JP4607127B2 - 多孔性バイオセンサーおよびラマン分光法を用いる生体分子の検出 - Google Patents
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Description
本発明は一般的に、試料における生体分子の存在を同定するために有用な多孔性バイオセンサーに関し、より詳しくは本発明は、試料中の生体分子の有無を検出するために、ラマン分光法およびナノ多孔性半導体に基づくバイオセンサーを用いることに関する。
様々な生物学的および有機環境における低濃度分析物の検出および分析に対する関心が高まってきている。そのような分析物の定性分析は一般的に、より高濃度レベルに限定されており、定量分析は通常、放射性同位元素または蛍光試薬による標識を必要とする。そのような技法は一般的に時間がかかり、不便である。
本発明の一つの局面は、複雑な生体試料において所望の分析物に対して特異的に結合するように、多孔性の半導体構造と、多孔性の半導体構造に共役させた一つまたはそれ以上の第一のプローブとを含む生体センサーを用いる方法に関する。第二のラマン活性プローブ構築物が第一のプローブを含む複合体に結合すると、試料中に関連する特異的分析物が存在することが同定される。本発明の方法は、患者の試料のタンパク質プロフィールを得るために特に有用である。
ラマン分光法によるDNAの同定
同一の配列の一本鎖DNAを、異なる位置で蛍光分子TAMRAによって標識した(図4)。標識の位置に応じて、標識されたDNA分子は、図5に示されるように独自のラマンシグナルを生成した。
Claims (44)
- 以下を含む、生体試料の内容物を分析する方法:
a) 生体試料を、上層と下層のそれぞれが交互に高い多孔性と低い多孔性の4〜40層を含む、上層と下層の間に挟まれた中心層を含むナノ多孔性の半導体構造、及び、多孔性半導体構造に共役させた一つまたはそれ以上の第一のプローブとを含むナノ多孔性半導体センサーと、適した結合条件で接触させる段階であって、一つまたはそれ以上の第一のプローブが試料中の少なくとも一つの分析物に特異的に結合して、一つまたはそれ以上の結合複合体を形成する段階;
b) 一つまたはそれ以上の結合複合体を、その特異的結合を促進するのに適した条件でラマン活性プローブに接触させる段階;
c) ナノ多孔性半導体センサーからの蛍光の放出を引き起こすためにナノ多孔性半導体センサーに光を照射する段階であり、その放出が結合複合体からのラマンスペクトルを産生する、段階;および
d) 結合複合体によって産生されたラマンシグナルを検出する段階であり、結合した分析物に関連するラマンシグナルによって、試料における分析物の存在およびタイプが示される、段階。 - 半導体がシリコンである、請求項1記載の方法。
- 上層と下層のそれぞれが交互に高い多孔性と低い多孔性の9層から10層を含む、請求項1記載の方法。
- 多孔性の半導体構造が、平均孔径10 nm〜100 nmを有する孔を含む、請求項1記載の方法。
- 第一のプローブがアビジン、ペプチド模倣化合物、およびバンコマイシンからなる群より選択される非ポリマー性低分子である、請求項1記載の方法。
- 第一のプローブが、リポ多糖類に結合するテトラトリプトファンter-シクロペンタンである、請求項1記載の方法。
- 第一のプローブが、細胞表面分子の受容体、リピッドA受容体、抗体またはその断片、ペプチドモノボディ、リポ多糖類結合ポリペプチド、ペプチドグリカン結合ポリペプチド、糖質結合ポリペプチド、およびホスフェート結合ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドである、請求項1記載の方法。
- 第一のプローブが試料中のタンパク質含有分析物に特異的に結合する抗体であって、ラマン活性プローブが第二抗体およびラマン活性標識を含む、請求項1記載の方法。
- 産生および検出されるラマンスペクトルがSERSスペクトルであるように、ナノ多孔性半導体構造の上層およびその上に結合したラマン活性プローブにわたって、バイオセンサーに光を照射する光源の波長の約半分の厚さを有する金または銀ナノ粒子の層を沈着させる段階をさらに含む、請求項1または8記載の方法。
- センサーが、それぞれが多孔性の半導体構造に結合する第一の部分と第一のプローブに結合する第二の部分とを含む、一つまたはそれ以上の共役物質をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 一つまたはそれ以上の共役物質がシランである、請求項10記載の方法。
- 一つまたはそれ以上の第一のプローブのそれぞれが、その少なくとも一つが分析物に結合して、その少なくとも一つが共役物質の第二の部分に結合する、複数の結合部位を含む、請求項10記載の方法。
- 一つまたはそれ以上の第一のプローブが同じである、請求項1記載の方法。
- 第一のプローブが、異なる複数のタンパク質含有分析物に特異的に結合する複数の一次抗体であって、ラマン活性プローブが二次抗体およびラマン活性標識を含む、請求項1記載の方法。
- 一つまたはそれ以上の第一のプローブが、中心層ならびに上層および下層を通して多孔性の半導体構造に共役される、請求項1記載の方法。
- SERSスペクトルが、赤外領域、可視部分、および紫外領域から成る群より選択されるスペクトル範囲にわたって産生される、請求項9記載の方法。
- 検出する段階が、シグナルの特定の線のみを透過するようにファブリー-ペロー干渉計を用いることを含み、透過したシグナルが単チャンネル検出器を用いて回収される、請求項16記載の方法。
- SERSスペクトルが、赤外領域、可視部分、および紫外領域から成る群より選択されるスペクトル範囲にわたって干渉計の透過線を走査することによって回収される、請求項17記載の方法。
- ラマンシグナルが、一つまたはそれ以上の結合複合体における分析物に関する異なるスペクトル情報を生じるように、異なる励起波長を用いて連続的に産生される、請求項1記載の方法。
- 試料が体液、水溶液における固体の懸濁液、細胞抽出物、または組織ホモジネートである、請求項1〜8記載の方法。
- 体液が尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、便、喀痰、脳脊髄液、涙液、および粘液から選択される、請求項20記載の方法。
- 接触させる段階の前に、試料中の細胞の細胞膜を破壊するために有効な方法で試料を処理する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 処理する段階が化学処理、機械処理、超音波処理、または凍結を含む、請求項22記載の方法。
- 以下を含む検出システム:
a) 以下を含むナノ多孔性生体センサー:
上層と下層のそれぞれが交互に高い多孔性と低い多孔性の層を含む、上層と下層の間に挟まれる中心層を含む多孔性の半導体構造;
b) 生体センサーに光を照射するように配置された光源;および
c) センサーに結合した複合体からのラマンシグナルを捕獲するように配置された検出器。 - 構造における一つまたはそれ以上の孔に生体分子が結合すると、生体センサーからのフォトルミネッセント放出を捕獲して、生体センサーからのフォトルミネッセント放出の変化を検出するように配置された検出器をさらに含む、請求項24記載のシステム。
- 光源が水銀またはタングステン灯である、請求項24記載の検出システム。
- 以下を含む、生体試料中のタンパク質含有分析物の存在を検出する方法:
a) 以下を含むナノ多孔性生体センサーに共役させた少なくとも第一のプローブに、その中のタンパク質含有分析物を特異的に結合させるために有効な条件で、試料を接触させる段階であって、結合が一つまたはそれ以上の結合複合体を形成する段階:
上層および下層のそれぞれが交互に高い多孔性と低い多孔性の層を含む上層と下層の間に挟まれた中心層を含むナノ多孔性シリコン構造、ならびに多孔性の半導体構造に共役させた少なくとも一つの第一のプローブ;
b) 複合体に結合するラマン活性プローブに結合複合体を接触させる段階;
c) 銀または金ナノ粒子の薄層によって結合複合体を覆う段階;
d) その放出によって結合複合体からのSERSシグナルが生成される、センサーからの蛍光放出を引き起こすためにセンサーに光を照射する段階;および
e) 結合タンパク質含有分析物に関連したSERSスペクトルによって試料中にタンパク質含有分析物が存在することが示される、SERSシグナルによって産生されたSERSスペクトルを検出する段階。 - 上層と下層のそれぞれが交互に高い多孔性と低い多孔性の六つまたはそれ以上の層を含む、請求項27記載の方法。
- 多孔性半導体構造が平均孔径10 nm〜100 nmを有する孔を含む、請求項27記載の方法。
- 第一のプローブが試料中の少なくとも一つのタンパク質含有分析物に対して特異的に結合する抗体を含み、ラマン活性プローブが第二抗体およびラマン活性標識を含む、請求項27記載の方法。
- 第一のプローブが複数の異なるタンパク質含有分析物に対して特異性を有する複数の一次抗体であって、ラマン活性プローブが二次抗体およびラマン活性標識を含む、請求項27または30記載の方法。
- SERSシグナルがスペクトル範囲にわたって産生される、請求項27または30記載の方法。
- 検出する段階が、シグナルの特定の線のみを透過するようにファブリー-ペロー干渉計を用いることを含み、透過したシグナルが単チャンネル検出器を用いて回収される、請求項32記載の方法。
- SERSスペクトルが、赤外領域、可視部分、および紫外領域から成る群より選択されるスペクトル範囲にわたって干渉計の透過線を走査することによって回収される、請求項33記載の方法。
- 異なる照射波長を用いてラマンシグナルが連続的に産生されて、一つまたはそれ以上の結合複合体においてタンパク質含有分析物に関する異なるスペクトル情報を生じる、請求項27記載の方法。
- 検出する段階が、少なくとも一つのタンパク質含有分析物を同定する、請求項27記載の方法。
- 試料が、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、便、喀痰、脳脊髄液、涙液、粘液、体液における固体の懸濁液、または組織ホモジネートを含む、請求項27記載の方法。
- 試料が臨床単離体からの細胞浮遊液である、請求項37記載の方法。
- 接触させる段階の前に、試料中の細胞の細胞膜を破壊するために有効な方法で試料を処置する段階をさらに含む、請求項27記載の方法。
- ラマンタグが、アデニン、4-アミノ-ピラゾロ(3,4-d)ピリミジン、2-フルオロアデニン、N6-ベンゾイルアデニン、キネチン、ジメチル-アリル-アミノ-アデニン、ゼアチン、ブロモ-アデニン、8-アザ-アデニン、8-アザグアニン、6-メルカプトプリン、4-アミノ-6-メルカプトピラゾロ(3,4-d)ピリミジン、8-メルカプトアデニン、または9-アミノ-アクリジンから選択される、請求項27記載の方法。
- 以下を含む、生体試料の内容物を分析する方法:
a) 上層と下層のそれぞれが交互に高い多孔性と低い多孔性の4〜40層を含む、上層と下層の間に挟まれた中心層を含むナノ多孔性半導体構造と、多孔性半導体構造に共役させた一つまたはそれ以上の第一のプローブとを含むナノ多孔性半導体センサーに、適した結合条件で生体試料を接触させる段階であって、一つまたはそれ以上の第一のプローブが試料中の少なくとも一つの分析物に特異的に結合して、一つまたはそれ以上の結合複合体を形成する段階;
b) その特異的結合を促進するために適した条件で蛍光活性プローブに一つまたはそれ以上の結合複合体を接触させる段階;
c) 放出によって結合複合体からの二次蛍光放出が生成される、センサーからの蛍光放出を引き起こすためにセンサーに光を照射する段階;および
d) 結合分析物に関連した二次蛍光放出によって試料における分析物の存在およびタイプが示される、結合複合体によって産生された二次蛍光放出を検出する段階。 - 第一のプローブが複数の異なるタンパク質含有分析物に特異的に結合する複数の一次抗体であって、蛍光活性プローブが二次抗体および蛍光標識を含む、請求項41記載の方法。
- 以下を含む、生体試料の内容物を分析する方法:
a) 上層と下層のそれぞれが交互に高い多孔性と低い多孔性の4〜40層を含む、上層と下層の間に挟まれた中心層を含むナノ多孔性半導体構造と、多孔性半導体構造に共役させた一つまたはそれ以上の第一のラマンプローブとを含む、ナノ多孔性半導体センサーに、適した結合条件で生体試料を接触させる段階であって、一つまたはそれ以上の第一のラマンプローブが試料中の少なくとも一つの分析物に特異的に結合して、一つまたはそれ以上の結合複合体を形成する段階;
b) 結合複合体における分析物からの蛍光放出を引き起こすためにセンサーに光を照射する段階であり、蛍光放出が結合複合体からSERSシグナルを産生する、段階;
c) 結合複合体における分析物によって産生されたSERSシグナルを検出する段階であり、SERSシグナルが結合複合体における分析物の存在およびタイプに関する情報を提供する、段階。 - 分析物がタンパク質含有分析物またはDNA分子である、請求項43記載の方法。
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