CN1922486A - 使用多孔生物传感器和拉曼光谱法检测生物分子 - Google Patents

使用多孔生物传感器和拉曼光谱法检测生物分子 Download PDF

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Abstract

本发明提供用级联拉曼传感用于分析生物样品例如血清中内含物的方法。使具有特异性结合已知分析物的探针的、产生荧光的纳米多孔生物传感器与生物样品接触，形成连接于多孔半导体结构的一个或多个结合复合物。将结合复合物与拉曼活性探针接触，该拉曼活性探针特异性结合该结合复合物，照射生物传感器，从生物传感器产生荧光发射。检测结合复合物产生的拉曼信号，与结合的含蛋白质分析物有关的拉曼信号表明样品中含蛋白质化合物的存在。本发明方法用于提供患者样品的蛋白质谱。本发明也提供用于实施本发明方法的检测系统。

Description

使用多孔生物传感器和拉曼光谱法检测生物分子
                      发明背景
                      技术领域
[0001]本发明一般涉及用于鉴定样品中生物分子存在的多孔生物传感器，更具体而言，本发明涉及使用拉曼光谱法和纳米多孔半导体型生物传感器测定样品中生物分子的存在。
                      背景技术
[0002]对各种生物和有机环境中低浓度分析物的检测和分析一直受到越来越多的关注。对这样的分析物的定性分析一般限于较高的浓度水平，而定量分析通常要求用放射性同位素或荧光试剂进行标记。此类方法一般耗时而且不方便。
[0003]近来由于它们在化学、生物学和药物研究以及疾病诊断学上日益增长的应用，固态传感器，特别是生物传感器已经得到相当多的关注。一般而言，生物传感器由两个元件组成：高度特异性识别元件和将分子识别结果转化为可定量信号的转换结构。生物传感器已经被发展为检测多种生物分子复合物，包括寡核苷酸对、抗体-抗原、激素-受体、酶-底物和凝集素-糖蛋白相互作用。一般用电化学、场效应晶体管、光学吸收、荧光或干涉装置完成信号转换。
[0004]已知在简单的生物传感器中，可以利用多孔硅薄膜的可见反射率变化的强度，如在Ghadiri等的美国专利号6,248,539中所公开。如在该专利号中所公开，检测和测量多孔半导体基板例如硅基板中干涉光谱的波长位移使得对小分子的检测、鉴定和定量成为可能。尽管这样的生物传感器的确有用，然而，通过宽峰而不是一个或多个清晰界定的发光峰的存在而检测反射率变化是复杂的。
[0005]已经开发了包括多孔多层半导体结构的各种传感器，其中所述结构的层具有交替多孔性。将分析物分子结合之后，在半导体结构的折射率上出现了可检测的变化，发出传感器与分析物结合的信号。放置在上层与下层(布拉格反射器)之间的这种多层结构的中心层形成了微腔谐振器。该微腔谐振器通过作为布拉格反射器的两层，限制着产生在微腔中心层的发光，使得光致发光光谱由多个尖且窄的峰组成，其具有大约3nm的半峰宽度或FWHM值(Chan等，Phys.Stat.Sol.A182：541-546(2000))。折射率变化之后，光致发光峰值移动，因此产生了可检测的差频信号。然而，结合结果仅提供了关于所结合分子性质的大概信息。
[0006]拉曼光谱法或表面等离子共振技术(surface plasmon resonance)也已经被用于寻求实现灵敏而准确地检测或鉴定生物样品中各个分子的目的。当光经过感兴趣的介质时，一定量的光以一种被称为散射的现象从其最初的方向发生转向。一些散射光也与最初的激发光的频率不同，原因在于光的吸收以及电子激发到较高的能态，随后在不同波长下的光发射。吸收光的能量和发射光的能量的差异与介质的振动能匹配。这种现象被称为拉曼散射，用拉曼散射光表征并分析感兴趣的介质或分子的方法被称为拉曼光谱法。拉曼发射光谱的波长是样品中拉曼散射分子的化学组成和结构的特征，而拉曼散射光的强度取决于样品中分子的浓度。
[0007]已经观察到，在粗糙的银表面附近的分子显示了增强的拉曼散射，多达两个或更多数量级。这种表面增强拉曼散射(SERS)效应与等离子共振的现象有关，其中金属纳米颗粒或金属涂层响应于入射电磁辐射(incident electromagnetic radiation)，显示出显著的光学共振，原因在于金属中传导电子的并合耦合(collective coupling)。本质上，金、银、铜和某些其它金属的纳米颗粒可以起着增强电磁辐射的局部化效应(localized effect)作用。位于此类颗粒附近的分子对拉曼光谱分析表现出更大的灵敏度。SERS是利用这种表面增强拉曼散射效应表征和分析感兴趣生物分子的技术。
[0008]在引入感兴趣的分子之前或之后，当氯化钠和氯化锂被应用于金属纳米颗粒或金属涂敷表面时，将它们鉴定为增强SERS信号的化学品。然而，使用这些化学促进剂的技术没有证明对可靠地检测低浓度分析物分子例如单核苷酸或蛋白质是足够灵敏的。在单分子水平下，只有一种核苷酸，即脱氧腺苷一磷酸，和只有一种蛋白质，即血红蛋白被检测。因此，SERS不被认为适于分析复杂生物样品例如血浆的蛋白质含量。
[0009]因此，在本领域，需要一种提供所结合分子特征的相关信息的生物分子检测方法，并对使用拉曼光谱分析技术可靠地检测和/或鉴定单个分子存在需求。另外，在本领域，也对定性和定量检测低浓度水平下生物分子的快速而简单的方法存在需求。
                         附图简述
[00010]图1A是显示纳米多孔硅腔的示意流程图，其具有位于中心层每一面上的多层交替多孔性层。
[00011]图1B是图解来自图1A的纳米多孔硅腔的荧光发射的图。
[00012]图2A-D是上面固定有一抗的部分纳米多孔硅层示意图。图2A再次显示了与固定在纳米多孔腔中的固定一抗结合的抗原。图3B图解了与抗原结合的拉曼活性二抗。图3C图解了薄银层在纳米多孔腔的顶层上的沉积。在图2D中图示了由于抗原结合固定的一抗之后使得传感器中层的有效光学厚度增加而形成的发射。
[00013]图3A-D提供了示意流程图，显示了图2的传感器暴露于拉曼活性二抗。图3A再次显示了与固定在纳米多孔腔中的一抗结合的抗原。图3B图解了与抗原结合的拉曼活性二抗。图3C图解了薄银层在纳米多孔腔顶层上的沉积。由传感器中纳米多孔腔所产生的强荧光发射激发了拉曼活性二抗，产生了SERS信号，如在图3D中图示的SERS信号。
[00014]图4是SERS信号图，该信号产生于结合在如在图3中所示传感器上的二抗。由于来自该传感器的重复荧光发射，拉曼信号产生于整个光谱范围内。通过收集经由法布里-珀罗干涉仪传输的光，可以移动透射线(transmission line)，以便如所示进行扫描。
[00015]图5显示了在分子的两端具有荧光分子ROX和FAM的一个多核苷酸，和在DNA上的不同位置上用荧光分子TAMRA标记的相同序列的三个单链DNA。取决于标记的位置，标记DNA分子产生独特的拉曼信号。
[00016]图6是显示由图5的四个拉曼标记单链DNA分子产生的拉曼光谱图。
                        发明详述
[00017]本发明的一方面涉及使用生物传感器的方法，所述传感器包括多孔半导体结构和一个或多个第一探针，第一探针连接到所述多孔结构上，特异性地结合复杂生物样品中的期望分析物。当第二拉曼活性探针结构与含有第一探针的复合物结合时，则样品中相关的特定分析物的存在得以鉴定。本发明方法对获得患者样品的蛋白质状况(proteinprofile)是特别有用的。
[00018]在一个实施方案中，本发明提供了分析生物样品的内含物的方法，步骤如下：在合适的结合条件下，使生物样品和具有多孔半导体结构的纳米多孔生物传感器接触，所述多孔半导体结构具有置于上层和下层之间的中心层，上层和下层都包括可达40层的交替多孔性层(strata of alternating porosity)；和将一个或多个第一探针连接到多孔半导体结构上，所述一个或多个第一探针特异性地结合样品中的分析物，形成一个或多个结合的复合物(bound complexes)。在适合促进它们与结合的复合物特异性结合的条件下，使拉曼活性探针与结合的复合物接触，并照射生物传感器，以便从生物传感器引发荧光发射，这些发射激发了来自结合复合物的拉曼信号。检测由结合复合物产生的拉曼信号，与结合分析物有关的拉曼光谱表明样品中分析物的存在。
[00019]参见图1，纳米多孔硅腔100包括硅基板110，其中多层交替多孔性层120位于中心层130的每一面上。在图1B中图示了纳米多孔硅腔100被照射之后所产生的荧光发射。
[00020]在又一个实施方案中，本发明提供了用于检测生物样品中含蛋白质分析物的存在的方法，步骤如下：在使其中的含蛋白质分析物与至少一个第一探针特异性结合的有效条件下接触样品，所述第一探针连接到由纳米多孔硅结构制成的纳米多孔生物传感器上，纳米多孔硅结构具有置于上层和下层之间的中心层，上层和下层都包括可达40层的交替多孔性层，例如4至40层，其中与使用更少或更多层时相比，大约8至大约30层目前被认为最适合在拉曼信号中提供较少、较窄的峰。在每个上层和下层中的层数被选择在这些范围之内，以产生具有期望反射率的反射层。
[00021]第一探针(例如一抗)与样品中分析物的结合形成了一个或多个结合复合物。在适合促进其与结合复合物特异性结合的条件下，使结合复合物与拉曼活性探针接触，例如如此处所述的拉曼标记的二抗(Raman-tagged secondary antibody)。照射生物传感器，使得从生物传感器引发荧光发射，来自生物传感器的发射激发了来自结合复合物的拉曼信号(图3A-D)。检测由结合复合物产生的拉曼信号，与结合的含蛋白质分析物有关的拉曼信号表明样品中含蛋白质化合物的存在以及类型。
[00022]在又一个实施方案中，本发明提供了用于分析生物样品的内含物的方法，通过如下步骤：在合适的结合条件下，使生物样品与如本文所述的纳米多孔半导体传感器接触，所述传感器具有一个或多个附着的探针，所述探针特定地结合样品中的至少一种分析物，形成一个或多个结合复合物。在适合促进它们的特异性结合的条件下，使所述一个或多个结合复合物与荧光活性探针接触，照射传感器，以便从传感器引发荧光发射，该发射产生了来自结合复合物的二次荧光发射；以及检测由结合复合物产生的二次荧光发射。与结合分析物有关的二次荧光发射表明样品中分析物的存在及类型。
[00023]在另一个实施方案中，本发明提供了检测系统，其包括具有多孔半导体结构的纳米多孔生物传感器，所述多孔半导体结构包括置于上层与下层之间的中心层，每一个上层与下层包括可达40层的交替多孔性层。本发明系统进一步包括发光源(source of illumination)和检测器，发光源被安置以便照射生物传感器，检测器被安置以便捕捉来自结合到传感器上的复合物的拉曼信号或荧光。
[00024]不需要拉曼活性或荧光活性第二探针，也可以直接检测靶分子。已经观察到独特的拉曼和荧光信号发射自不同序列的DNA分子。也已知，蛋白质基于它们的组成和构象而产生不同的信号。其中，在又一个实施方案中，本发明提供了用于分析生物样品的内含物的方法，通如下步骤：在合适的结合条件下，使生物样品与如本文所述的纳米多孔半导体传感器接触，所述传感器具有一个或多个与多孔半导体结构连接的第一探针，所述一个或多个探针与样品中的至少一个分析物特定结合，形成一个或多个结合复合物；照射传感器，以便引发来自结合复合物中分析物的光发射(optical emission)；检测由结合复合物中分析物所产生的光发射；其中分析物是蛋白质或DNA，发射自分析物的拉曼或荧光信号提供了关于结合复合物中的分析物的存在和类型的信息。
[00025]通过已知的方法可以使合适的拉曼活性标签连接到探针上，例如抗体和受体，以制备用在本发明方法中的拉曼活性探针，这些拉曼活性标签包括在下面的表1中所示的那些化合物。
                       表1
  有机化合物   缩写
  2-氨基嘌呤   AP
  2-氟腺嘌呤   FA
  4-氨基-吡唑并[3，4-d]嘧啶   APP
  4-吡啶羧醛肟(4-Pyridinecarboxaldoxime)   PCA
  8-氮杂腺嘌呤(8-Azaadenine)   AA
  腺嘌呤   A
  4-氨基-3，5-二-2-吡啶基-4H-1，2，4-三唑   AMPT
  6-(g，g-二甲基烯丙基氨基)嘌呤   DAAP
  激动素   KN
  N6-苯甲酰腺嘌呤   BA
  玉米素   ZT
  4-氨基-2，1，3-苯并噻二唑   ABT
  吖啶黄素   AF
  碱性蓝3   BB
  亚甲蓝   MB
  2-巯基-苯并咪唑   MBI
  氨基-6-巯基吡唑并[3，4-d]嘧啶   AMPP
  6-巯基嘌呤   MP
  8-巯基腺嘌呤(腺嘌呤硫醇)   AT
  9-氨基吖啶   AN
  花菁染料   Cy3
  溴化乙锭   Ebr
  荧光素   FAM
  罗丹明绿   R110
  罗丹明-6G   R6G
[00026]在某些实施方案中，设备可以包括微机电系统(MEMS)。MEMS为集成系统，包括机械元件、传感器、驱动器(actuator)和电子元件。所有这些元件可以通过微细加工技术在硅基或等同的半导体基板的普通芯片上制造(例如Voldman等，Ann.Rev.Biomed.Eng.1：401-425，1999)。MEMS的传感器元件可以用于测量生物、化学、光学和/或磁现象，以检测拉曼信号或荧光。电子元件可以处理来自传感器的信息，并控制驱动器元件，例如泵、阀、加热器等，因此控制MEMS的功能。
[00027]使用集成电路(IC)工艺(例如CMOS或双极工艺)，可以制造MEMS的电子元件。使用用于计算机芯片制造的光刻和蚀刻方法，它们可以被形成图案。使用兼容的“微加工(micromachining)”工艺，可以制造微机械元件，所述微加工工艺选择性地蚀刻掉部分硅片，或者增加新的结构层，以形成机械和/或机电元件。
[00028]在MEMS制造中的基本技术包括在基板上沉积材料的薄膜，通过一些光刻方法，将图案化掩模(patterned mask)施用于膜的上层，并选择性地蚀刻该膜。薄膜可以在几纳米至100微米的范围内。使用的沉积技术可以包括化学过程，例如化学气相沉积(CVD)、电沉积、外延生长和热氧化，以及物理过程，例如物理气相沉积(PVD)和浇铸(casting)。也可以使用制造纳米机电系统(nanoelectromechanicalsystem)的方法(例如参见Craighead，Science 290：1532-36，2000.)。
[00029]在一些实施方案中，设备和/或检测器可以与各种充满流体的隔室(fluid filled compartment)连接，例如微流体通道(microfluidicchannel)或纳米通道(nanochannel)。设备的这些以及其它元件可以被形成为单个元件，例如以芯片(例如半导体芯片)和/或微毛细管(microcapillary)或微流体芯片(microfluidic chips)的形式。可选地，可以分别制造各个元件，并连接在一起。在所公开的设备中，可以使用已知用在此类芯片中的任何材料，例如硅、二氧化硅、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、塑料、玻璃、石英等。
[00030]在一个实施方案中，可以将大小范围为大约1微米至大约15纳米横截面直径的各个小型生物传感器排列在一起(例如在一个共同的基底上)，并通过扫描经过生物传感器进行检测。在这样的情况下，生物传感器可以方便地具有一种类型的探针，用于固定一种已知的分析物(尽管也可以使用多种第一探针)。
[00031]成批制造芯片的技术在计算机芯片制造和/或微毛细芯片制造中是已知的。可以通过本领域中已知的任何方法制造此类芯片，例如通过光刻和蚀刻、激光烧蚀(laser ablation)、注塑成型(injectionmolding)、浇铸、分子束外延、浸沾笔纳米图形制作技术(dip-pennanolithography)、化学气相沉积(CVD)制造、电子束或聚焦离子束技术或印迹技术(imprinting technique)。非限定性例子包括常规浇铸、二氧化硅的干式蚀刻；和电子束光刻。制造纳米机电系统的方法可以被用于某些实施方案。(例如参见Craighead，Science 290：1532-36，2000)。各种形式的微细加工芯片可商业供应自例如Caliper Technologies Inc.(Mountain View，CA)和ACLARA BioSciences Inc.(Mountain View，CA)。
[00032]在某些实施方案中，部分或全部设备可以被选择为可透射用于例如拉曼光谱法检测的激发和发射频率下的电磁辐射。可以由材料例如玻璃、硅、石英或任何其它光学透明的材料制造合适的组件。普通芯片材料例如玻璃、硅、石英和/或PDMS的表面修饰方法(Surfacemodification)是已知的(例如美国专利号6,263,286)。这样的修饰可以包括例如用商业可得的具有各种官能部分(例如聚环氧乙烷或丙烯酰胺等)的硅烷涂布。
[00033]在一些实施方案中，第一探针是多核苷酸。词语“多核苷酸(polynucleotide)”在此被广泛地用于指通过磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的序列。方便起见，词语“寡核苷酸(oligonucleotide)”在此被用于指被用作引物或探针的多核苷酸。一般而言，选择性地与所选择核苷酸序列杂交的用作探针或引物的寡核苷酸长度为至少大约10个核苷酸，通常长度为至少约15个核苷酸，例如其长度在大约15至大约50个核苷酸之间。
[00034]多核苷酸可以是RNA或者可以是DNA，其可以是基因或者其部分、cDNA、合成的多脱氧核糖核酸序列或类似物，并且可以是单链或双链的，以及DNA/RNA杂种。在各种实施方案中，包括寡核苷酸(例如探针或引物)在内的多核苷酸可以含有核苷或核苷类似物，或者除磷酸二酯键外的骨架键(backbone bond)。一般而言，构成多核苷酸的核苷酸是天然出现的脱氧核糖核苷酸，例如与2′-脱氧核糖连接的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶，或者核糖核苷酸，例如与核糖连接的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶。然而，多核苷酸或寡核苷酸也可以含有核苷酸类似物，包括非天然出现的合成核苷酸或修饰的天然出现的核苷酸。这样的核苷酸类似物在本领域中是熟知的，并且是商业可得的，含有此类核苷酸类似物的多核苷酸也是如此(Lin等，Nucl.Acids Res.22：5220-5234(1994)；Jellinek等，Biochemistry 34：11363-11372(1995)；Pagratis等，Nature Biotechnol.15：68-73(1997))。
[00035]连接多核苷酸的核苷酸的共价键一般是磷酸二酯键。然而，所述共价键也可以是众多其它键中的任何一种，包括硫二酯键(thiodiesterbond)、硫代磷酸酯键(phosphorothioate bond)、类肽键(peptide-likebond)或那些本领域普通技术人员已知用于连接核苷酸以产生合成多核苷酸的任何其它键(例如参见Tam等，Nucl.Acids Res.22：977-986(1994)；Ecker and Crooke，BioTechnology 13：351360(1995))。在多核苷酸将暴露于可能含有核酸水解活性的环境，包括例如组织培养基或施给活体的情况下，掺入非天然出现的核苷酸类似物或连接核苷酸或类似物的键可以是特别有用的，因为修饰的多核苷酸较不容易受降解的影响。
[00036]如此处所用，词语“选择杂交(selective hybridization)”或“选择地杂交(selectively hybridize)”指的是在中等严格条件或高严格条件下的杂交，以使核苷酸序列在很大程度上优先于无关的核苷酸序列，优选与所选择的核苷酸序列发生联系，以便有助于鉴定所选择的核苷酸序列。应当认识到，一些数量的非特异性杂交是不可避免的，但是可以接受的，条件是与分析物核苷酸序列的杂交是充分选择性的，以使其与非特异性交叉杂交是可区别的，例如选择性大于至少约2倍，一般地，选择性大于至少约3倍，通常地，选择性大于至少约5倍，特别地，选择性大于至少约10倍，例如，通过比较结合非分析物分子的核酸分子，特别是基本相似的(例如同源的)但又不是分析物核酸分子的核酸分子和结合分析物核酸分子的标记寡核苷酸的量，测定所述选择性。可以经验地决定允许选择杂交的条件，或者基于例如杂交寡核苷酸与其欲杂交的序列的相对GC：AT含量、杂交寡核苷酸的长度以及如果有的话，寡核苷酸与其欲杂交的序列之间的错配(mismatch)数量，可以估计允许杂交的条件(例如参见Sambrook等，″MolecularCloning：A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，其全部被引入作为参考)。
[00037]逐渐严格的条件的例子如下：大约室温下，2x SSC/0.1％SDS(杂交条件)；大约室温下，0.2x SSC/0.1％SDS(低严格条件)；大约42℃，0.2x SSC/0.1％SDS(中等严格条件)；和在大约68℃，0.1x SSC(高严格条件)。可以仅仅使用这些条件中的一种，例如高严格条件，进行洗涤，或者可以使用每一种条件，例如每个条件10-15分钟，按上面所列的顺序，重复所列步骤的任何一步或所有步骤。然而，如上所述，取决于所涉及的具体杂交反应，最佳条件会有所变化，并且可以经验地决定最佳反应条件。
[00038]在一些实施方案中，第一探针和/或第二探针可以包括抗体探针。如此处所用，词语“抗体(antibody)”以其最广泛的意义被用于包括多克隆和单克隆抗体，以及此类抗体的抗原结合片段。例如，用在本发明的方法中的抗体或其抗原结合片段特征在于具有针对分析物表位的特异性结合活性。
[00039]在本发明的某些方面中，在附着于生物传感器的第一探针中使用抗体，并且二次抗体(例如针对抗体探针区域的特异性结合配偶体(specific binding partner))可以被标记拉曼活性标签，如在此所述，以用作本发明方法中的拉曼活性。如此处所用的词语“抗体(antibody)”指的是天然出现的抗体，包括单克隆抗体，以及非天然出现的抗体。非天然出现的抗体的非限定性例子包括例如单链抗体、嵌合、双功能和人源化抗体，以及它们的抗原结合片段。使用固相肽合成，可以构建此类非天然出现的抗体，可以重组产生此类非天然出现的抗体，或者例如通过筛选由可变重链和可变轻链组成的组合文库，可以获得此类非天然出现的抗体(参见Huse等， Science 246：1275-1281(1989))。这些以及制备例如嵌合、人源化、CDR-移植、单链和双功能抗体的其它方法是本领域普通技术人员熟知的(Winter and Harris， Immunol.Today14：243-246，1993；Ward等， Nature 341：544-546，1989；Harlow and Lane，Antibodies：A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988)；Hilyard等， Protein Engineering：A practical approach(IRL Press1992)；Borrabeck， Antibody Engineering，2d ed.(Oxford University Press1995))。
[00040]词语“特异性结合(binds specifically)”或“特异性结合活性(specific binding activity)”当用于指抗体时，意味着抗体与特定表位之间的相互作用具有至少为大约1×10-6的离解常数，一般至少为大约1×10-7，通常为大约1×10-8，特别至少为大约1×10-9或1×10-10或更小。同样，保持对抗原表位的特异性结合活性的抗体的Fab、F(ab′)2、Fd和Fv片段包括在抗体的定义范围内。
[00041]在本发明的上下文中，词语“配体(ligand)”表示受体的天然出现的特异性结合配偶体、受体的合成特异性结合配偶体或者天然或合成配体的合适衍生物。配体的测定和分离在本领域是熟知的(Lerner，Trends Neurosci.17：142-146，1994))。本领域的普通技术人员将会认识到，分子(或大分子复合物)可以是受体和配体。一般而言，具有较小分子量的结合配偶体被称为配体，具有较大分子量的结合配偶体被称为受体。
[00042]“分析物(analyte)”意指存在于生物样品中的任何分子或化合物。分析物可以处于固相、液相、气相或蒸气相。“气相或蒸气相分析物(gaseous or vapor phase analyte)”指的是例如作为污染物存在于生物样品中的分子或化合物。应当认识到，通过压力、温度以及通过盐的存在或加入影响液体表面张力等，可以改变气相或蒸气相的物理状态。
[00043]如上所示，本发明的方法，在某些方面，检测生物样品中的分析物与附着于半导体生物传感器的第一探针的结合，如此处所述。分析物可以由特异性结合对(sbp)的成员组成，并且可以是配体，其为单价的(单表位的(monoepitopic))或多价的(多表位的(polyepitopic))，通常是抗原性的或半抗原性的，并且是单个化合物或共享至少一个共同表位或决定部位(determinant site)的众多化合物。分析物可以是细胞例如细菌的一部分，或者可以是含有血型抗原例如A、B、D等或HLA抗原的细胞，或者可以是微生物，例如细菌、真菌、原生动物或病毒。在本发明的某些方面，分析物是带电的。
[00044]特异性结合对的成员(“sbp成员(sbp member)”)是两种不同分子中的一种，该成员在表面上或在腔中具有特异性结合于其它分子的特定空间和极性构造并因此被定义为与该特定空间和极性构造互补的区域。特异性结合对的成员被称为配体和受体(抗配体)或分析物和探针。因此，探针是特异性结合分析物的分子。这些分子通常是免疫对(immunological pair)例如抗原-抗体的成员，尽管其它特异性结合对例如生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、核酸双链体(nucleic acidduplexes)、IgG-蛋白A、多核苷酸对例如DNA-DNA、DNA-RNA以及类似物不是免疫对，但是包括在本发明和sbp成员的定义中。
[00045]特异性结合是与其它分子的基本较少识别比较，两种不同分子中的一种对另一种分子的特异性识别。一般而言，所述分子在它们的表面上或腔中具有可引起两种分子之间特异性结合的区域。特异性结合的例子是抗体-抗原相互作用、酶-底物相互作用、多核苷酸相互作用等。
[00046]非特异性结合是分子间的非共价结合，其相对独立于特异性表面结构。非特异性结合可以由几种因素产生，包括分子间的疏水相互作用。
[00047]本发明的方法可以被用于检测具体分析物的存在，例如核酸、寡核苷酸、蛋白质、酶、抗体或抗原。本发明的方法也可以被用于筛选用于结合生物样品中具体分析物的生物活性剂(bioactive agent)，例如候选药物，或者用于检测生物样品中物质例如污染物的存在。如上所讨论，使用本发明的方法，可以检测任何分析物，探针部分例如肽、蛋白质、寡核苷酸或适体可以针对这些分析物而设计。
[00048]多价配体分析物一般为聚氨基酸(poly(amino acids))，例如多肽和蛋白质，多糖，核酸以及它们的组合。这样的组合包括细菌、病毒、染色体、基因、线粒体、核、细胞膜以及类似物的成分。
[00049]对于大部分而言，可以应用本主题发明的多表位配体分析物具有至少大约5,000的分子量，更通常为至少大约10,000。在聚氨基酸种类中，感兴趣的聚氨基酸一般具有大约5,000至5,000,000的分子量，更通常具有大约20,000至1,000,000的分子量；在感兴趣的激素中，分子量通常在大约5,000至60,000分子量的范围内。
[00050]单表位配体分析物一般具有大约100至2,000的分子量，更通常为125至1,000分子量。分析物包括药物、代谢物、杀虫剂、污染物以及类似物。包括在感兴趣的药物之中的是生物碱。属于生物碱的有吗啡生物碱(morphine alkaloid)，其包括吗啡、可待因、海洛因、右甲吗喃、它们的衍生物以及代谢物；可卡因生物碱，其包括可卡因和苄基芽子碱、它们的衍生物以及代谢物；麦角类生物碱，其包括麦角酸的二乙酰胺；类固醇生物碱；iminazoyl生物碱；喹唑啉类生物碱；异喹啉类生物碱；喹啉生物碱，其包括奎宁和奎尼丁；双萜生物碱，它们的衍生物和代谢物。
[00051]词语分析物进一步包括多核苷酸分析物，例如在下面所定义的那些多核苷酸。这些多核苷酸包括m-RNA、r-RNA、t-RNA、DNA、DNA-RNA双链体等。词语分析物也包括受体，其为多核苷酸结合剂，例如限制酶、活化剂、阻抑物、核酸酶、聚合酶、组蛋白、修复酶、化学治疗剂以及类似物，使用本发明的方法可以检测它们。
[00052]分析物可以是直接发现于样品例如来自宿主的体液中的分子。可以直接检查样品，或者可以预处理样品，以使分析物更容易检测。此外，通过检测感兴趣分析物的证明物质，例如与感兴趣的分析物互补的特异性结合对成员——它的存在只有当感兴趣的分析物存在于样品中时才可被检测到，可以测定感兴趣的分析物。因此，分析物的证明物质成为测定中被检测的分析物。体液可以是例如尿、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰、脑脊髓液(cerebral spinal fluid)、眼泪、粘液以及类似物。
[00053]众所周知，拉曼光谱法可以监测蛋白质的构象变化或者二级结构(Sane，S.等，″structure perturbations on chromatographic surfaces″，Journal of Chromatography A 849(1999)149-159；和D.Ben-Amotz等，″New Dimensions in Proteomic Sensing″， Federation of Analytical Chemistry and Societies Meeting，October 19-23，2003，Fort Lauderdale，FL)。在此提及使用拉曼信号检测“蛋白质类型(type of protein)”指的是含蛋白质分析物的此类构象变化和/或二级结构。
[00054]如此处所使用的术语“含蛋白质分析物(protein-containinganalyte)”包括此类实体如抗原、肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白以及类似物。
[00055]下面的段落包括关于本发明方法的示例性应用的进一步细节。应当理解，使用本说明书的教导，可以确定利用本发明方法的应用的众多另外的具体实施例。本领域普通技术人员应当认识到，使用本发明的方法，可以检测多肽第一探针与它们的分析物分子之间的许多相互作用。在另一个实施例中，可以使用酶第一探针，检测酶与样品中的底物分析物的相互作用。
[00056]另一组示例性方法使用本发明方法，检测样品中一种或多种分析物核酸。例如，这样的方法可用于临床样品中传染原的检测、衍生自基因组DNA或RNA或信使RNA的扩增产物的检测或者克隆内的基因(cDNA)插入片段的检测。对于针对分析物多核苷酸的检测的某些方法，使用本领域中已知的方法合成寡核苷酸探针。然后寡核苷酸探针被用作附着到生物传感器上的第一探针。在杂交反应中使用寡核苷酸第一探针，以使寡核苷酸探针与样品中的分析物多核苷酸发生特异性结合。然后，使用在此所述的荧光发射、拉曼光谱法或SERS，可以检测通过结合寡核苷酸探针而形成的复合物。对已知寡核苷酸探针与样品中的分析物寡核苷酸的特异性结合的检测提供了关于分析物多核苷酸的核苷酸序列的信息。
[00057]用于本发明方法的多孔半导体结构可以被形成到任何适宜的基板上(例如在芯片、晶片上等)。多孔半导体结构包括置于上层与下层之间的中心层(微腔)，上层和下层都包括交替多孔性层。上层和下层形成布拉格反射器。
[00058]可用于形成多孔半导体结构的半导体可以是单个半导体材料、未混合的半导体材料的组合或者半导体材料的混合物。半导体可以是在其多孔状态是光致发光的半导体。由于由布拉格反射器(例如上层和下层)所限定的活性层的厚度，所发射的光致发光光谱由多个尖且窄的峰组成。光可以位于电磁光谱的可见光部分(例如350-800nm)、红外区(例如800-3000nm)以及紫外区(例如50-350nm)。这些波长仅仅是示例性的，并且可以根据用于形成多孔半导体结构的半导体材料(一种或多种)的类型、其厚度以及其孔隙率(包括孔大小)而变化。对于本发明的方法，通常优选位于电磁光谱中的可见光部分的光。
[00059]可以用于形成多孔半导体结构的优选的半导体包括但不限于硅和硅合金。半导体可以经受用于形成多孔结构的电腐蚀工艺(galvanic etching processes)。这些半导体材料可以包括p-掺杂硅(例如(CH3)2Zn、(C2H5)2Zn、(C2H5)2Be、(CH3)2Cd、(C2H5)2Mg、B、Al、Ga、In)、n-掺杂(例如H2Se、H2S、CH3Sn、(C2H5)3S、SiH4、Si2H6、P、As、Sb)硅、本征的或未掺杂硅、多晶硅、这些材料与例如按重量计算可达达约10％的锗的合金、这些材料的混合物和基于第III族元素氮化物的半导体材料。
[00060]两种主要的优势使得多孔硅(或纳米级硅)成为用于生物传感应用的诱人的材料。首先，其巨大的表面积在大约90m2/cm3至大约783m2/cm3的范围内，这为很多潜在种类的附着提供了众多的部位。第二，其肉眼可检测的室温发光跨越可见光谱，这使其成为有效的传感器。
[00061]多孔半导体结构厚度可以在大约1至大约30微米的范围内。一般地，厚度将根据期望的孔隙率相反地变化(例如在恒定蚀刻时间，较高孔隙率结构将比较低孔隙率结构厚)，以及根据被检测的光的波长相反地变化(例如在较短波长光下使用的结构比在较长波长光下使用的结构要薄，假定在整个光谱范围内多孔半导体材料的折射率恒定)。
[00062]在多孔半导体结构中的孔(或腔)一般根据它们名义上的“直径”按大小区分，虽然事实是它们在形状上是有些不规则的，并且从一层到另一层直径是变化的。这些直径在大约2nm至大约2000nm的范围内，其中大约10至大约100nm的直径是可见光优选的，大约2至大约50nm直径是紫外光优选的，以及100至2000nm是红外光优选的。也应当基于被检测的分析物分子的尺寸选择名义上的孔径。
[00063]如上所述，包括其中心层的所述结构的孔隙率，将根据其在恒定蚀刻时间的厚度相反地变化。一般地，中心层的孔隙率为大约50％至大约90％，尽管对于特定应用可以达到稍低或稍高的孔隙率。对于大多数应用而言，为实现结构的稳定性，孔隙率优选为大约65％至大约85％。
[00064]上层和下层各自地含有交替多孔性层，例如相对于相邻的层，较高和较低孔隙率的层。上层和下层可以是对称的(例如，具有相同构造，包括层的数量)，或者它们可以是不同的(例如在数量和/或孔隙率上具有不同的层构造)。一般地，层的总数是6层或更多(例如在交替构造中具有三层或更多层高孔隙率层，以及三层或更多层低孔隙率层)。
[00065]较低孔隙率层具有的孔隙率小于它们的相邻较高孔隙率层的孔隙率。例如，较低孔隙率层可以具有大约35％至大约70％的孔隙率，或者大约40％至大约60％的孔隙率，而较高孔隙率层可以具有大约55％至大约80％，或者在大约60％至大约80％之间的孔隙率。
[00066]在中心层两面的每个上层和下层之内，低孔隙率层和高孔隙率层不必始终是相同的。因此，不同的低孔隙率层和不同的高孔隙率层可以存在于一个上层或下层之内。可选地，在上层和下层之内，低孔隙率层和高孔隙率层可以基本一致。
[00067]用在本发明方法中的多孔半导体结构的顶部和底部上的光的反射导致了与该结构的有效光学厚度相关的干涉花样。分析物分子与其固定在多孔半导体结构的表面上的相应探针的结合，导致该结构的折射率发生变化，并被检测为干涉花样上的相应位移。使用中的多孔半导体结构的折射率与该多孔半导体结构的折射率和存在于孔中的物质(内含物)的折射率相关。当孔中的分析物种类的浓度变化时，孔的内含物的折射率发生变化。例如，如果分析物分子为其折射率大于半导体结构的折射率的有机分子，则分析物分子的结合取代了较低折射率的种类(空气或其它蒸气介质)，并预期导致折射率的总值增加。折射率的增加应当导致干涉花样中波长向较长值位移，例如红向频移或“红(red)”移。
[00068]制造这样的多孔半导体结构的方法在本领域中是熟知的。例如参见已公开的美国专利申请20020192680。使用几种方法中的一种，可以产生粗糙的金属表面。
[00069]为了由多孔半导体结构形成生物传感器，将一种或多种结合分析物分子的探针与多孔半导体结构连接。所述一种或多种探针每一个包括(i)一个或多个半导体结合基团，其能够使它们与半导体结构连接(直接或通过偶联剂)，和(ii)一个或多个与分析物分子结合的分析物结合基团。尽管并不限于此，所述一个或多个半导体结合基团一般为羟基基团。所述一个或多个分析物结合基团可以包括，但并不限于氨基基团、硫醇、羟基、烷基链、酯、羧酸、芳族的、杂环或它们的组合。
[00070]合适的第一探针一般包括但不限于非聚合小分子、抗体、抗原、多核苷酸、寡核苷酸、受体、配体以及类似物。
[00071]适合用作第一探针的示例性非聚合小分子包括但不限于抗生物素蛋白、肽模拟化合物(peptido-mimetic compound)和万古霉素。一类肽模拟化合物公开在2000年5月10日提出的Miller等的美国专利申请序列号09/568,403中。结合脂多糖的肽模拟化合物是四色氨酸三环戊烷。也可以使用其它肽模拟化合物。
[00072]适合用作第一探针的示例性多肽包括但不限于细胞表面分子的受体或其片段；脂质A受体；抗体或其片段；公开在于1998年6月12日提出的Koide的美国专利申请序列号中09/096,749和于2001年11月19日提出的Koide的美国专利申请序列号10/006,760中的肽单体(monobodies)类型；脂多糖结合多肽；肽聚糖结合多肽；糖结合多肽；磷酸结合多肽；核酸结合多肽；以及特异性结合含蛋白质分析物的多肽。在一个实施方案中，第一探针是对具体含蛋白质分析物或者具体一类或一族含蛋白质分析物具有特异性的抗体。
[00073]示例性寡核苷酸第一探针可以是DNA、RNA或修饰(例如丙炔基化(propynylated))寡核苷酸类型，其公开在Barnes等，J.Am.Chem.Soc.123：4107-4118(2001)和Barnes等，J.Am.Chem.Soc.123：9186-9187(2001)中。寡核苷酸探针可以是适合于为预期分析物提供特异性的任何长度。一般地，不含有修饰核苷酸的寡核苷酸探针具有至少大约12至大约100个核苷酸的长度。对于含有修饰碱基的寡核苷酸而言，至少7个核苷酸到大约100个核苷酸的长度是合适的。
[00074]可以被一个或多个第一探针结合的分析物分子包括，但不限于蛋白质(包括但不限于酶、抗体或它们的片段)、糖蛋白、肽聚糖、糖类、脂蛋白、脂磷壁酸、脂质A、磷酸盐、通过某些病原体(例如细菌、病毒、多细胞真菌、酵母、原生动物、多细胞寄生虫等)表达的核酸或有机化合物，例如天然出现的毒素或有机战剂等。可以从任何来源检测这些分析物分子，包括体液、食物样品、水样、来自生物体的匀浆化组织等。
[00075]很多方法可用于将一个或多个第一探针附着到多孔半导体结构的表面上，这取决于最终要向那里附着的探针的类型。由于半导体结构的孔隙率，探针可以贯穿半导体结构的中心层和其上层与下层而与该半导体结构的暴露表面结合。
[00076]附着一个或多个第一探针的可用方法包括但不限于将探针与半导体结构的表面共价结合、将探针与半导体结构的表面离子结合、将探针吸附到半导体结构的表面上或类似方法。这样的结合也可以包括将探针与(偶联剂的)另一部分共价或非共价地连接，再被共价或非共价附着到半导体结构的表面上。
[00077]基本地，半导体结构的氧化和水解表面首先被附着在其表面的偶联剂官能化(例如已加上底涂层(primed))。这通过提供偶联剂前体，然后将偶联剂前体与半导体结构的表面共价或非共价地结合而得以实现。半导体表面已经被官能化后，在下述条件下，探针暴露于附着在半导体表面上的官能团，所述条件可有效地(i)共价或非共价结合偶联剂，或(ii)取代偶联剂，以使第一探针共价或非共价地直接与半导体表面结合。所述第一探针与半导体结构的结合在这样的条件下进行，所述条件有效地使其上的一种或多种分析物结合基团保持可用于结合分析物分子。
[00078]合适的偶联剂前体包括但不限于用环氧基、硫醇或链烯基官能化的硅烷；和含卤化物的化合物。
[00079]硅烷包括与半导体结构的表面结合的第一部分和与探针结合的第二部分。优选的硅烷包括但不限于具有C1-6烷氧基基团的3-环氧丙氧基丙基三烷氧基硅烷、具有C2-12烷基基团和C1-6烷氧基基团的三烷氧基(环氧乙烷基烷基)硅烷、具有C1-6烷氧基基团的2-(1，2-环氧环己基)乙基三烷氧基硅烷、具有C1-6烷氧基基团的3-丁烯基三烷氧基硅烷、具有C2-12链烯基基团和C1-6烷氧基基团的链烯基三烷氧基硅烷、具有C2-12烷基基团的三[(1-甲基乙烯基)-氧]3-环氧乙烷基烷基硅烷、具有C1-6烷氧基基团的[5-(3，3-二甲基环氧乙烷基)-3-甲基-2-戊烯基]三烷氧基硅烷、(2，3-环氧乙烷二基二-2，1-乙二基)双-三乙氧基硅烷、具有C1-6烷氧基基团和C2-12烷基基团的三烷氧基[2-(3-甲基环氧乙烷基)烷基]硅烷、三甲氧基[2-[3-(17，17，17-三氟-十七烷基)环氧乙烷基]乙基]硅烷、三丁氧基[3-[3-(氯甲基)环氧乙烷基]-2-甲基丙基]硅烷以及它们的组合。根据硅烷化反应方案，可以将硅烷连接到半导体结构上，其条件是本领域普通技术人员熟知的。
[00080]在本领域普通技术人员熟知的条件下，也可以将卤化物连接到半导体结构上。
[00081]之后，根据由偶联剂提供的官能度的类型，使一个或多个第一探针与半导体结构结合。一般地，在水环境或水/醇环境下，使第一探针附着于偶联剂或者代替偶联剂而附着到半导体结构上。例如环氧官能团可以被打开，以允许结合氨基基团、硫醇或醇；链烯基官能团可以进行反应以允许结合链烯基。当使用卤化物偶联剂时，卤化物偶联剂一般在将官能化半导体结构暴露于一个或多个含有作为半导体结合基团的醇基团的探针之后被取代。
[00082]在一个或多个第一探针含有两个或多个分析物结合基团的情况下，分析物结合基团也可能与半导体结构的官能化表面相互作用并与之结合。为排除这种情况发生，也可以将官能化多孔半导体结构暴露于链端封接剂(blocking agent)，以最小化一个或多个探针可以附着到半导体结构表面上的部位的数量。在将半导体结构的官能化表面暴露于探针之前或同时，将其暴露于链端封接剂，但同时暴露通常为优选。链端封接剂可以在结构上与第一探针相似，只是它们缺乏分析物结合基团，或者链端封接剂可以是简单的封端剂。举例说明，可以将氨基酸烷基酯(例如甘氨酸甲酯、甘氨酸乙酯、3-丙氨酸甲酯等)链端封接剂引入到环氧官能化(epoxide-functionalized)的半导体结构中，其中甘氨酸的氨基打开环氧环(epoxide ring)，并与偶联剂共价连接。
[00083]生物传感器的折射率上的可检测的变化发生在一个或多个第一探针与分析物分子结合之后，这取决于所使用的检测器类型的灵敏度。许多广泛可用的检测器能够对大约2nm或更大的光致发光峰发射位移进行检测。
[00084]当需要定量检测时，光致发光峰发射位移的大小与暴露于含分析物的样品之后在孔中出现的结合分析物的量有关。知道了可以结合生物传感器的分析物的最大量，例如在表面结合的第一探针上有效分析物结合基团的数量，以及知道了在这些条件下可以获得的最大位移，基于发生的可检测位移，可能预测样品中分析物的定量浓度。
[00085]对于用作微阵列检测器，其适合用于检测生物样品中所含的分析物，例如血尿、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰、脑脊髓液、眼泪或粘液，在生物传感器上的很多位置或区域是官能化的，以包括对于期望分析物为特异性的第一探针。例如，被选择来结合特定分子或含有表位的特定类型分子的抗体可以被放置在生物传感器的不连续区域中。在每一个这些位置上的一个或多个探针可以是相同的(与相同的分析物结合)或者是不同的(被选择来结合不同的分析物)。
[00086]本发明方法使用半导体生物传感器的上述性质，检测多层的生物分子相互作用，其被称为“级联传感(cascade sensing)”或“级联结合(cascade binding)”。在级联结合中，分析物一旦与第一探针结合在复合物中，则成为与结合复合物中任一分子结合的拉曼活性或荧光活性探针的结合分析物。如本领域普通技术人员应当意识到的，与结果基于单探针结合的方法相比，基于级联结合的传感减少了由探针的非特异性结合所产生的误报(false positive)百分率。
[00087]拉曼活性探针是指包括拉曼活性标签，并适合与期望的结合复合物或第一探针结合的任何探针。例如，在一个实施方案中，第一探针为一抗，由于其与样品中已知的含蛋白质分析物的特异性结合而被选择，拉曼活性探针可以是二抗，其与一抗结合并含有拉曼活性标签。在其中附着于传感器的第一探针是对多种已知含蛋白质分析物具有特异性的众多抗体的实施方案中，拉曼活性探针可以是含有与一抗结合的拉曼活性标签的二抗，这在本领域中是已知的。在本实施方案中，拉曼活性探针可以是对具体类型抗体具有特异性的二抗，例如IgG或IgA，以及所使用的拉曼活性探针可以是全部相同的。可选地，也可以使用不同的拉曼活性抗体作为拉曼活性探针。
[00088]适合例如通过与二抗结合包括在拉曼活性探针中的拉曼活性标签包括拉曼活性荧光团或有机分子。在本发明方法中适合用作拉曼活性标签的有机分子包括腺嘌呤及其类似物，例如4-氨基-吡唑并(3，4-d)嘧啶、2-氟腺嘌呤、N6-苯甲酰腺嘌呤、激动素、二甲基-烯丙基-氨基-腺嘌呤、玉米素、溴-腺嘌呤、8-氮杂-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、4-氨基-6-巯基吡唑并(3，4-d)嘧啶、8-巯基腺嘌呤或9-氨基-吖啶。拉曼活性有机化合物通常具有小于大约300道尔顿的分子量。拉曼活性标签也可以是或含有荧光标记。
[00089]为增强由拉曼活性探针所产生的拉曼光谱，在本发明方法的一个实施方案中，可以考虑，在拉曼活性探针与第一探针和分析物的复合物结合之后，将拉曼活性探针原位转化为SERS活性探针。为了这个目的，将透明金属例如金或银的层沉积在传感器上层和/或其上的结合复合物的粗糙表面上，以提供具有粗糙表面的金属层(图3C)。例如，通过在还原剂存在下使待覆盖的表面接触金属阳离子的胶体溶液，以促成金属纳米颗粒层的形成，可以形成金属层。金属层应当具有的厚度为发光光源波长的大约一半，例如从大约15nm至大约500nm，诸如大约100nm至大约200nm。
[00090]使用几种方法中的一种，可以产生粗糙金属表面。粗糙特征(roughness features)为数十纳米的量级；与入射激发辐射的波长相比是小的。颗粒的小尺寸允许金属颗粒的表面等离子激发被定位在颗粒上。可以以很多方式获得金属表面的金属粗糙特征；例如，金属颗粒的气相沉积或者将金属胶体应用到生物传感器的上层上。因为金属的表面电子局限在颗粒，颗粒的尺寸小，所以等离子激发(plasmonexcitation)也就局限于粗糙特征。所形成的等离子的电磁场非常强，与拉曼信号相比，极大地增强了SERS信号。据估计，少于1％的光子是非弹性地拉曼散射的。然而，在本发明方法的实施方案中，其中来自散射分子的拉曼信号的强度在SERS条件下被极大地增强，可以在低至微微摩尔和毫微微摩尔的浓度下，检测低浓度的拉曼活性分析物。在一些情况下，本发明的方法可以通过在适合还原金属阳离子的条件下，使生物传感器的上层与金属阳离子接触，用于检测在复杂生物样品例如血清中单个分析物分子的存在。可以沉积金属纳米颗粒例如银或金的薄层。
[00091]例如，可以喷射(sputter)或蒸发(evaporate)金属样品，以直接沉积到生物传感器上。可选地，制备含有合适的金属阳离子和还原剂的水溶液，并使其经受原位还原金属阳离子的条件，以便在生物传感器表面以及附着在其上的分子上以薄层形式形成中性的、胶状的金属纳米颗粒。
[00092]拉曼活性有机标签将在胶体形成过程中被吸附到金属上。由于拉曼活性标签非常接近金属层，所以照射之后标签将产生表面增强拉曼散射(SERS)。
[00093]本发明方法不同于其它类型的拉曼光谱法或SERS技术，在这些技术中，拉曼活性分子被合适的光源直接照射，并检测拉曼或SERS光谱。在本发明的方法中，拉曼活性分子间接地被荧光照射，荧光是在照射生物传感器之后由生物传感器本身产生的。通过用发射白生物传感器的荧光激发其中的拉曼活性标签，从拉曼活性探针(例如抗体)产生了拉曼或SERS信号。
[00094]由于来自被照射生物传感器的重复荧光发射，拉曼信号在整个光谱范围内产生。
[00095]在本发明方法的一个实施方案中，法布里-珀罗干涉仪可以用于仅传输SERS或拉曼信号的某些线，并且可以使用单通道检测器收集传输信号。例如，可以通过调节干涉仪的传输线(transmission line)，收集一定范围的光谱。在不同激发波长下产生的拉曼信号产生了关于感兴趣的结合生物分子的不同光谱信息。
[00096]法布里-珀罗干涉仪是根据相长干涉(constructive interference)的原理而工作的高分辨率、高通量光学光谱仪。倘若单色点光源通过共扼透镜对(conjugate lens pair)成像(干涉仪在它们中间)，射线将相长地或相消地在干涉仪中干涉。因此，在像平面上看见一个亮点或暗点。采用分布的单色光源，不同的射线在腔的内部传播不同的光程长度，并且法布里-珀罗干涉仪成为角度过滤器(angle filter)，导致特有的圆形“艾里”条纹花样。稍微改变板间距，或者调整光源，艾里斑的“相”发生变化。在扫描模式下使用，法布里-珀罗干涉仪可以用于将来自单个探针大小的光子成像到检测器上。然后通过压电驱动器(piezoelectric actuator)扫描镜面。该技术有效地移动了干涉仪的相长干涉通带，允许扫描从研究中的发光流(luminescet flow)散射的光子的光谱图(图4)。
[00097]在另一个实施方案中，本发明提供了一个系统，其包括生物传感器、放置以照射生物传感器的发光源(例如氩、镉、氦或氮激光器以及所附的光学器件)以及检测器(例如聚光透镜、单色仪和检测器)，检测器被放置以捕获来自生物传感器的光致发光发射和检测来自生物传感器的光致发光发射的变化。发光源和检测器都可以存在于拉曼光谱仪中。具有合适微处理器的计算机可以与检测器连接，接收来自光谱仪的数据，并分析该数据，以比较生物传感器暴露于分析物前后的光致发光。
[00098]在又一个实施方案中，本发明涉及通过在有效地使样品中分析物与生物传感器的一个或多个探针结合的条件下，将生物传感器暴露于样品，检测样品中分析物的方法。在这样的暴露之后，测定生物传感器是否发射了已被改变的光致发光发射图样，这表示样品中存在分析物。可以观察到两种类型的改变。多孔硅膜在它们的白色光反射光谱中显示了法布里-珀罗条纹(参见″Luminescent Color Image Generationon Porous Si″Doan，V.V.；Sailor，M.J.Science 1992，256，1791-1792)。暴露于合适的互补结合对之后，结合发生，并且被观察为法布里-珀罗条纹的波长位移。另外，微腔的共振图存在位移。
[00099]为测定位移是否发生，在暴露于样品之前，测量第一个(基线)光致发光发射图样，在暴露于样品之后，测量第二个光致发光发射图样，并比较第一个与第二个发射图样。小至约2nm的位移可以表明样品中存在分析物。一般地，位移的大小将取决于待识别分析物的大小及其在样品内的浓度。使用上述检测设备可以进行这种测定。
[00100]可以使用本发明的方法检测的样品包括血液、水、水溶液中的固体悬浮液(例如食物颗粒、泥土颗粒等)或来自临床分离物(例如来自哺乳动物患者的组织匀浆)的细胞悬液。如果样品包括细胞，则在将样品暴露于生物传感器之前，期望但不是必须以有效破裂细胞膜的方式处理样品。这通过不改变要求检测的分析物的结构的化学方法、机械方法(弗氏细胞压碎器)、超声处理或冷冻(和解冻)方法可以实现。
[000101]根据所有上述，应当意识到，用于筛选生物样品的本发明方法可以与合适的探针一起使用，用于限定蛋白质组学的蛋白质-蛋白质相互作用、用于限定在基因转录事件调节中所涉及的分子相互作用配偶体、用于基因组分析、用于代谢物组分析(metabonomic analysis)以及一般地用于筛选药物以确定它们与具体蛋白质或核酸的相互作用，以及用于筛选组合文库，以确定结合具体探针的种类(其本身可以是用于治疗或预防治疗的生化分析物)。
[000102]另外，可以使用本发明方法，构建来自具体个体的身体样品的蛋白质谱，或者构建这样的蛋白质谱文库，目的是测定从具有已知疾病的患者所获得的具体类型体液与从健康个体所获得的可比样品的的蛋白质谱差异。最终，通过将受试者的蛋白质谱与可比的健康或正常样品的蛋白质谱比较，可将这样的图库用于在诊断上筛选受试者。
[000103]下面的实施例仅用于举例说明，并非限制本发明。
                            实施例
通过拉曼光谱法鉴定DNA
[000104]用荧光分子TAMRA在不同位置标记相同序列的单链DNA(图4)。取决于标记的位置，标记DNA分子产生了独有的拉曼信号，如图5所示。
[000105]尽管在此已经详细地描述了优选的实施方案，但各种各样的修改、添加、取代以及类似行为可以在不背离本发明的精神下进行，这对于相关领域的普通技术人员而言是显而易见的，因此这些都被认为是在所附的权利要求书所定义的本发明的范围之内。

Claims (46)

1.一种用于分析生物样品中内含物的方法，包括：
a)在合适的结合条件下，使所述生物样品与纳米多孔半导体传感器接触，所述纳米多孔半导体传感器包括纳米多孔半导体结构和连接到所述多孔半导体结构上的一个或多个第一探针，所述纳米多孔半导体结构包括置于上层和下层之间的中心层，所述上层和下层都包括大约5至大约20层交替多孔性层；所述一个或多个第一探针特异性结合所述样品中的至少一个分析物，形成一个或多个结合复合物；
b)在适合促进它们的特异性结合的条件下，使所述一个或多个结合复合物与拉曼活性探针接触；
c)照射所述传感器，以便从所述传感器引发荧光发射，所述发射产生来自所述结合复合物的拉曼光谱；和
d)检测由所述结合复合物产生的拉曼信号；其中，与所述结合分析物有关的拉曼信号表明所述样品中所述分析物的存在以及类型。
2.权利要求1所述的方法，其中所述半导体是硅。
3.权利要求1所述的方法，其中所述上层和下层都包括9至10层交替多孔性层。
4.权利要求1所述的方法，其中所述多孔半导体结构包括平均孔大小在大约10nm至大约100nm之间的孔。
5.权利要求1所述的方法，其中所述第一探针是非聚合小分子，其选自抗生物素蛋白、肽模拟化合物和万古霉素。
6.权利要求1所述的方法，其中所述第一探针是结合脂多糖的四色氨酸三环戊烷。
7.权利要求1所述的方法，其中所述第一探针是多肽，其选自细胞表面分子的受体、脂质A受体、抗体或其片段、肽单体、脂多糖结合多肽、肽聚糖结合多肽、糖结合多肽和磷酸结合多肽。
8.权利要求1所述的方法，其中所述第一探针是与所述样品中的含蛋白质分析物特异性结合的抗体，并且所述拉曼活性探针包括二抗和拉曼活性标记。
9.权利要求1或8所述的方法，进一步包括将厚度为照射所述生物传感器的光源波长的大约一半的金或银纳米颗粒层沉积到所述结构的上层和其上结合的拉曼活性探针上，使得所产生并检测的拉曼光谱是SERS光谱。
10.权利要求1所述的方法，其中所述传感器进一步包括一个或多个偶联剂，每一个偶联剂包括附着在所述多孔半导体结构上的第一部分和结合所述第一探针的第二部分。
11.权利要求10所述的方法，其中所述一个或多个偶联剂是硅烷。
12.权利要求10所述的方法，其中所述一个或多个第一探针的每一个包括众多结合部位，所述众多结合部位中的至少一个与所述分析物结合，并且所述众多结合部位中的至少一个与所述偶联剂的所述第二部分结合。
13.权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个第一探针是相同的。
14.权利要求1所述的方法，其中所述第一探针是众多一抗，其与众多不同的含蛋白质分析物特异性结合，并且所述拉曼活性探针包括二抗和拉曼活性标记。
15.权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个第一探针贯穿所述中心层和上层及下层而连接到所述多孔半导体结构上。
16.权利要求9所述的方法，其中所述SERS光谱产生于整个光谱范围内。
17.权利要求16所述的方法，其中所述检测包括使用法布里-珀罗干涉仪传输所述信号的仅仅某些线，同时使用单通道检测器收集所述传输信号。
18.权利要求17所述的方法，其中通过调节所述干涉仪的传输线进行扫描，收集一定范围的SERS光谱。
19.权利要求1所述的方法，其中通过使用不同的激发波长，产生关于一个或多个所述结合复合物中分析物的不同光谱信息，顺序地产生所述拉曼信号。
20.权利要求1或8所述的方法，其中所述样品是体液、水溶液中的固体悬液、细胞提取物或组织匀浆。
21.权利要求20所述的方法，其中所述体液选自尿、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰、脑脊髓液、眼泪和粘液。
22.权利要求1所述的方法，进一步包括：在所述接触之前，以有效破裂所述样品中细胞的细胞膜的方式处理所述样品。
23.权利要求22所述的方法，其中所述处理包括化学处理、机械处理、超声处理或冷冻处理。
24.一种检测系统，包括：
a)纳米多孔生物传感器，其包括：
多孔半导体结构，其包括置于上层和下层之间的中心层，所述上层和下层都包括交替多孔性层；
b)发光源，其被安置以照射所述生物传感器；和
c)检测器，其被安置以捕获来自结合于所述传感器的复合物的拉曼信号。
25.权利要求24所述的系统，进一步包括检测器，其被放置以捕获来自所述生物传感器的光致发光发射，并且在生物分子与所述结构中一个或多个孔结合之后，检测来自所述生物传感器的光致发光发射的变化。
26.权利要求24所述的检测系统，其中所述发光源是汞灯或钨丝灯。
27.一种检测生物样品中含蛋白质分析物存在的方法，包括：
a)在有效地使其中的所述含蛋白质分析物与至少一个连接到纳米多孔生物传感器上的第一探针发生特异性结合的条件下，接触所述样品，所述纳米多孔生物传感器包括：
纳米多孔硅结构，其包括置于上层和下层之间的中心层，所
述上层和下层都包括交替多孔性层；至少一个连接到所述多孔半
导体结构上的第一探针；
所述结合形成一个或多个结合复合物；
b)使所述结合复合物与结合所述复合物的拉曼活性探针接触；
c)用银或金纳米颗粒的薄层覆盖所述结合复合物；
d)照射所述传感器，以从所述传感器引发荧光发射，所述发射产生来自所述结合复合物的SERS信号；和
e)检测由所述SERS信号产生的SERS光谱；其中，与结合的含蛋白质分析物有关的SERS光谱表明样品中含蛋白质分析物的存在。
28.权利要求27所述的方法，其中所述上层和下层都包括6层或更多层交替多孔性层。
29.权利要求27所述的方法，其中所述多孔半导体结构包括平均孔大小在大约10nm至大约100nm之间的孔。
30.权利要求27所述的方法，其中所述第一探针包括特异性结合所述样品中至少一种含蛋白质分析物的抗体，并且所述拉曼活性探针包括二抗和拉曼活性标记。
31.权利要求27或30所述的方法，其中所述第一探针是众多一抗，所述一抗对众多不同的含蛋白质分析物具有特异性，以及所述拉曼活性探针包括二抗和拉曼活性标记。
32.权利要求27或30所述的方法，其中所述SERS信号产生于整个光谱范围内。
33.权利要求32所述的方法，其中所述检测包括使用法布里-珀罗干涉仪传输所述信号的仅仅某些线，同时使用单通道检测器收集所述传输信号。
34.权利要求33所述的方法，其中通过调节所述干涉仪的传输线，进行扫描，收集一定范围的光谱。
35.权利要求27所述的方法，其中通过使用不同的激发波长，产生关于一个或多个所述结合复合物中分析物的不同光谱信息，顺序地产生所述拉曼信号。
36.权利要求27所述的方法，其中所述检测鉴定至少一种含蛋白质分析物。
37.权利要求27所述的方法，其中所述样品包括尿、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰、脑脊髓液、眼泪、粘液、体液中的固体悬液或组织匀浆。
38.权利要求37所述的方法，其中所述样品是来自临床分离物的细胞悬液。
39.权利要求27所述的方法，进一步包括：在所述接触之前，以有效破裂所述样品中细胞的细胞膜的方式处理所述样品。
40.权利要求27所述的方法，其中拉曼标签选自腺嘌呤、4-氨基-吡唑并(3，4-d)嘧啶、2-氟腺嘌呤、N6-苯甲酰腺嘌呤、激动素、二甲基-烯丙基-氨基-腺嘌呤、玉米素、溴-腺嘌呤、8-氮杂-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、4-氨基-6-巯基吡唑并(3，4-d)嘧啶、8-巯基腺嘌呤或9-氨基-吖啶。
41.一种分析生物样品的内含物的方法，包括：
a)在合适的结合条件下，使所述生物样品与纳米多孔半导体传感器接触，所述纳米多孔半导体传感器包括纳米多孔半导体结构和一个或多个连接到所述多孔半导体结构的第一探针，所述纳米多孔半导体结构包括置于上层和下层之间的中心层，所述上层和下层都包括大约5至大约20层交替多孔性层；所述一个或多个第一探针特异性结合所述样品中的至少一种分析物，形成一个或多个结合复合物；
b)在适合促进它们的特异性结合的条件下，使所述一个或多个结合复合物与荧光活性探针接触；
c)照射所述传感器，以从所述传感器引发荧光发射，所述发射产生来自所述结合复合物的二次荧光发射；和
d)检测由所述结合复合物产生的所述二次荧光发射；其中与结合分析物有关的二次荧光发射表明所述样品中所述分析物的存在和类型。
42.权利要求41所述的方法，其中所述第一探针是与众多不同的含蛋白质分析物特异性结合的众多一抗，以及所述荧光活性探针包括二抗和荧光标记。
43.一种分析生物样品的内含物的方法，包括：
a)在合适的结合条件下，使所述生物样品与纳米多孔半导体传感器接触，所述纳米多孔半导体传感器包括纳米多孔半导体结构和一个或多个连接到所述多孔半导体结构的第一探针，所述纳米多孔半导体结构包括置于上层和下层之间的中心层，所述上层和下层都包括大约5至大约20层交替多孔性层；所述一个或多个第一探针特异性结合所述样品中的至少一种分析物，形成一个或多个结合复合物；
b)照射所述传感器，以引发来自所述结合复合物中分析物的光发射；和
c)检测由所述结合复合物中分析物产生的所述光发射；其中所述光发射提供关于所述结合复合物中分析物的存在和类型的信息。
44.权利要求43所述的方法，其中所述分析物是含蛋白质分析物或DNA分子。
45.权利要求44所述的方法，其中所述光发射是拉曼信号。
46.权利要求44所述的方法，其中所述光发射是荧光。
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