除Ald干扰物质时影响Ang I的回收率。经长期研究设计得到了如本文所述的固相萃取方案，该方案所采用的(尤其)淋洗步骤能够兼顾干扰物的去除和目标物的回收率，为Ald和Ang I的同步检测提供了条件。
在一些实施方式中，样品可在固相萃取前经离心处理，以移除样品中的较大杂质。
在一些示例性的实施方式中，固相萃取可包括采用固相萃取装置进行：
活化：甲醇；
平衡：1％甲酸水溶液；
上样：取样品上样；
淋洗1：20％甲醇水溶液；
淋洗2：正己烷；
任选地，大气流吹干柱；
洗脱：甲醇。
在一个更具体的示例性实施方式中，固相萃取可包括采用固相萃取装置进行：
活化：200-750μL甲醇；
平衡：200-750μL 1％甲酸水溶液；
上样：取样品上样；
淋洗1：200-750μL 20％甲醇水溶液；
淋洗2：200-750μL正己烷；
任选地，0.2MPa大气流吹干柱5分钟；
洗脱：25-75μL甲醇。
本发明的同步测定样品中血管紧张素I和醛固酮含量的方法包括通过液相色谱串联质谱分析经固相萃取处理的样品，确定其中Ang I的量与Ald的量。
本发明的同步测定样品中Ang I和Ald含量的方法包括通过液相色谱串联质谱分析经固相萃取处理的样品，确定其中Ang I含量与Ald含量。
本文中，术语“色谱”或“色谱法”是指将由液体或气体运载的化学混合物分离为不同组分的过程，所述分离是因不同化学物质流经固定液相或固相时的差异分布而引起的。术语“液相色谱”(Liquid chromatography，LC)是指在流动相均匀地渗滤通过细碎物的柱或渗滤通过毛细管通道时，流动相中一种或多种组分的选择性延迟。延迟由流动相对于固定相(一种或多种)移动时混合物组分在一种或多种固定相与流动相之间的差异分布而引起的。利用“液相色谱”的分离技术的示例包括：反相液相色谱法(RPLC)、高效液相色谱法(HPLC)和湍流液相色谱法(TFLC)(有时被称为高湍流液相色谱法(HTLC)或高通量液相色谱法)。
在一些实施方式中，液相色谱串联质谱分析包括采用液相色谱仪进行液相色谱分析。在一些实施方式中，液相色谱可以是高效液相色谱(HPLC)。在一些实施方式中，液相色谱可以是反相高效液相色谱。在一些示例性的实施方式中，可采用的液相色谱仪可包括Jasper色谱仪、1260Infinity LC，ACQUITY UPLC I-Class等，以及性能等同或更高的其它液相色谱仪。在一些示例性的实施方式中，液相色谱可配备有C18，C8，五氟苯基等基于反相保留(非极性作用力)的色谱柱。在一些示例性的实施方式中，液相色谱可配备有KinetexC18 2.6μm(100×2.1mm)色谱柱、Waters BEH系列，如BEH C8 1.7um(2.1×50mm)，Phenomenex Kinetex、Gemini系列色谱柱等，以及性能等同或更高的其它色谱柱。在一些实施方式中，液相色谱可采用0.03％的甲酸水溶液和甲醇和/或乙腈作为流动相，用于梯度洗脱。
本文中，术语“质谱”(Mass spectrum，MS)指通过化合物的质量进行物质识别的分析技术。MS指基于其质荷比或“m/z”过滤、检测和测量离子的方法。MS技术一般包括：(1)电离化合物，形成带电化合物；和(2)测量带电化合物的分子量，并计算质荷比。可通过任何适当的方法电离和检测化合物。“质谱仪”一般包括电离器和离子检测器。总体上，电离一种或多种目标分子，随后将离子引入质谱装置，其中，由于磁场和电场的组合，离子沿取决于质量(“m”)和电荷(“z”)的空间路径行进。
在一些实施方式中，液相色谱串联质谱分析包括采用质谱仪进行质谱分析，例如，串联质谱分析。所述质谱仪一般包含电离已分级样品和产生带电分子以用于进一步分析的离子源。在一些实施方式中，质谱可采用电喷雾离子化模式进行。本文中，“电喷雾离子化”(ESI)一般指如下过程：溶液沿短毛细管通过时对其末端施加高的正电压或负电压；到达管末端的溶液被蒸发(雾化)为溶剂蒸气中的极小溶液液滴的喷射流或喷雾；该液滴雾流经蒸发室，加热该蒸发室以防止冷凝和蒸发溶剂；随液滴变小，表面电荷密度增加，直至相同电荷间的天然排斥造成离子和中性分子被释放。在一些示例性的实施方式中，可采用的质谱仪包括SCIEX 4500MD、6500+、Waters TQS质谱仪，以及性能等同或更高的其它质谱仪。
本发明方法中，通过应用“串联质谱法”或“MS/MS”提高MS技术的选择性。在该技术中，可在MS装置中过滤从目标分子生成的前体离子(也被称为母离子)，随后将前体离子碎片化，生成一种或更多种碎片离子(也被称为子离子或产物离子)，碎片离子随后在质量分析器中被分析。通过前体离子的仔细选择，仅由某些分析物生成的离子被送至碎裂室，在碎裂室与惰性气体原子的碰撞生成碎片离子。由于前体离子和碎片离子均于给定电离/碎裂条件组下以可重现方式生成，MS/MS技术可提供极有力的分析工具。例如，可应用过滤/碎裂的结合去除干扰物质，并且过滤/碎裂的结合在复杂样本如生物样本中尤其有用。
一般而言，本文所述方法质谱采用基于三重四极杆串联构成的质谱分析器。一些合适的示例包括但不限于，SCIEX公司的4500MD系统、6500+系统，Waters的TQ-XS等。
质谱仪一般提供离子扫描；即，在给定范围内(例如，100-1000amu)具有具体质/荷的各离子的相对丰度。随后，将分析物组分分析(即质谱)结果关联于原样本中分析物的量。在一些实施方式中，质谱采用正离子模式和负离子模式切换的方式扫描。本文中，术语“正离子模式”指生成和检测正离子的质谱法；类似地，术语“负离子模式”指生成和检测负离子的质谱法。在一些实施方式中，针对Ang I使用正离子模式，针对Ald使用负离子模式。
经长期研究设计发现，本文所述的方法能够在一次进样检测中完成针对Ang I的正离子扫描和针对Ald的负离子扫描，将正负离子扫描整合在同一检测步骤中。采用正负离子扫描来检测Ang I和Ald两种目标物质的本文所述方法，既能实现目标物质和干扰物较好的分离，又能使目标物峰型和响应不受影响，为同步检测两种目标物质提供了条件。
在一些实施方式中，正离子模式和负离子模式扫描可分段进行。在这样的实施方式中，可在两种待测物质(例如，血管紧张素I与醛固酮)检出(例如出峰)时间之间进行正离子模式和负离子模式的切换。在一些示例性的实施方式中，可在血管紧张素I检出(例如出峰)结束后、醛固酮检出(例如出峰)开始前进行正离子模式和负离子模式的切换。在一些示例性的实施方式中，质谱在第2.2-2.4分钟从正离子模式切换为负离子模式。
在一些实施方式中，正离子模式和负离子模式的切换可以高频周期性进行。在这样的实施方式中，质谱可在正离子模式和负离子模式之间快速切换，例如，以短时间周期(例如，15毫秒)切换，实现正负离子的同步扫描。
在一些实施方式中，质谱可采用外标法进行。在这样的实施方式中，质谱可采用分析物标准品(例如Ang I标准品、Ald标准品)，并基于由该分析物标准品生成的离子建立标准曲线。本领域技术人员能够理解，用于建立标准曲线的分析物标准品的浓度梯度是给定的。利用这样的标准曲线，有利于由测得的信号值得到样品中物质的实际含量。
在一些实施方式中，质谱可采用内标法进行。在这样的实施方式中，质谱可采用分析物标准品(例如Ang I标准品、Ald标准品)，并将分析物标准品添加至待分析的样品中一同分析。这样的分析物标准品也可被称为“内标”或“内标物”。本领域技术人员能够理解，用于作为内标物的标准品的浓度是给定的。利用这样的内标物，能够消除实验间以及基质等造成的误差，有利于由测得的信号值得到样品中物质的实际含量。在一些示例性的实施方式中，可采用同位素标记的分析物组分(例如同位素标记的血管紧张素I、同位素标记的醛固酮)作为内标物。在一些示例性的实施方式中，Ang I的内标物浓度可以是30-60ng/mL，例如35-55ng/mL，例如40ng/mL。在一些示例性的实施方式中，Ald的内标物浓度可以是40-70ng/mL，例如45-65ng/mL，例如50ng/mL。
在一些实施方式中，质谱可针对各分析物组分使用特异性离子对。在一些示例性的实施方式中，质谱可采用如表1-1所示的针对Ald和Ang I的离子对：
表1-1.Ald和Ang I的离子对信息
Figure BDA0002665716810000101
在一些示例性的实施方式中，质谱可采用如表1-2所示的针对Ald内标物(Ald-IS)和Ang I内标物(Ang I-IS)的离子对：
表1-2.Ald-IS和Ang I-IS的离子对信息
Figure BDA0002665716810000102
在一些示例性的实施方式中，质谱可采用如表1-3所示的针对Ald和Ang I的两对离子对：
表1-3.Ald和Ang I的离子对信息
Figure BDA0002665716810000103
在一些示例性的实施方式中，质谱可采用如表1-4所示的针对Ald内标物(Ald-IS)和Ang I内标物(Ang I-IS)的两对离子对：
表1-4.Ald-IS和Ang I-IS的离子对信息
Figure BDA0002665716810000104
通过对质谱通道进行优化，例如采用两对离子对，有利于同时实现定量和定性的功能，可通过对两者之间的比值来监控实际样品是否存在干扰。
在一些示例性的实施方式中，可采用如下质谱条件：雾化气40-55psi，辅助加热气35-60psi，气帘气30-50psi，离子源温度420-680℃，正离子模式喷雾电压5500V，负离子模式喷雾电压-4500V。在一些示例性的实施方式中，可采用如下质谱条件：雾化气40-55psi，辅助加热气40-60psi，气帘气30-40psi，离子源温度450-650℃，正离子模式喷雾电压5500V，负离子模式喷雾电压-4500V。在一些示例性的实施方式中，可采用如下质谱条件：雾化气45psi，辅助加热器40psi，气帘气30psi，离子源温度500℃，正离子模式喷雾电压5500V，负离子模式喷雾电压-4500V。
质谱分析所得的数据可被传递至计算机，通过分析物组分(例如，Ang I、Ald、相应内标物)的测定值，任选地对照相应标准曲线，可确定样品中分析物组分Ang I、Ald的量。
另一方面，本发明提供一种用于同步测定样品中血管紧张素I(Ang I)和醛固酮(Ald)含量的系统。
在一些实施方式中，样品可包括生物样品、衍生自生物的样品或含分析物组分的样品，例如，包含血管紧张素I和醛固酮的任何样品。在一些示例性的实施方式中，样品包括选自下组的一种或多种：血液、血浆、血清、淋巴液、组织间隙液、脑脊液，它们的衍生物，和标准品样品。在一些实施方式中，样品可包括血浆样品和标准品样品。
本发明的用于同步测定样品中Ang I和Ald含量的系统包括固相萃取模块，所述固相萃取模块具有固相萃取装置。在一些实施方式中，固相萃取装置可以是反相固相萃取装置(例如，反相固相萃取柱)。在一些实施方式中，固相萃取模块可包括反相固相萃取装置或反相/离子交换混合固相萃取装置。在一些示例性的实施方式中，固相萃取模块可采用极性增强聚合物柱(PEP)(如官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱)或亲水亲油平衡柱(HLB)。
在一些实施方式中，固相萃取模块可经配置以用于对固相萃取装置进行上样、淋洗、洗脱操作。在一些实施方式中，固相萃取模块可经配置以用于对固相萃取装置进行活化、平衡、上样、淋洗、洗脱操作。在一些实施方式中，固相萃取模块可经配置以用于对固相萃取装置进行一次或多次(例如，两次、三次、四次)淋洗操作。
在一些实施方式中，固相萃取模块可包括用于固相萃取装置的相应试剂。在一些实施方式中，固相萃取模块可包括用于上样、淋洗、洗脱的试剂。在一些实施方式中，固相萃取模块还可包括用于(例如，上样前)柱活化的试剂。在一些实施方式中，用于柱活化的试剂包括甲醇。在一些实施方式中，固相萃取模块还可包括用于(例如，上样前)柱平衡的试剂。在一些实施方式中，用于柱平衡的试剂可包括纯水或甲酸水溶液(例如，浓度不高于5％、不高于4％、不高于3％、不高于2％或不高于1％的甲酸水溶液)。在一些实施方式中，固相萃取模块可包括用于活化、平衡、上样、淋洗、洗脱的试剂。在一些实施方式中，固相萃取模块可包括不同的用于进行一次或多次(例如，两次、三次、四次)淋洗的试剂。在一些实施方式中，用于进行淋洗的试剂可包括甲醇水溶液和正己烷。在一些实施方式中，用于进行淋洗的试剂可包括20％-30％的甲醇水溶液和正己烷。在一些实施方式中，固相萃取模块还可包括用于洗脱样品的试剂。在一些实施方式中，用于洗脱样品的试剂可包括甲醇。
在一些实施方式中，固相萃取模块可包括气流吹扫装置，用于在合适时对固相萃取装置进行吹扫。在一些实施方式中，所述气流吹扫装置能够提供高于0.1MPa的大气流。
在一些实施方式中，用于同步测定样品中血管紧张素I和醛固酮含量的系统还可包括离心装置，用于在固相萃取前对样品进行离心处理，以移除样品中的较大杂质。在一些实施方式中，所述离心装置可包括在固相萃取模块中。
在一些示例性的实施方式中，固相萃取模块可经配置以用于对固相萃取装置进行：
活化：甲醇；
平衡：1％甲酸水溶液；
上样：取样品上样；
淋洗1：20％甲醇水溶液；
淋洗2：正己烷；
任选地，大气流吹干柱；
洗脱：甲醇。
在一个更具体的示例性实施方式中，固相萃取模块可经配置以用于对固相萃取装置进行：
活化：200-750μL甲醇；
平衡：200-750μL 1％甲酸水溶液；
上样：取样品上样；
淋洗1：200-750μL 20％甲醇水溶液；
淋洗2：200-750μL正己烷；
任选地，0.2MPa大气流吹干柱5分钟；
洗脱：25-75μL甲醇。
本发明的用于同步测定样品中Ang I和Ald含量的系统包括液相色谱串联质谱模块，其具有配备有色谱柱的液相色谱分析装置，和串联质谱分析装置，所述液相色谱串联质谱模块经配置以分析经固相萃取模块处理的样品，用于确定其中Ang I的量和/或Ald的量。
在一些实施方式中，液相色谱串联质谱模块包括液相色谱分析装置。在一些实施方式中，液相色谱分析装置为液相色谱仪。在一些实施方式中，液相色谱分析装置可以是高效液相色谱仪。在一些实施方式中，液相色谱分析装置可包括反相高效液相色谱仪。在一些示例性的实施方式中，液相色谱分析装置可包括Jasper色谱仪、1260Infinity LC，ACQUITYUPLC I-Class色谱仪，以及性能等同或更高的其它液相色谱仪。在一些示例性的实施方式中，液相色谱仪可配备有C18，C8，五氟苯基等基于反相保留(非极性作用力)的色谱柱。在一些示例性的实施方式中，液相色谱仪可配备有Kinetex C18 2.6μm(100×2.1mm)色谱柱、Waters BEH系列，如BEH C8 1.7um(2.1×50mm)，Phenomenex Kinetex、Gemini系列色谱柱等，以及性能等同或更高的其它色谱柱。在一些实施方式中，液相色谱串联质谱模块还可包括用于液相色谱仪的流动相。在一些实施方式中，流动相可采用0.03％的甲酸水溶液和甲醇和/或乙腈以用于梯度洗脱。
在一些实施方式中，液相色谱串联质谱模块包括质谱分析装置，例如质谱仪。在一些实施方式中，质谱分析装置可包括串联质谱分析装置。在一些实施方式中，质谱分析装置可被设置为具有电喷雾离子化模式。在一些示例性的实施方式中，液相色谱串联色谱模块中可采用的质谱分析装置包括SCIEX 4500MD、6500+、Waters TQ-XS质谱仪，以及性能等同或更高的其它质谱仪。
在一些实施方式中，质谱分析装置可被设置为具有正离子模式和负离子模式切换的扫描方式。在一些实施方式中，针对Ang I使用正离子模式，针对Ald使用负离子模式。
在一些实施方式中，质谱分析装置可被设置以分段进行正离子模式和负离子模式扫描。在这样的实施方式中，可在两种待测物质(例如，血管紧张素I与醛固酮)检出(例如出峰)时间之间进行正离子模式和负离子模式的切换。在一些示例性的实施方式中，质谱分析装置可被设置以在血管紧张素I检出(例如出峰)结束后、醛固酮检出(例如出峰)开始前进行正离子模式和负离子模式的切换。在一些示例性的实施方式中，质谱分析装置可被设置以在检测第2.2-2.4分钟从正离子模式切换为负离子模式。
在一些实施方式中，质谱分析装置可被设置以高频周期性进行正离子模式和负离子模式的切换。在这样的实施方式中，质谱分析装置可被设置以在正离子模式和负离子模式之间快速切换，例如，以短时间周期(例如，15毫秒)切换，实现正负离子的同步扫描。
在一些实施方式中，液相色谱串联色谱模块可包括用于外标测定的分析物标准品(例如，Ang I标准品、Ald标准品)。在这样的实施方式中，所述分析物标准品具有给定梯度浓度以用于生成标准曲线。利用这样的标准曲线，有利于由测得的信号值得到样品中物质的实际含量。
在一些实施方式中，液相色谱串联质谱模块可包括用于内标测定的分析物标准品(例如，Ang I标准品、Ald标准品)。在这样的实施方式中，所述分析物标准品具有给定浓度。所述分析物标准品可被添加至待分析的样品中一同分析。这样的分析物标准品也可被称为“内标”或“内标物”。利用这样的内标物，能够消除实验间以及基质等造成的误差，有利于由测得的信号值得到样品中物质的实际含量。在一些示例性的实施方式中，所述内标物可以是同位素(例如氘)标记的分析物组分(例如同位素标记的血管紧张素I、同位素标记的醛固酮)。在一些示例性的实施方式中，Ang I的内标物浓度可以是30-60ng/mL，例如35-55ng/mL，例如40ng/mL。在一些示例性的实施方式中，Ald的内标物浓度可以是40-70ng/mL，例如45-65ng/mL，例如50ng/mL。
在一些实施方式中，液相色谱串联质谱模块可包括针对各分析物组分设计的特异性离子对。在一个示例性的实施方式中，液相色谱串联质谱模块可经配置以包括如本文表1-1所示的针对Ald和Ang I的离子对。在一些示例性的实施方式中，液相色谱串联质谱模块可经配置以包括如本文表1-2所示的针对Ald内标物(Ald-IS)和Ang I内标物(Ang I-IS)的离子对。在一些示例性的实施方式中，液相色谱串联质谱模块可经配置以包括如表1-3所示的针对Ald和Ang I的两对离子对。在一些示例性的实施方式中，液相色谱串联质谱模块可经配置以包括如表1-4所示的针对Ald内标物(Ald-IS)和Ang I内标物(Ang I-IS)的两对离子对。
在一些示例性的实施方式中，液相色谱串联质谱模块可经配置以具有如下质谱条件或以如下质谱条件运行：雾化气40-55psi，辅助加热气35-60psi，气帘气30-5psi，离子源温度420-680℃，正离子模式喷雾电压5500V，负离子模式喷雾电压-4500V。在一些示例性的实施方式中，液相色谱串联质谱模块可经配置以具有如下质谱条件或以如下质谱条件运行：雾化气40-55psi，辅助加热气40-60psi，气帘气30-40psi，离子源温度450-650℃，正离子模式喷雾电压5500V，负离子模式喷雾电压-4500V。在一些示例性的实施方式中，液相色谱串联质谱模块可经配置以具有如下质谱条件或以如下质谱条件运行：雾化气45psi，辅助加热器40psi，气帘气30psi，离子源温度500℃，正离子模式喷雾电压5500V，负离子模式喷雾电压-4500V。
在一些实施方式中，液相色谱串联质谱模块可与固相萃取模块耦合。在一些实施方式中，液相色谱串联质谱模块可与固相萃取模块流体和/或电子连通。
在一些实施方式中，用于同步测定样品中血管紧张素I和醛固酮含量的系统还可任选地包括计算模块，用于接收并计算液相色谱串联质谱模块分析所得数据。在一些实施方式中，计算模块可具有存储器和处理器。在一些实施方式中，所述存储器可接收并存储样品中分析物组分(例如，Ang I、Ald、任选的内标物等)的量的数据，和处理器可执行的指令。在一些实施方式中，所述处理器可执行的指令配置为：通过分析物组分(例如Ang I、Ald、任选的内标物等)的测定值，任选地对照相应标准曲线，确定样品中分析物组分Ang I、Ald的量。
在一些实施方式中，计算模块可与液相色谱串联质谱模块耦合。在一些实施方式中，计算模块可与液相色谱串联质谱模块电子连通。
在另一方面，本发明提供一种获得样品中醛固酮(Ald)含量与肾素活性(PRA)比值(ARR)的方法。
在一些实施方式中，样品可包括生物样品、衍生自生物的样品或含分析物组分的样品，例如，包含血管紧张素I和醛固酮的任何样品。样品的一般实例包括：血液、血浆、血清、淋巴液、组织间隙液、脑脊液，它们的衍生物等分析样品，以及标准品样品等。在一些实施方式中，样品可包括血浆样品和标准品样品。
本发明的获得样品中ARR的方法包括孵育样品。在一些实施方式中，孵育在适于样品中的肾素生成血管紧张素1的条件下进行。在一些实施方式中，孵育在包含如下物质的孵育体系的存在下进行：苯甲基磺酰氟(PMSF)、大豆丝氨酸蛋白酶抑制剂(SBIT)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)和乙酸。在一些示例性的实施方式中，孵育体系可以是包含0.2-1.5M Tris-Base、0.05-0.5M EDTA、0.5-1.6mM PMSF、0.05-2.0mg/mLSBIT，pH 5.45-5.55的水性体系。例如，在一个具体实施方式中，孵育体系可以是包含1MTris-Base、0.2M EDTA，1mM PMSF，0.3mg/mL SBIT，pH 5.45-5.5的水性体系。
EDTA作为一个金属蛋白酶抑制剂，能够作用于血管紧张素转化酶，抑制血管紧张素I向血管紧张素II的转化。PMSF和SBIT的主要作用是避免血管紧张素I在丝氨酸蛋白酶的存在下，产生的降解。在一些实施方式中，孵育可在30至39℃的温度范围进行，例如，在约32至约39℃、约35至约39℃，例如约37℃进行。在一些实施方式中，孵育可进行约1至20小时，例如约1至18小时、约1至15小时、约1至10小时、约1至5小时等。在一些实施方式中，孵育可进行至少0.5小时、至少1小时、至少1.5小时、至少2小时、至少2.5小时、至少3小时的时间。在一些实施方式中，孵育可进行不超过6小时、不超过5小时、不超过4小时、不超过3小时、不超过2小时的时间。
在一些实施方式中，如果孵育约5小时后没有生成令人满意的PRA的量，则可将孵育时间延长，例如，延长至约18小时，从而允许得到更多的Ang I产物，适于后续仪器检测和调整灵敏度。
在一些实施方式中，本发明的获得样品中ARR的方法可包括向样品添加终止剂以终止孵育。在一些实施方式中，终止剂包括选自下组的一种或多种：甲酸、乙酸、氨水、乙腈、甲醇及其两种或更多种的混合物。
本发明的获得样品中ARR的方法包括固相萃取。固相萃取作为样品处理步骤，主要用于样品的分离、纯化和浓缩。在一些实施方式中，固相萃取包括对经本文所述孵育和/或未经本文所述孵育的样品进行固相萃取。在一些实施方式中，固相萃取可采用反相固相萃取模式。在一些实施方式中，固相萃取可包括反相固相萃取装置(例如反相固相萃取柱)。在一些实施方式中，固相萃取可包括反相固相萃取装置(例如反相固相萃取柱)或反相/离子交换混合固相萃取装置(例如，反相/离子交换混合固相萃取柱，如强阴离子交换SPE柱)。在一些示例性的实施方式中，固相萃取采用极性增强聚合物柱(PEP)(如官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱)或亲水亲油平衡柱(HLB)等。
在一些实施方式中，固相萃取可包括上样、淋洗、洗脱步骤。在一些实施方式中，固相萃取还可包括(例如，上样前)柱活化的步骤。在一些实施方式中，所述活化可采用甲醇进行。在一些实施方式中，固相萃取还可包括(例如，上样前)柱平衡的步骤。在一些实施方式中，所述平衡可采用纯水或甲酸水溶液(例如，浓度不高于5％、不高于4％、不高于3％、不高于2％或不高于1％的甲酸水溶液)进行。在一些实施方式中，固相萃取可包括活化、平衡、上样、淋洗、洗脱步骤。在一些实施方式中，固相萃取可包括一次或多次(例如，两次、三次、四次)淋洗。在一些实施方式中，固相萃取可包括采用甲醇水溶液和正己烷进行两次或更多次淋洗。在一些实施方式中，固相萃取可包括采用20％-30％的甲醇水溶液和正己烷进行两次或更多次淋洗。在一些实施方式中，固相萃取还可任选地包括用大气流吹干柱。在一些实施方式中，固相萃取可包括洗脱样品。在一些实施方式中，样品的洗脱采用甲醇进行。
在一些实施方式中，样品可在固相萃取前经离心处理，以移除样品中的较大杂质。
在一些示例性的实施方式中，固相萃取可包括采用固相萃取装置进行：
活化：甲醇；
平衡：1％甲酸水溶液；
上样：取样品上样；
淋洗1：20％甲醇水溶液；
淋洗2：正己烷；
任选地，大气流吹干柱；
洗脱：甲醇。
在一些示例性的实施方式中，固相萃取可包括采用固相萃取装置进行：
活化：200-750μL甲醇；
平衡：200-750μL 1％甲酸水溶液；
上样：取样品上样；
淋洗1：200-750μL 20％甲醇水溶液；
淋洗2：200-750μL正己烷；
任选地，0.2MPa大气流吹干柱5分钟；
洗脱：25-75μL甲醇。
本发明的获得样品中ARR的方法包括通过液相色谱串联质谱分析经固相萃取处理的样品，确定其中Ang I的量与Ald的量。
在一些实施方式中，液相色谱串联质谱分析包括采用液相色谱仪进行液相色谱分析。在一些实施方式中，液相色谱可以是高效液相色谱(HPLC)。在一些实施方式中，液相色谱可以是反相高效液相色谱。在一些示例性的实施方式中，可采用的液相色谱仪包括Jasper色谱仪、1260Infinity LC，ACQUITY UPLC I-Class色谱仪等，以及性能等同或更高的其它液相色谱仪。在一些示例性的实施方式中，液相色谱可配备有C18，C8，五氟苯基等基于反相保留(非极性作用力)的色谱柱。在一些示例性的实施方式中，液相色谱可配备有Kinetex C18 2.6μm(100×2.1mm)色谱柱、Waters BEH系列，如BEH C8 1.7um(2.1×50mm)，Phenomenex Kinetex、Gemini系列色谱柱等，以及性能等同或更高的其它色谱柱。在一些实施方式中，液相色谱可采用0.03％的甲酸水溶液和甲醇和/或乙腈作为流动相，用于梯度洗脱。
在一些实施方式中，液相色谱串联质谱分析包括采用质谱仪进行质谱分析，例如串联质谱分析。所述质谱仪一般包含电离已分级样品和产生带电分子以用于进一步分析的离子源。在一些实施方式中，质谱可采用电喷雾离子化模式进行。在一些示例性的实施方式中，可采用的质谱仪包括SCIEX 4500MD、6500+、Waters TQ-XS质谱仪，以及性能等同或更高的其它质谱仪。
在一些实施方式中，质谱采用正离子模式和负离子模式切换的方式扫描。在一些实施方式中，针对Ang I使用正离子模式，针对Ald使用负离子模式。
在一些实施方式中，正离子模式和负离子模式扫描可分段进行。在这样的实施方式中，可在两种待测物质(例如，血管紧张素I与醛固酮)检出(例如出峰)时间之间进行正离子模式和负离子模式的切换。在一些示例性的实施方式中，可在血管紧张素I检出(例如出峰)结束后、醛固酮检出(例如出峰)开始前进行正离子模式和负离子模式的切换。在一些示例性的实施方式中，质谱在第2.2-2.4分钟从正离子模式切换为负离子模式。
在一些实施方式中，正离子模式和负离子模式的切换可以高频周期性进行。在这样的实施方式中，质谱可在正离子模式和负离子模式之间快速切换，例如，以短时间周期(例如，15毫秒)切换，实现正负离子的同步扫描。
在一些实施方式中，质谱可采用外标法进行。在这样的实施方式中，质谱可采用分析物标准品(例如，Ang I标准品、Ald标准品)，并基于由该分析物标准品生成的离子建立标准曲线。本领域技术人员能够理解，用于建立标准曲线的分析物标准品的浓度梯度是给定的。利用这样的标准曲线，有利于由测得的信号值得到样品中物质的实际含量。
在一些实施方式中，质谱可采用内标法进行。在这样的实施方式中，质谱可采用分析物标准品(例如，Ang I标准品、Ald标准品)，并将分析物标准品添加至待分析的样品中一同分析。这样的分析物标准品也可被称为“内标”或“内标物”。本领域技术人员能够理解，用于作为内标物的标准品的浓度是给定的。利用这样的内标物，能够消除实验间以及基质等造成的误差，有利于由测得的信号值得到样品中物质的实际含量。在一些示例性的实施方式中，可采用同位素标记的分析物组分(例如同位素标记的血管紧张素I、同位素标记的醛固酮)作为内标物。在一些示例性的实施方式中，Ang I的内标物浓度可以是30-60ng/mL，例如35-55ng/mL，例如40ng/mL。在一些示例性的实施方式中，Ald的内标物浓度可以是40-70ng/mL，例如45-65ng/mL，例如50ng/mL。
在一些实施方式中，质谱可针对各分析物组分使用特异性离子对。在一些示例性的实施方式中，质谱可采用如表1-1所示的针对Ald和Ang I的离子对。在一些示例性的实施方式中，质谱可采用如表1-2所示的针对Ald内标物(Ald-IS)和Ang I内标物(Ang I-IS)的离子对。在一些示例性的实施方式中，质谱可采用如表1-3所示的针对Ald和Ang I的两对离子对。在一些示例性的实施方式中，质谱可采用如表1-4所示的针对Ald内标物(Ald-IS)和Ang I内标物(Ang I-IS)的两对离子对。
在一些示例性的实施方式中，可采用如下质谱条件：雾化气40-55psi，辅助加热气35-60psi，气帘气30-50psi，离子源温度420-680℃，正离子模式喷雾电压5500V，负离子模式喷雾电压-4500V。在一些示例性的实施方式中，可采用如下质谱条件：雾化气40-55psi，辅助加热气40-60psi，气帘气30-40psi，离子源温度450-650℃，正离子模式喷雾电压5500V，负离子模式喷雾电压-4500V。在一些示例性的实施方式中，可采用如下质谱条件：雾化气45psi，辅助加热器40psi，气帘气30psi，离子源温度500℃，正离子模式喷雾电压5500V，负离子模式喷雾电压-4500V。
在一些实施方式中，本发明的方法可包括将液相色谱串联质谱分析所得的数据传递至计算机，通过分析物组分(例如，Ang I、Ald、相应内标物等)的测定值，任选地对照相应标准曲线，可确定样品中分析物组分Ang I、Ald的量。
在一些实施方式中，所述方法还可包括测定未经本文所述孵育的样品的Ang I含量。在一些示例性的实施方式中，本发明的方法还可包括通过与上文所述相同但不含孵育步骤的方法测定未经本文所述孵育的样品的Ang I含量。
本发明的获得样品中醛固酮(Ald)含量与肾素活性(PRA)比值(ARR)的方法包括根据式(I)计算肾素活性(PRA)：
Figure BDA0002665716810000201
其中C1AngI为经本文所述孵育的样品的Ang I含量(例如，可以是经本文所述孵育、固相萃取处理、液相色谱串联质谱分析的样品的Ang I含量)，C0AngI为未经本文所述孵育的样品的Ang I含量(例如，可以是未经本文所述孵育、经固相萃取处理、液相色谱串联质谱分析的样品的Ang I含量)，t为样品孵育时间。
在一些实施方式中，C1AngI为经本文所述孵育的样品的Ang I含量，该样品可以是来自于同一原始样品(例如同次采集的血样，例如同次采集的血浆样品)的第一等分试样，C0AngI为未经本文所述孵育的样品的Ang I含量，该样品可以是来自于同一原始样品(例如同次采集的血样，例如同次采集的血浆样品)的第二等分试样。在一些实施方式中，C1AngI为经本文所述孵育的样品的Ang I含量，其由样品经本文所述孵育、固相萃取处理并经液相色谱串联质谱检测获得。在一些实施方式中，C0AngI为未经本文所述孵育的样品的Ang I含量，其由样品不经本文所述孵育、经固相萃取处理并经液相色谱串联质谱检测获得。在一些实施方式中，未经本文所述孵育的样品的Ang I含量可通过采用本文所述方法但不经孵育处理而获得。
所述方法中，可由这些确定量计算在给定时间内血管紧张素1形成的速率，即，在样本孵育期间形成的血管紧张素I的量。该速率指示样品中的肾素活性。
本发明的获得样品中ARR的方法包括根据式(II)计算ARR：
Figure BDA0002665716810000202
其中CAld为经本文所述孵育的样品的Ald含量(例如，可以是经本文所述孵育、固相萃取处理、液相色谱串联质谱分析的样品的Ald含量)，PRA经上述式(I)计算所得。
在一些实施方式中，式(II)中CAld以ng/dL为单位计，PRA以ng/mL/h为单位计。
在另一方面，本发明提供一种用于获得样品中醛固酮(Ald)含量与肾素活性(PRA)比值(ARR)的系统。
在一些实施方式中，样品可包括生物样品、衍生自生物的样品或含分析物组分的样品，例如，包含血管紧张素I和醛固酮的任何样品。在一些示例性的实施方式中，样品包括选自下组的一种或多种：血液、血浆、血清、淋巴液、组织间隙液、脑脊液，它们的衍生物，和标准品样品。在一些实施方式中，样品可包括血浆样品和标准品样品。
在一些实施方式中，所述用于获得样品中ARR的系统包括孵育模块。在一些实施方式中，孵育模块可具有孵育腔室。所述孵育腔室可包括，例如，具有固体材料壁的容器，如各类带有或不带有盖体的管状、瓶状、皿状、盒状、袋装或不规则形状的容器等，和/或不具有固体材料壁的腔室，如液滴、液体膜组成的腔室等。在一些实施方式中，孵育模块还可具有一种或多种孵育试剂。所述一种或多种孵育试剂可被合并或分开储存于独立于孵育腔室的一个或多个储存腔室中。所述一个或多个储存腔室经配置以允许在孵育时或孵育前即刻向孵育腔室提供孵育试剂。在一些实施方式中，孵育试剂可包括具有如下物质的孵育体系：苯甲基磺酰氟(PMSF)、大豆丝氨酸蛋白酶抑制剂(SBIT)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)和乙酸。在一些示例性的实施方式中，孵育体系可以是包含0.2-1.5MTris-Base、0.05-0.5M EDTA、0.5-1.6mM PMSF、0.05-2.0mg/mL SBIT，pH 5.45-5.55的水性体系。例如，在一个具体实施方式中，孵育体系可以是包含1M Tris-Base、0.2M EDTA，1mMPMSF，0.3mg/mL SBIT，pH 5.45-5.5的水性体系。在一些实施方式中，孵育模块可经配置以在适于样品中的肾素生成血管紧张素1的条件下进行样品孵育。在一些实施方式中，孵育模块可经配置以在30至39℃的温度范围进行样品孵育，例如，在约32至约39℃、约35至约39℃，例如约37℃进行样品孵育。在一些实施方式中，孵育模块可经配置以进行约1至20小时，例如约1至18小时、约1至15小时、约1至10小时、约1至5小时时长的样品孵育。在一些实施方式中，孵育模块可经配置以进行至少0.5小时、至少1小时、至少1.5小时、至少2小时、至少2.5小时、至少3小时时长的样品孵育。在一些实施方式中，孵育模块可经配置以进行不超过6小时、不超过5小时、不超过4小时、不超过3小时、不超过2小时时长的样品孵育。在一些实施方式中，如果孵育约5小时后没有生成令人满意的PRA的量，则可设置孵育模块以将孵育时间延长，例如，延长至约18小时，从而允许得到更多的Ang I产物，适于后续仪器检测和调整灵敏度。
在一些实施方式中，所述用于获得样品中ARR的系统还可包括一种或多种终止剂。所述一种或多种终止剂可被合并或分开储存于独立于孵育腔室的一个或多个储存腔室中。所述一个或多个储存腔室经配置以允许在需要终止孵育时或向孵育腔室提供终止剂。在一些实施方式中，所述终止剂包括选自下组的一种或多种：甲酸、乙酸、氨水、乙腈、甲醇及其两种或更多种的混合物。
在一些实施方式中，所述用于获得样品中ARR的系统包括固相萃取模块。在一些实施方式中，所述固相萃取模块经配置以对经孵育模块处理和/或未经孵育模块处理的样品进行固相萃取。在一些实施方式中，所述固相萃取模块可具有固相萃取装置。在一些实施方式中，固相萃取装置可以是反相固相萃取装置(例如，反相固相萃取柱)。在一些实施方式中，固相萃取模块可包括反相固相萃取装置或反相/离子交换混合固相萃取装置。在一些示例性的实施方式中，固相萃取模块可采用极性增强聚合物柱(PEP)(如官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱)或亲水亲油平衡柱(HLB)。
在一些实施方式中，固相萃取模块可经配置以用于对固相萃取装置进行上样、淋洗、洗脱操作。在一些实施方式中，固相萃取模块可经配置以用于对固相萃取装置进行活化、平衡、上样、淋洗、洗脱操作。在一些实施方式中，固相萃取模块可经配置以用于对固相萃取装置进行一次或多次(例如，两次、三次、四次)淋洗操作。
在一些实施方式中，固相萃取模块可包括用于固相萃取装置的相应试剂。在一些实施方式中，固相萃取模块可包括用于上样、淋洗、洗脱的试剂。在一些实施方式中，固相萃取模块还可包括用于(例如，上样前)柱活化的试剂。在一些实施方式中，用于柱活化的试剂包括甲醇。在一些实施方式中，固相萃取模块还可包括用于(例如，上样前)柱平衡的试剂。在一些实施方式中，用于柱平衡的试剂可包括纯水或甲酸水溶液(例如，浓度不高于5％、不高于4％、不高于3％、不高于2％或不高于1％的甲酸水溶液)。在一些实施方式中，固相萃取模块可包括用于活化、平衡、上样、淋洗、洗脱的试剂。在一些实施方式中，固相萃取模块可包括用于进行一次或多次(例如，两次、三次、四次)淋洗的不同试剂。在一些实施方式中，用于进行淋洗的试剂可包括甲醇水溶液和正己烷。在一些实施方式中，用于进行淋洗的试剂可包括20％-30％的甲醇水溶液和正己烷。在一些实施方式中，固相萃取模块还可包括用于洗脱样品的试剂。在一些实施方式中，用于洗脱样品的试剂可包括甲醇。
在一些实施方式中，固相萃取模块可包括气流吹扫装置，用于在合适时对固相萃取装置进行吹扫。在一些实施方式中，所述气流吹扫装置能够提供高于0.1MPa的大气流。在一些实施方式中，固相萃取模块可任选地与孵育模块耦合。在一些实施方式中，固相萃取模块可任选地与孵育模块流体和/或电子连通。
在一些实施方式中，所述用于获得样品中ARR的系统还可包括离心装置，用于在固相萃取前对样品进行离心处理，以移除样品中的较大杂质。在一些实施方式中，所述离心装置可包括在固相萃取模块中。
在一些示例性的实施方式中，固相萃取模块可经配置以用于对固相萃取装置进行：
活化：甲醇；
平衡：1％甲酸水溶液；
上样：取样品上样；
淋洗1：20％甲醇水溶液；
淋洗2：正己烷；
任选地，大气流吹干柱；
洗脱：甲醇。
在一个更具体的示例性实施方式中，固相萃取模块可经配置以用于对固相萃取装置进行：
活化：200-750μL甲醇；
平衡：200-750μL 1％甲酸水溶液；
上样：取样品上样；
淋洗1：200-750μL 20％甲醇水溶液；
淋洗2：200-750μL正己烷；
任选地，0.2MPa大气流吹干柱5分钟；
洗脱：25-75μL甲醇。
在一些实施方式中，所述用于获得样品中ARR的系统包括液相色谱串联质谱模块。在一些实施方式中，所述液相色谱串联质谱模块可具有配备有色谱柱的液相色谱分析装置，和串联质谱分析装置。所述液相色谱串联质谱模块经配置以分析经固相萃取模块处理的样品，用于确定其中Ang I的量和/或Ald的量。
在一些实施方式中，液相色谱串联质谱模块包括液相色谱分析装置。在一些实施方式中，液相色谱分析装置为液相色谱仪。在一些实施方式中，液相色谱分析装置可以是高效液相色谱仪。在一些实施方式中，液相色谱分析装置可以是反相高效液相色谱仪。在一些示例性的实施方式中，液相色谱分析装置可包括Jasper色谱仪、1260Infinity LC，或Waters ACQUITY UPLC I-Class色谱仪等，以及性能等同或更高的其它液相色谱仪。在一些示例性的实施方式中，液相色谱仪可配备有C18，C8，五氟苯基等基于反相保留(非极性作用力)的色谱柱。在一些示例性的实施方式中，液相色谱仪可配备有Kinetex C18 2.6μm(100×2.1mm)色谱柱、Waters BEH系列，如BEH C8 1.7um(2.1×50mm)，Phenomenex Kinetex、Gemini系列色谱柱等，以及性能等同或更高的其它色谱柱。在一些实施方式中，液相色谱串联质谱模块还可包括用于液相色谱仪的流动相。在一些实施方式中，流动相可采用0.03％的甲酸水溶液和甲醇和/或乙腈以用于梯度洗脱。
在一些实施方式中，液相色谱串联质谱模块包括质谱分析装置，例如质谱仪。在一些实施方式中，质谱分析装置可包括串联质谱分析装置。在一些实施方式中，质谱分析装置可被设置为具有电喷雾离子化模式。在一些示例性的实施方式中，质谱分析装置可包括SCIEX 4500MD、6500+、Waters TQ-XS质谱仪，以及性能等同或更高的其它质谱仪。
在一些实施方式中，质谱分析装置可被设置为具有正离子模式和负离子模式切换的扫描方式。在一些实施方式中，针对Ang I使用正离子模式，针对Ald使用负离子模式。
在一些实施方式中，质谱分析装置可被设置以分段进行正离子模式和负离子模式扫描。在这样的实施方式中，可在两种待测物质(例如，血管紧张素I与醛固酮)检出(例如出峰)时间之间进行正离子模式和负离子模式的切换。在一些示例性的实施方式中，质谱分析装置可被设置以在血管紧张素I检出(例如出峰)结束后、醛固酮检出(例如出峰)开始前进行正离子模式和负离子模式的切换。在一些示例性的实施方式中，质谱分析装置可被设置以在检测第2.2-2.4分钟从正离子模式切换为负离子模式。
在一些实施方式中，质谱分析装置可被设置以高频周期性进行正离子模式和负离子模式的切换。在这样的实施方式中，质谱分析装置可被设置以在正离子模式和负离子模式之间快速切换，例如，以短时间周期(例如，15毫秒)切换，实现正负离子的同步扫描。
在一些实施方式中，液相色谱串联色谱模块可包括用于外标测定的分析物标准品(例如，Ang I标准品、Ald标准品)。在这样的实施方式中，所述分析物标准品具有给定梯度浓度以用于生成标准曲线。利用这样的标准曲线，有利于由测得的信号值得到样品中物质的实际含量。
在一些实施方式中，液相色谱串联质谱模块可包括用于内标测定的分析物标准品(例如，Ang I标准品、Ald标准品)。在这样的实施方式中，所述分析物标准品具有给定浓度。所述分析物标准品(内标物)可被添加至待分析的样品中一同分析。利用这样的内标物，能够消除实验间以及基质等造成的误差，有利于由测得的信号值得到样品中物质的实际含量。在一些示例性的实施方式中，所述内标物可以是同位素(例如氘)标记的分析物组分(例如同位素标记的血管紧张素I、同位素标记的醛固酮)。在一些示例性的实施方式中，Ang I的内标物浓度可以是30-60ng/mL，例如35-55ng/mL，例如40ng/mL。在一些示例性的实施方式中，Ald的内标物浓度可以是40-70ng/mL，例如45-65ng/mL，例如50ng/mL。
在一些实施方式中，液相色谱串联质谱模块可包括针对各分析物组分设计的特异性离子对。在一个示例性的实施方式中，液相色谱串联质谱模块可经配置以包括如本文表1-1所示的针对Ald和Ang I的离子对。在一些示例性的实施方式中，液相色谱串联质谱模块可经配置以包括如本文表1-2所示的针对Ald内标物(Ald-IS)和Ang I内标物(Ang I-IS)的离子对。在一些示例性的实施方式中，液相色谱串联质谱模块可经配置以包括如表1-3所示的针对Ald和Ang I的两对离子对。在一些示例性的实施方式中，液相色谱串联质谱模块可经配置以包括如表1-4所示的针对Ald内标物(Ald-IS)和Ang I内标物(Ang I-IS)的两对离子对。
在一些示例性的实施方式中，液相色谱串联质谱模块可经配置以具有如下质谱条件或以如下质谱条件运行：雾化气40-55psi，辅助加热气35-60psi，气帘气30-50psi，离子源温度420-680℃，正离子模式喷雾电压5500V，负离子模式喷雾电压-4500V。在一些示例性的实施方式中，液相色谱串联质谱模块可经配置以具有如下质谱条件或以如下质谱条件运行：雾化气40-55psi，辅助加热气40-60psi，气帘气30-40psi，离子源温度450-650℃，正离子模式喷雾电压5500V，负离子模式喷雾电压-4500V。在一些示例性的实施方式中，液相色谱串联质谱模块可经配置以具有如下质谱条件或以如下质谱条件运行：雾化气45psi，辅助加热器40psi，气帘气30psi，离子源温度500℃，正离子模式喷雾电压5500V，负离子模式喷雾电压-4500V。
在一些实施方式中，液相色谱串联质谱模块可与固相萃取模块耦合。在一些实施方式中，液相色谱串联质谱模块可与固相萃取模块流体和/或电子连通。
在一些实施方式中，所述用于获得样品中ARR的系统包括计算模块，其经配置以接收来自液相色谱串联质谱模块的关于样品中分析物组分(例如，Ang I、Ald、任选的内标物)的量的数据。在一些实施方式中，计算模块可具有存储器和处理器。在一些实施方式中，所述存储器可经配置以接收并包含关于样品中分析物组分(例如，Ang I、Ald、任选的内标物)的量的数据，和处理器可执行的指令。在一些实施方式中，所述处理器可执行的指令可配置为：
(1)根据式(I)计算PRA：
Figure BDA0002665716810000261
其中C1AngI为经所述孵育模块孵育的样品的Ang I含量(例如，可以是经所述孵育模块孵育、所述固相萃取模块处理、所述液相色谱串联质谱模块检测的样品的Ang I含量)，C0AngI为未经所述孵育模块孵育的样品的Ang I含量(例如，可以是未经所述孵育模块孵育，经所述固相萃取模块处理、经所述液相色谱串联质谱模块检测的样品的Ang I含量)，t为样品在所述孵育模块中的孵育时间；
(2)根据式(II)计算ARR：
Figure BDA0002665716810000262
其中CAld为经所述孵育模块孵育的样品的Ald含量(例如，可以是经所述孵育模块孵育、所述固相萃取模块处理、所述液相色谱串联质谱模块检测的样品的Ald含量)，PRA经式(I)计算所得。
在一些实施方式中，式(I)中的C1AngI为经所述孵育模块孵育的样品的Ang I含量，该样品可以是来自于同一原始样品(例如同次采集的血样，例如同次采集的血浆样品)的第一等分试样；和，C0AngI为未经所述孵育模块孵育的样品的Ang I含量，该样品可以是来自于同一原始样品(例如同次采集的血样，例如同次采集的血浆样品)的第二等分试样。在一些实施方式中，C1AngI为经所述孵育模块孵育的样品的Ang I含量，其由样品经孵育模块孵育、固相萃取模块处理并经液相色谱串联质谱模块检测获得。在一些实施方式中，C0AngI为未经所述孵育模块孵育的样品的Ang I含量，其由样品不经孵育模块孵育、经固相萃取模块处理并经液相色谱串联质谱模块检测获得。在一些实施方式中，未经所述孵育模块孵育的样品的Ang I含量可通过采用本文所述系统但不经孵育模块处理而获得。
在一些实施方式中，式(II)中CAld以ng/dL为单位计，PRA以ng/mL/h为单位计。
在一些实施方式中，所述计算模块还可任选地包括如下处理器可执行的指令，其经设置为：在接收并计算质谱分析所得数据后，通过分析物组分(例如，Ang I、Ald、相应内标物等)的测定值，任选地对照相应标准曲线，确定样品中分析物组分Ang I、Ald的量。
在一些实施方式中，计算模块可与液相色谱串联质谱模块耦合。在一些实施方式中，计算模块可与液相色谱串联质谱模块电子连通。
采用本发明来处理体液样品，采用固相萃取技术进行处理，无需蛋白质沉淀，无需吹干和复溶等操作，手动或自动化操作可大大提高检测通量。在采用自动化样品处理系统的情况中，样品通量会进一步地显著提高。
生物样品中的Ang I和Ald含量不高，特别是Ald，其生理浓度极微，而且生物样品中存在许多的结构类似的代谢物及较多的内源性干扰物质，造成了测定的困难。传统的免疫测定方式一次测定只能测定一个分析物，且仍有灵敏度和特异性的问题。采用LC-MS/MS方法，同时结合样品前处理、色谱分离和质谱选择性采集的特性，拥有更好的选择性和特异性。本发明在保证方法灵敏度和特异性的基础上，实现了对醛症两个关键指标的同时检测，大大简少了临床样品用量，减少了样品重复处理可能引入的偏差，如污染、取样准确度等。我们建立的LC-MS/MS方法直接测定目标物本身，可同时检测两对离子对，专属性强，灵敏度高，有望成为未来的主流检测方法。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
实施例1Ang I和Ald的检测
(1)试剂配制
本实施例中采用的内标如下：醛固酮：Alderstone-D8，购自Cambridge IsotopeLaboratories(Cambridge，MA，USA)；血管紧张素I：Ang I-[13C6，15N4]，购自CambridgeIsotope Laboratories(Cambridge，MA，USA)。
标曲和内标储备液的配制：分别使用去离子水溶解Ang I的标准品及内标(Ang I-[13C6，15N4])标准品，得到血管紧张素I的标准品储备液和内标储备液。使用甲醇溶解醛固酮标准品及内标(Alderstone-D8)标准品，得到醛固酮的标准品储备和内标储备液。储备液一般为mg/mL级别，比如2mg/mL。储备液分装后存放于-80℃。
标曲溶液工作液的配制：使用缓冲液B，基于先前配制的储备液，配制血管紧张素I和醛固酮的标准曲线母液(20倍母液)。最终线性范围：Ang I(0.3-100ng/mL)，ALD(15-5000pg/mL)。尽可能使用高的稀释倍数，比如100倍稀释得到标准曲线工作液。例如，醛固酮标曲溶液如下配制：使用10μg/mL的醛固酮溶液，使用缓冲液B稀释100倍得到醛固酮标曲的最高点100ng/mL，随后继续用缓冲液B稀释，配制各梯度浓度的醛固酮标曲溶液工作液。对于血管紧张素I，标曲溶液工作液采用类似方式配制，最终得到含有醛固酮和/或血管紧张素I的标准溶液工作液。采用了含有牛血清白蛋白(BSA)的溶液进行Ang I相关标准溶液的配制能够避免吸附。
内标溶液的配制：内标溶液基于储备液，使用含5％甲酸的20％乙腈水配制。本次试验中建议使用的血管紧张素I和醛固酮的内标浓度分别为40和50ng/mL。
其它试剂配制：
PMSF溶液：取0.174g PMSF加入10mL甲醇，2-8℃储存。
缓冲液A：1L去离子水中加入12.11g Tris-base，用醋酸调节pH到6，2-8℃储存。
SBIT溶液：取0.3g溶解于10mL水，4℃保存。
缓冲液B：将0.1g的BSA加入到10mL缓冲液A中。
生成缓冲液：取121.1g Tris-base和74g EDTA到1000mL容量瓶中，加入去离子水到900mL，超声30min至溶解均匀，加入去离子水到刻度线，混匀，用乙酸调节pH到5.45-5.50之间，储存条件为2-8℃。
生成抑制剂：将100μL的100mM PMSF和100μL的30mg/mL SBIT溶液加入到10mL生成缓冲液中。抑制剂溶液组成包括：1M Tris-Base，0.2M EDTA，1mM PMSF，0.3mg/mL SBIT，pH5.45-5.5。
上述溶液尽量现配现用。
(2)样品前处理
样品预处理：400μL血浆+65μL抑制剂，混匀后，于37℃静置孵育3h，之后加入14μL甲酸终止反应。加入20μL内标，400μL水，混匀后，室温下离心10min(15000rpm)。取上清800μL，经5mg PEP 96孔微孔板(博纳艾杰尔科技有限公司，5mg规格)固相萃取净化。对于标曲样品，使用缓冲液B代替血浆作为标曲样品的空白基质，提取同上述过程，但不经过孵育环节。例如，一个示例性的标曲样品可含有：20μL标曲工作液+380μL缓冲液B+65μL抑制剂+14μL甲酸。
固相萃取：
活化：500μL甲醇
平衡：500μL水(含1％甲酸)
上样：取离心后样品800μL上样
淋洗1：500μL 20％甲醇淋洗
淋洗2：500μL正己烷，0.2MPa大气流吹干5分。
洗脱：50μL甲醇洗脱
SPE全程注意流速，特别是洗脱环节。微量加液，可将枪头抵至SPE上筛板操作。最终在50μL洗脱液中加入70μL水，混匀之后，取25μL进样分析。此步骤的水可以预先加入至对应的孔内，或加在SPE板中经正压压下。
(3)液相色谱质谱条件
使用Jasper串联Qtrap 6500+(SCIEX，新加坡)仪器进行分析和检测。使用kinetexC18 2.6μm(100×2.1mm)色谱柱。流动相为0.03％的甲酸水溶液(A相)和甲醇(B相)。具体梯度为：0-0.3min，20％B；0.3-0.6min，20％-35％B；0.6-2.8min，35-68％B；2.8-2.9，68％-100％B；2.9-3.8min，100％-100％B；3.8-3.9min，100％-20％B；3.9-5min，20％-20％B。总分析时间为5分钟。
图1显示通过本发明方案检测人血浆样品的Ang I和Ald的色谱图。由该图可见，经本发明方法分离的Ang I和Ald的出峰相差近1分钟，有利于实施正离子和负离子的分段扫描，且化合物峰型对称，出峰位置无干扰峰存在。
质谱采用电喷雾电离(ESI)模式，正负切换分段扫描，前2.2分钟使用正离子模式，后2.8分钟使用负离子模式。雾化气45psi，辅助加热器40psi，气帘气30psi，离子源温度500℃，正离子模式喷雾电压5500V，负离子模式-4500V。所用定量和定性离子对参见表1-3和表1-4。
(4)结果
Ang I的定量下限为0.3ng/mL，线性范围为0.3-100ng/mL，Ald的定量下限为15pg/mL，线性范围为15-5000pg/mL。在该范围内，无论是正常水平还是异常样品均可被定量检测到。具体见表2。
表2 AngI及Ald的线性回归方程，三个分析批次
分析物 线性回归方程 相关系数 批次
Ald y＝0.00279x+0.00265 0.9968 第一批次
Ald y＝0.00212x+0.00090 0.9997 第一批次
Ald y＝0.00235x+0.00404 0.9997 第二批次
AngI y＝0.33628x+0.01484 0.9990 第二批次
AngI y＝0.35550x-0.00481 0.9966 第三批次
AngI y＝0.38095x+0.01761 0.9993 第三批次
通过配置一定浓度的质控样品来检测该方法的日内和日间精密度，结果见表3，结果表明日内和日间精密度CV值均小于13.5％。
表3不同浓度样品的日内和日间精密度结果
Figure BDA0002665716810000301
通过外添加回收率试验，考察方法的准确度，结果见表4。通过在人实际血浆中添加一定浓度标准品考察了方法的加标回收率情况。表四中：未加标一栏显示的人血浆中Ald和Ang I的本底水平。加标栏显示的为Ald加标浓度230pg/mL和Ang I加标浓度4.6ng/mL的情况。结果显示加标回收率Ald为91.07％-109.42％，Ang I为98.7％-102.83％。不同来源的血清基质加标的CV小于9.73％。不同来源的血清基质效应在低高不同浓度下的CV小于3.6％，结果见表5。
表4不同浓度样品的加标回收率结果
Figure BDA0002665716810000311
表5基质效应结果
Figure BDA0002665716810000312
本发明采用固相萃取来进行样品前处理，无需复杂的净化提纯步骤，结合LC-MS/MS，可以一针进行同时分析Ang I和Ald，能很好服务于临床样品的检验。该检测方式检验特异性好，灵敏度高，并且整个流程时间短，通量高，能极大的节约耗材和时间成本。
实施例2：本发明方法用于醛固酮增多症诊断
(1)病患男性。患者主诉乏力、走路不稳，心悸、头痛、冷汗。门诊诊断为低钾血症、高血压，右侧肾占位性病变，疑似患有原发性醛固酮增多症。然而，经确诊试验判断，排除原发性醛固酮增多症导致的继发性高血压。该患者最终被诊断为低钾血症(肾性失钾)，双肾囊肿，原发性高血压。
取该患者血样(血浆)，采用本发明所述的同步测定方案进行检测。不同时间点采样测定的醛固酮和肾素活性的比值ARR结果均小于30。例示其中一次的测定结果为：醛固酮：6.24ng/dL(醛固酮的浓度最终以ng/dL为单位呈现)；肾素活性：13.8ng/mL/h，计算ARR为0.45。结果提示该患者不具有醛固酮增多症，与确诊实验判断一致。
注：本文中采用ARR比值30作为比值切点。ARR比值若小于30，则提示非原醛患者，若等于或大于30，则提示可能是原醛患者。这一比值切点引用自原发性醛固酮增多症诊断治疗的专家共识[J].中华内分泌代谢杂志,2016,32(003):188-195。该切点基于群体数据统计分析而得。因此，可按需根据不同的群体数据统计分析获得合适的诊断切点。
(2)病患男性，44岁。患者入院诊断为左侧肾上腺肿物，肾功能不全。经生理盐水输注试验(例如，可参见原发性醛固酮增多症诊断治疗的专家共识[J].中华内分泌代谢杂志，2016，32(003):188-195)确诊试验判断为原发性醛固酮增多症导致的继发性高血压。
取该患者血样(血浆)，采用本发明所述的同步测定方案进行检测。不同时间点采样测定的醛固酮和肾素活性的比值ARR结果均大于30。其中最高一次测定ARR为1771。结果提示该患者具有醛固酮增多症，与确诊实验判断一致。图2给出了该患者某一次ARR测定的图谱，该次测定得到的醛固酮含量为67ng/dL，肾素活性为0.114ng/mL/h，计算得到的ARR比值为587。
患者经手术治疗后，对其再次采集血样(血浆)，并采用本发明所述的同步测定方案进行ARR测定。经测定，醛固酮和肾素活性的比值ARR指标回复正常(小于30)。提示该患者原醛症缓解或消除。
应当理解，以上实施例仅仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明的保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离本发明的范围和实质下，可以对本发明的技术方案进行各种修改或者等同替换。

Claims (10)

1.一种同步测定样品中血管紧张素I(Ang I)和醛固酮(Ald)含量的方法，包括：
(a)固相萃取处理样品；和
(b)通过液相色谱串联质谱分析经(a)处理的样品，确定其中Ang I的量与Ald的量；
其中，所述质谱采用正离子模式和负离子模式切换的方式扫描。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述固相萃取采用反相固相萃取模式。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述固相萃取包括上样、淋洗、洗脱步骤；在一些实施方式中，所述固相萃取包括一次或多次(例如，两次)淋洗。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述液相色谱为反相高效液相色谱。
5.一种用于同步测定样品中血管紧张素I(Ang I)和醛固酮(Ald)含量的系统，包括：
(i)固相萃取模块，其具有固相萃取装置和用于固相萃取装置的试剂；
(ii)液相色谱串联质谱模块，其具有配备有色谱柱的液相色谱分析装置，和串联质谱分析装置，其中所述液相色谱串联质谱模块经配置以分析经固相萃取模块处理的样品，用于确定其中Ang I的量与Ald的量；和
其中，所述串联质谱分析装置被设置以具有正离子模式和负离子模式切换的扫描方式。
6.如权利要求5所述的系统，其中，所述固相萃取装置是反相固相萃取装置；在一些实施方式中，所述液相色谱分析装置是反相高效液相色谱仪；在一些实施方式中，固相萃取模块经配置以用于对固相萃取装置进行上样、淋洗、洗脱操作；在一些实施方式中，固相萃取模块经配置以用于对固相萃取装置进行一次或多次(例如两次)淋洗操作。
7.一种获得样品中醛固酮(Ald)含量与肾素活性(PRA)比值(ARR)的方法，包括：
(a)孵育样品；
(b)固相萃取处理经(a)孵育的样品；
(c)通过液相色谱串联质谱分析经(b)处理的样品，确定样品的Ang I的量与Ald的量，其中，所述质谱采用正离子模式和负离子模式切换的方式扫描；
(d)根据式(I)计算肾素活性(PRA)：
Figure FDA0002665716800000021
其中C1AngI为经(a)孵育的样品的Ang I含量，C0AngI为未经(a)孵育的样品的Ang I含量，t为(a)中孵育时间；和
(e)根据式(II)计算ARR：
Figure FDA0002665716800000022
其中CAld为经(a)孵育的样品的Ald的量，PRA为(d)中计算所得值。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述固相萃取采用反相固相萃取模式；在一些实施方式中，所述液相色谱为反相高效液相色谱；所述固相萃取包括上样、淋洗、洗脱步骤；在一些实施方式中，所述固相萃取包括一次或多次(例如，两次)淋洗。
9.一种用于获得样品中醛固酮(Ald)含量与肾素活性(PRA)比值(ARR)的系统，包括：
(i)孵育模块，其具有孵育腔室和任选的一种或多种孵育试剂，用于孵育样品；
(ii)固相萃取模块，其具有固相萃取装置和用于固相萃取装置的试剂；
(iii)液相色谱串联质谱模块，其具有配备有色谱柱的液相色谱分析装置，和串联质谱分析装置，其中所述液相色谱串联质谱模块经配置以分析经固相萃取模块处理的样品，用于确定其中Ang I的量与Ald的量，其中，所述串联质谱分析装置被设置以具有正离子模式和负离子模式切换的扫描方式；和
(iv)计算模块，其经配置以接收来自液相色谱串联质谱模块的关于样品中分析物组分Ang I、Ald的量的数据，其具有存储器和处理器，其中存储器包含关于样品中分析物组分Ang I、Ald的量的数据，和处理器可执行的指令，所述处理器可执行的指令配置为：
(1)根据式(I)计算PRA：
Figure FDA0002665716800000031
其中C1AngI为经所述孵育模块孵育的样品的Ang I含量，C0AngI为未经所述孵育模块孵育的样品的Ang I含量，t为样品在所述孵育模块中的孵育时间；和
(2)根据式(II)计算ARR：
Figure FDA0002665716800000032
其中CAld为经所述孵育模块孵育的样品的Ald含量。
10.如权利要求9所述的系统，其中，所述固相萃取装置是反相固相萃取装置；在一些实施方式中，所述液相色谱分析装置是反相高效液相色谱仪；在一些实施方式中，固相萃取模块经配置以用于对固相萃取装置进行上样、淋洗、洗脱操作；在一些实施方式中，固相萃取模块经配置以用于对固相萃取装置进行一次或多次(例如两次)淋洗操作。
CN202010918000.5A 2020-09-03 2020-09-03 同步测定样品中血管紧张素i和醛固酮的方法 Pending CN112014509A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010918000.5A CN112014509A (zh) 2020-09-03 2020-09-03 同步测定样品中血管紧张素i和醛固酮的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010918000.5A CN112014509A (zh) 2020-09-03 2020-09-03 同步测定样品中血管紧张素i和醛固酮的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112014509A true CN112014509A (zh) 2020-12-01

Family

ID=73516297

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010918000.5A Pending CN112014509A (zh) 2020-09-03 2020-09-03 同步测定样品中血管紧张素i和醛固酮的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112014509A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113533552A (zh) * 2021-06-02 2021-10-22 杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司 液相色谱串联质谱检测肾素活性过程中对影响arr药物同步检测的方法
CN114895043A (zh) * 2022-07-13 2022-08-12 杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司 原发性醛固酮增多症筛查试剂盒以及确诊和分型诊断系统
CN115453001A (zh) * 2022-09-30 2022-12-09 昆明和合医学检验所有限公司 液相色谱串联质谱法同时测定干血滤纸片中血管紧张素ⅰ、血管紧张素ⅱ、醛固酮含量

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102112857A (zh) * 2008-08-08 2011-06-29 奎斯特诊断投资公司 血浆肾素的质谱分析
CN104535502A (zh) * 2014-12-16 2015-04-22 新疆大学 一种基于多孔硅的高血压血清学的检测方法
CN105683760A (zh) * 2013-10-18 2016-06-15 阿托奎特诊断有限公司 用于诊断原发性醛甾酮增多症的方法
CN110702829A (zh) * 2019-10-18 2020-01-17 郑州安图生物工程股份有限公司 一种测定血浆或血清中醛固酮含量的方法
JP2020516901A (ja) * 2017-04-14 2020-06-11 株式会社島津製作所 検出方法および検出装置

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102112857A (zh) * 2008-08-08 2011-06-29 奎斯特诊断投资公司 血浆肾素的质谱分析
CN105683760A (zh) * 2013-10-18 2016-06-15 阿托奎特诊断有限公司 用于诊断原发性醛甾酮增多症的方法
CN104535502A (zh) * 2014-12-16 2015-04-22 新疆大学 一种基于多孔硅的高血压血清学的检测方法
JP2020516901A (ja) * 2017-04-14 2020-06-11 株式会社島津製作所 検出方法および検出装置
CN110702829A (zh) * 2019-10-18 2020-01-17 郑州安图生物工程股份有限公司 一种测定血浆或血清中醛固酮含量的方法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113533552A (zh) * 2021-06-02 2021-10-22 杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司 液相色谱串联质谱检测肾素活性过程中对影响arr药物同步检测的方法
CN113533552B (zh) * 2021-06-02 2023-08-29 杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司 液相色谱串联质谱检测肾素活性过程中对影响arr药物同步检测的方法
CN114895043A (zh) * 2022-07-13 2022-08-12 杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司 原发性醛固酮增多症筛查试剂盒以及确诊和分型诊断系统
US11860171B1 (en) 2022-07-13 2024-01-02 Hangzhou Calibra Diagnostics Co., Ltd. Screening kit and diagnosis system for primary aldosteronism
CN115453001A (zh) * 2022-09-30 2022-12-09 昆明和合医学检验所有限公司 液相色谱串联质谱法同时测定干血滤纸片中血管紧张素ⅰ、血管紧张素ⅱ、醛固酮含量

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220349897A1 (en) Amyloid beta detection by mass spectrometry
CN112014509A (zh) 同步测定样品中血管紧张素i和醛固酮的方法
EP2553468B1 (en) Measurement of 25-hydroxyvitamin d3 and c3-epi-25-hydroxyvitamin d3
US8487241B2 (en) Methods for detecting catecholamines by mass spectrometry
US11624737B2 (en) Methods for detecting lacosamide by mass spectrometry
CN113711030A (zh) 用于通过lc-ms/ms检测11-氧代雄激素的方法和系统
CN110702829A (zh) 一种测定血浆或血清中醛固酮含量的方法
US20230273226A1 (en) Mass spectrometric determination of testosterone in multiplexed patient samples
CN105699575A (zh) 高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中皮质醇的方法及试剂盒
EP3654032B1 (en) Disease detection method
US20230128672A1 (en) Methods and Systems for Measuring Progesterone Metabolites
CN116930375A (zh) 一种用于检测动物血清中内源性类固醇激素睾酮的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20201201

RJ01 Rejection of invention patent application after publication