CN104535502A

CN104535502A - 一种基于多孔硅的高血压血清学的检测方法

Info

Publication number: CN104535502A
Application number: CN201410774551.3A
Authority: CN
Inventors: 吕小毅; 吕国栋; 贾振红; 莫家庆; 温浩; 林仁勇; 卢晓梅
Original assignee: Xinjiang University; First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
Current assignee: Xinjiang University; First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
Priority date: 2014-12-16
Filing date: 2014-12-16
Publication date: 2015-04-22

Abstract

本发明提供一种基于多孔硅的高血压血清学的检测方法，包括如下步骤：⑴制备多孔硅Bragg反射镜；⑵多孔硅Bragg反射镜的表面功能化处理；⑶分别将5种待测抗原的抗血清化学处理固定在多孔硅Bragg反射镜上；⑷将5片多孔硅微腔组装成一个传感基底；⑸将传感基底浸泡于含有5种抗原的血清样品中，分别检测每个单元浸泡前后的反射光谱，依据单元1-5反射光谱所发生的红移，依次判断样品中是否含有第1-5种抗原；⑹根据反射光谱红移的量计算出每一种抗原的浓度，以此得到样品溶液中5种抗原的有无和多少。

Description

一种基于多孔硅的高血压血清学的检测方法

技术领域

本发明涉及免疫学检测领域，特别涉及一种基于多孔硅的高血压血清学的检测方法。

背景技术

高血压是一种严重影响人类健康的慢性疾病，是导致动脉粥样硬化、心脑血管疾病、肾脏疾病、器官衰竭甚至死亡的重要危险因素，是人群中最为常见的慢性非传染性疾病，也是导致人类死亡的主要疾病，具有较高的病死率。在全世界广泛流行，无论发达国家还是发展中国家均具有极高的患病率，我国高血压呈现出快速上升的趋势。临床治疗药物分为利尿药、血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素II受体阻滞剂等几类。个体化治疗是有效控制高血压病情的关键，但目前的个体化给药一般通过根据患者服药后的表观疗效结合医生的经验进行给药剂量和给药时间的摸索，存在极大的人为误差。

肾素-血管紧张素-醛固酮系统与高血压具有密切的关系。血管紧张素I基本没有生物学活性，而是经血管紧张素转化酶（Angiotensin Converting Emzyme, ACE）剪切C-末端两个氨基酸残基而形成血管紧张素II。血管紧张素II具有高效的收缩血管作用，从而使血压升高；血管紧张素II也能刺激肾上腺皮质分泌醛固酮。醛固酮能促进肾脏对水和钠离子的重吸收，继而增加体液容量，升高血压。目前多数高血压药物针对该系统进行调控，如：血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂和肾素抑制剂等几类。对于该系统的关键因子进行检测对于指导高血压个体化给药具有重要意义。该系统的关键因子包括血管紧张素、肾素和醛固酮等。

另外，心钠肽和内皮素与高血压治疗也有密切关系。心钠肽是一种由心房合成、贮存和分泌的活性多肽，又称心房利钠因子(ANF)或心房利钠肽(ANP)。具有强大的利钠、利尿、舒张血管、降低血压和对抗肾素－血管紧张素系统和抗利尿激素作用。内皮素是由21个氨基酸组成的生物活性多肽。内皮素具有强烈的收缩冠状动脉、肾小动脉;内皮素是迄今所知最强的缩血管物质，其作用时间持久，刺激心钠素的释放，提高全身血压;抑制肾素释放等作用。

目前，临床针对血管紧张素、肾素、醛固酮、心钠肽和内皮素五种指标的检测方法有放射免疫分析法、发光免疫分析法、高效液相色谱法和酶联免疫吸附法等几种。这些方法一次仅能检测一种指标，通量较低，且具有检测周期长、灵敏度低或有放射污染等缺点。

目前报道的基于多孔硅微腔的生物传感器很多，检测方法包括：反射光谱的检测和拉曼、荧光光谱的检测。

CN101710118A公开了一种基于多孔硅三元结构微腔的光学免疫检测方法，该方法采用基于计算机精确控制的电化学腐蚀方法制备多孔硅微腔，其中多孔硅微腔内上、下的Bragg(布拉格)结构由三种电流密度交替进行电化学腐蚀而形成，其特征在于对于不同条件制备的多孔硅微腔进行编码可以实现多元检测，如果是一元检测则不需要编码，使抗体或抗原在多孔硅三元结构微腔的孔洞里结合，多元检测中抗原或抗体的种类利用多孔硅微腔的编码进行标识，而通过生物反应前后的光谱峰位变化进行检测样品中相应的抗原或抗体浓度，所述检测方法包括以下步骤：

1)抗原或抗体固定在多孔硅微腔的孔洞里，如果是需要编码的多元检测，那么一种编码的多孔硅微腔对应固定一种待测生物分子的特异性抗原或抗体，冲洗未结合的分子并封闭多孔硅微腔里的未结合生物分子的空白键位，记录测定固定有抗原或抗体的多孔硅微腔光谱；

2)不同多孔硅微腔与不同浓度待测溶液发生反应，使抗原-抗体在多孔硅微腔的孔洞里特异性结合，反应后进行冲洗，记录多孔硅微腔光谱及编码确定种类和浓度。

这种光学免疫检测方法不仅兼具多孔硅和光子带隙结构传感器的诸多优异性能，而且结构稳定性很好，通过编码检测技术更是可以实现多元检测。此外，由于采用的制备方法较为简单，价格相对低廉，有一定的商业应用前景。

CN103558184A涉及一种基于多孔硅非标记实时在线检测霍乱毒素的方法。该方法利用多孔硅为传感基底，在多孔硅表面修饰疏水基团后，通过疏水性相互作用固定脂质体和单唾液酸神经节苷脂，当样品中含有霍乱毒素时，单唾液酸神经节苷脂(GM1)特异的结合毒素分子，利用多孔硅的反射干涉光谱，经过傅里叶红外转化后，实时非标记检测多孔硅有效薄膜的厚度变化，对霍乱毒素进行定量和定性检测。该方法可以对霍乱毒素实时在线检测，最低检测限为1nM，该传感基底可以重复使用。

CN103293109A涉及免疫学检测领域，公开了一种光学无标记血清学检测方法及其系统。将多孔硅光学微谐振腔生物传感器作为换能器产生对生物分子敏感的响应光信号，通过采集包被生物探针分子后的多孔硅光学微谐振腔生物传感器所产生的第一光信号和捕获目标生物分子后的多孔硅光学微谐振腔生物传感器所产生的第二光信号，根据第一光信号和第二光信号的比较结果，得到检测结果。由于无需对检测对象进行添加标记处理，对试剂需求量少，降低了检测的复杂度和成本。并且，基于硅工艺制备，成本低，方便集成于手持设备中，而且响应速度快，能迅速得到检测结果。

本发明以给予高血压个体化治疗指导为目标，针对其关键指标诊断技术的不足，期望研发一种能够客观评估高血压药物给药的剂量，对高血压个体化治疗提供指导的血清学检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于多孔硅的高血压血清学的检测方法。其中，以对称三元结构的多孔硅微腔作为检测平台。每5篇多孔硅微腔单元构成一个反应检测平台，每一片单元编号对应于5中待检测抗原。相应的待检测抗原有5种，分别是血管紧张素，肾素，醛固酮，心钠肽和内皮素。该5种抗原和相应的抗体均可以通过商业渠道购得，本发明所用5种抗原和相应的抗体（血清）由新医大一附院提供。

本发明提供一种基于多孔硅的高血压血清学的检测方法，包括如下步骤：

⑴制备多孔硅Bragg反射镜；

⑵多孔硅Bragg反射镜的表面功能化处理；

⑶分别将5种待测抗原的抗血清化学处理固定在多孔硅Bragg反射镜上；

⑷将5片多孔硅微腔组装成一个传感基底；

⑸将传感基底浸泡于含有5中抗原的血清样品中，分别检测每个单元浸泡前后的反射光谱，依据单元1-5反射光谱所发生的红移，依次判断样品中是否含有第1-5种抗原。如样品中含有第1种抗原，那么单元1的反射光谱会发生红移，如样品中含有第2种抗原，那么单元2的反射光谱会发生红移，如样品中含有第3种抗原，那么单元3的反射光谱会发生红移，如样品中含有第4种抗原，那么单元4的反射光谱会发生红移，如样品中含有第5种抗原，那么单元5的反射光谱会发生红移。

⑹根据反射光谱红移的量计算出每一种抗原的浓度，以此得到样品溶液中5种抗原的有无和多少。

优选，步骤⑴的制备方法如下：将化学清洗好的单晶硅片置于盛有HF及乙醇混合溶液的腐蚀槽中，进行两种电流交替的电化学腐蚀，腐蚀的全过程由计算机主导电化学腐蚀平台精确自动控制，设计控制多孔硅Bragg反射镜的中心波长位于中红外波段；首先对低孔隙率多孔硅层进行腐蚀，优选的，腐蚀电流密度设置为10-20mA，腐蚀时间15-25；然后对高孔隙率多孔硅层进行腐蚀，优选的，腐蚀电流密度设置为60-80mA，腐蚀时间5-15s；为了保证每一层的均匀性，需及时补充氟离子的浓度，在每一层形成后，优选电流停顿5-10 s；总周期数为9；最后将所有腐蚀好的多孔硅Bragg反射镜样品在KOH溶液中浸泡，优选KOH溶液的浓度为1 -5mmol/L，浸泡时间优选3-8 min，用于增大孔径，使生物分子能够充分地进入。

优选，步骤⑵的制备方法如下：①将步骤⑴制备好的样品放入温度为40-50℃体积分数为20-30%的H₂O₂中浸泡0.5-2 h，取出后用去离子水冲洗并在N₂气环境中干燥；②将样品放入用甲苯溶液稀释的氨丙基三乙氧基硅烷APTES中浸泡1 h进行硅烷化反应；③样品取出后分别用甲苯、甲醇-甲苯、甲醇及去离子水反复冲洗,再置于N₂气环境中干燥，然后在烘烤；④将烘烤后的样品浸泡在戊二醛水溶液，并用PBS磷酸缓冲液,反复冲洗去除残余的戊二醛。

优选，步骤⑶的方法如下：分别用微量移液器将足以覆盖整个多孔硅表面的待测抗原的抗血清滴加到每片多孔硅Bragg反射镜上，然后在30-40^oC下放置1h，然后用Tween-20与磷酸的混合溶液PBST反复冲洗，去除未偶联到多孔硅Bragg反射镜中的抗血清，并在N₂氛围中干燥。

更优选地，步骤⑴的制备方法如下：将化学清洗好的单晶硅片置于盛有HF及乙醇混合溶液(体积比1∶1)的腐蚀槽中，进行两种电流交替的电化学腐蚀，腐蚀的全过程由基于LabVIEW的计算机主导电化学腐蚀平台精确自动控制，设计控制多孔硅Bragg反射镜的中心波长位于多孔硅材料吸收很小的中红外波段；首先对低孔隙率多孔硅层进行腐蚀,腐蚀电流密度设置为20mA，腐蚀时间24 s；然后对高孔隙率多孔硅层进行腐蚀,腐蚀电流密度设置为80mA，腐蚀时间10s；为了保证每一层的均匀性，需及时补充氟离子的浓度，在每一层形成后，电流停顿10 s；总周期数为9；最后将所有腐蚀好的多孔硅Bragg反射镜样品在1 mmol/LKOH溶液中浸泡5 min，用于增大孔径，使生物分子能够充分地进入。

更优选地，步骤⑵的制备方法如下：①将步骤⑴制备好的样品放入温度为45℃体积分数为30%的H₂O₂中浸泡1 h，取出后用去离子水冲洗并在N₂气环境中干燥；②将样品放入用甲苯溶液稀释的4%氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）中浸泡1 h进行硅烷化反应；③样品取出后分别用甲苯、甲醇-甲苯、甲醇及去离子水反复冲洗,再置于N₂气环境中干燥，然后在100℃环境中烘烤10 min；④将烘烤后的样品浸泡在2%的戊二醛水溶液中30 min，并用PBS(磷酸缓冲液, pH=7.4)反复冲洗去除残余的戊二醛；更加优选的，样品取出后分别用DMF、THF、异丙醇及去离子水反复冲洗。

更优选地，步骤⑶的方法如下：分别用微量移液器将足以覆盖整个多孔硅表面的待测抗原的抗血清滴加到每片多孔硅Bragg反射镜上，然后在37^oC下放置1h，然后用PBST（0.1%Tween-20与磷酸的混合溶液）反复冲洗，去除未偶联到多孔硅Bragg反射镜中的抗血清，并在N₂氛围中干燥。

更优选地，步骤⑷的方法如下：将步骤⑶得到的分别固定有不同抗体的5片多孔硅Bragg反射镜组装成一个传感基底，更加优选地，将5片多孔硅Bragg反射镜依次紧密粘附在玻璃片上，最为优选地，将5片多孔硅Bragg反射镜依次紧密粘附在表面喷金的玻璃片上。

优选地，步骤⑸中利用傅里叶光谱仪记录中红外波段的反射光谱。

具体实施方式

实施例1：

⑴制备多孔硅Bragg反射镜。将化学清洗好的单晶硅片置于盛有HF及乙醇混合溶液(体积比1∶1)的腐蚀槽中，进行两种电流交替的电化学腐蚀，腐蚀的全过程由基于LabVIEW的计算机主导电化学腐蚀平台精确自动控制，设计控制多孔硅Bragg反射镜的中心波长位于多孔硅材料吸收很小的中红外波段；首先对低孔隙率多孔硅层进行腐蚀,腐蚀电流密度设置为20mA，腐蚀时间24 s；然后对高孔隙率多孔硅层进行腐蚀,腐蚀电流密度设置为80mA，腐蚀时间10s；为了保证每一层的均匀性，需及时补充氟离子的浓度，在每一层形成后，电流停顿10 s；总周期数为9；最后将所有腐蚀好的多孔硅Bragg反射镜样品在1 mmol/LKOH溶液中浸泡5 min，用于增大孔径，使生物分子能够充分地进入。

⑵多孔硅Bragg反射镜的表面功能化处理。①将步骤⑴制备好的样品放入温度为45℃体积分数为30%的H₂O₂中浸泡1 h，取出后用去离子水冲洗并在N₂气环境中干燥；②将样品放入用甲苯溶液稀释的4%氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）中浸泡1 h进行硅烷化反应；③样品取出后分别用甲苯、甲醇-甲苯、甲醇及去离子水反复冲洗，再置于N₂气环境中干燥，然后在100℃环境中烘烤10 min；④将烘烤后的样品浸泡在2%的戊二醛水溶液中30 min，并用PBS(磷酸缓冲液, pH=7.4)反复冲洗去除残余的戊二醛。所得到的多孔硅Bragg反射镜灵敏度达到11000±50nm/折射率单位。

⑶分别将5种待测抗原的抗血清化学处理固定在多孔硅Bragg反射镜上。分别用微量移液器将足以覆盖整个多孔硅表面的待测抗原的抗血清滴加到每片多孔硅Bragg反射镜上，然后在37^oC下放置1h，然后用PBST（0.1%Tween-20与磷酸的混合溶液）反复冲洗，去除未偶联到多孔硅Bragg反射镜中的抗血清，并在N₂氛围中干燥。

⑷将5片多孔硅微腔组装成一个传感基底。将步骤⑶得到的分别固定有不同抗体的5片多孔硅Bragg反射镜粘附在PET塑料片上组装成一个传感基底。

⑸将传感基底浸泡于含有5中抗原的血清样品中，分别检测每个单元浸泡前后的反射光谱。利用傅里叶光谱仪记录中红外波段的反射光谱。

⑹根据反射光谱红移的量计算出每一种抗原的浓度，以此得到样品溶液中5种抗原的有无和多少。可以看到，随着抗原浓度的逐渐增大，反射光谱红移量也随之增加，多孔硅Bragg反射镜的反射谱红移量与抗原浓度之间呈现出较好的线性关系，灵敏度达到0.626nm/(ng.mL)。

实施例2：

步骤⑵中样品取出后分别用DMF、THF、异丙醇及去离子水反复冲洗。所得的多孔硅Bragg反射镜灵敏度达到12000±80nm/折射率单位。

实施例3：

将5片多孔硅Bragg反射镜依次紧密粘附在玻璃片上，其它同实施例1。多孔硅Bragg反射镜的反射谱红移量与抗原浓度之间呈现出较好的线性关系，灵敏度达到0.650nm/(ng.mL)。

实施例4：

将5片多孔硅Bragg反射镜依次紧密粘附在表面喷金的玻璃片上。多孔硅Bragg反射镜的反射谱红移量与抗原浓度之间呈现出较好的线性关系，灵敏度达到0.787nm/(ng.mL)。

Claims

1.一种基于多孔硅的高血压血清学的检测方法，包括如下步骤：

⑴制备多孔硅Bragg反射镜；

⑵多孔硅Bragg反射镜的表面功能化处理；

⑷将5片多孔硅微腔组装成一个传感基底；

⑸将传感基底浸泡于含有5种抗原的血清样品中，分别检测每个单元浸泡前后的反射光谱，依据单元1-5反射光谱所发生的红移，依次判断样品中是否含有第1-5种抗原；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤⑴的制备方法如下：将化学清洗好的单晶硅片置于盛有HF及乙醇混合溶液(优选体积比1∶1)的腐蚀槽中，进行两种电流交替的电化学腐蚀，腐蚀的全过程由计算机主导电化学腐蚀平台精确自动控制，设计控制多孔硅Bragg反射镜的中心波长位于中红外波段；首先对低孔隙率多孔硅层进行腐蚀，优选的，腐蚀电流密度设置为10-20mA，腐蚀时间15-25 s，更优选腐蚀电流密度设置为20mA，腐蚀时间24 s；然后对高孔隙率多孔硅层进行腐蚀，优选的，腐蚀电流密度设置为60-80mA，腐蚀时间5-15s，更优选腐蚀电流密度设置为80mA，腐蚀时间10s；为了保证每一层的均匀性，需及时补充氟离子的浓度，在每一层形成后，优选电流停顿5-10 s；总周期数为9；最后将所有腐蚀好的多孔硅Bragg反射镜样品在KOH溶液中浸泡，优选KOH溶液的浓度为1 -5mmol/L，浸泡时间优选3-8 min，更优选KOH溶液的浓度为1 mmol/L，浸泡时间5 min，用于增大孔径，使生物分子能够充分地进入。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤⑵的制备方法如下：①将步骤⑴制备好的样品放入温度为40-50℃体积分数为20-30%的H₂O₂中浸泡0.5-2 h，取出后用去离子水冲洗并在N₂气环境中干燥；②将样品放入用甲苯溶液稀释的氨丙基三乙氧基硅烷APTES中浸泡1 h进行硅烷化反应；③样品取出后分别用甲苯、甲醇-甲苯、甲醇及去离子水反复冲洗,再置于N₂气环境中干燥，然后在烘烤；④将烘烤后的样品浸泡在戊二醛水溶液，并用PBS磷酸缓冲液,反复冲洗去除残余的戊二醛。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤⑶的方法如下：分别用微量移液器将足以覆盖整个多孔硅表面的待测抗原的抗血清滴加到每片多孔硅Bragg反射镜上，然后在30-40^oC下放置1h，然后用Tween-20与磷酸的混合溶液PBST反复冲洗，去除未偶联到多孔硅Bragg反射镜中的抗血清，并在N₂氛围中干燥。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤⑷的方法如下：将步骤⑶得到的分别固定有不同抗体的5片多孔硅Bragg反射镜组装成一个传感基底，优选地，通过依次紧密粘附的方式将5片多孔硅Bragg反射镜组装成一个传感基底。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：将5片多孔硅Bragg反射镜依次紧密粘附在玻璃片上。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：将5片多孔硅Bragg反射镜依次紧密粘附在表面喷金的玻璃片上。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：相应的待检测抗原有5种，分别是血管紧张素，肾素，醛固酮，心钠肽和内皮素。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：样品取出后分别用DMF、THF、异丙醇及去离子水反复冲洗。