CN104458704B - 基于dna修饰的sers基底检测低浓度汞离子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于DNA修饰的SERS基底检测低浓度汞离子的方法，采用分步法制备均匀的金包裹二氧化硅纳米颗粒，并利用偶联剂将核壳结构纳米颗粒固定在石英玻璃片上构建SERS基底。将单链DNA分子通过巯基修饰在金包裹二氧化硅纳米颗粒的金壳层的表面。把制备的DNA适配体修饰的SERS基底浸泡在含有汞离子的溶液中，用去离子水清洗。利用G碱基和A碱基的SERS信号比值作为DNA在金属表面状态的光谱标准测量，通过分析特征拉曼峰及其比值变化实现对汞离子的定量和特异性检测。本发明相比现有技术具有以下优点：本发明方法灵敏度高，检测低限约为50nM；并且测量操作简单，成本低，可实现实时、快速测量。

Description

基于DNA修饰的SERS基底检测低浓度汞离子的方法

技术领域

本发明涉及一种基于DNA修饰的SERS基底检测低浓度汞离子的方法。

背景技术

汞离子是一种在水环境中普遍存在的污染物，对人类的健康和生态环境造成严重的危害。汞离子特别是甲基汞可以通过食物链在人体中富集，对中枢神经系统、消化系统及肾脏造成永久性伤害并引发各种慢性病。而甲基汞是通过水生物的将水溶性的汞离子(Hg^{2 +})甲基化而来。所以，对水环境中的汞离子定量、并且特异性的检测是大家一直关心的问题。一般的检测汞离子的方法往往灵敏度不高或特异性不好，操作不方便。最近，人们利用Thymine-Hg²⁺-Thymine(T-Hg²⁺-T)的配位化学设计了一些新的检测方法，包括电化学，荧光光谱方法等，但是在这些方法均需要在DNA分子的一端进行一些特殊的化学修饰，测量成本较高。

表面增强拉曼散射技术是一种近年来发展很快的无损、痕量测量技术，它是在具有纳米级粗糙度的贵金属颗粒或溶胶表面，在激光的照射下，吸附分子的拉曼散射信号大幅度增强的现象。与传统的拉曼光谱方法相比，灵敏度一般可以提高6-7个量级，甚至可以达到单分子测量水平。不过，金属离子，包括汞离子，本身不能产生拉曼信号，因而这种光谱技术不能直接测量金属离子。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于DNA修饰的SERS基底检测低浓度汞离子的方法，制备DNA分子的金包裹二氧化硅的核壳型纳米颗粒，基于该DNA分子的表面增强拉曼散射光谱的变化特性，对汞离子实现免标记特异性和定量化的测量和分析。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于DNA修饰的SERS基底检测低浓度汞离子的方法，包括以下步骤：

(1)采用分步法制备均匀的金包裹二氧化硅纳米颗粒，并利用偶联剂将核壳结构纳米颗粒固定在石英玻璃片上构建SERS基底；

(2)将作为适配体的单链DNA分子通过巯基修饰在金包裹二氧化硅纳米颗粒的金壳层的表面：其中，DNA的一端连接巯基，通过巯基共价修饰连接到纳米颗粒的金壳层表面；可以调节DNA分子的浓度，控制DNA分子在金属表面的数量及状态，该单链DNA分子包括捕获片段和信号输入片段，该捕获片段包括T碱基，且可和汞离子特异性相互作用形成T-Hg²⁺-T的结构，该信号输入片段包括连续的G碱基和A碱基，G碱基和A碱基的SERS信号比值作为DNA在金属表面状态的光谱标准；

(3)把制备的DNA适配体修饰的SERS基底浸泡在含有汞离子的溶液中，用去离子水清洗；

(4)基于DNA适配体修饰的SERS基底的拉曼光谱测量：利用G碱基和A碱基的SERS信号比值作为DNA在金属表面状态的光谱标准测量，通过分析特征拉曼峰及其比值变化实现对汞离子的定量特异性检测。

作为上述方案的进一步优化，该单链DNA分子中包括依次排列的5-15个T碱基数、5-10个G碱基和5-10个A碱基。

作为上述方案的进一步优化，该单链DNA为巯基修饰的含有依次排列的5-15个T碱基数、5-10个G碱基和5-10个A碱基的单链DNA。

作为上述方案的进一步优化，步骤(4)中，拉曼光谱测量时，用近红外激光激发待测样品，得到拉曼光谱后，用G碱基和A碱基的拉曼信号强度比值，即I(736cm^-1)/I(660cm^-1)定量分析汞离子浓度。

作为上述方案的进一步优化，将单链DNA分子通过巯基修饰在金包裹二氧化硅纳米颗粒的金壳层的表面，或者将单链DNA分子通过巯基修饰在纯金、纯银或者金银混合材料的金壳层表面。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明的一种基于DNA修饰的SERS基底检测低浓度汞离子的方法，制备了特殊的纳米材料，所制备的纳米颗粒形态均与，并适合用红外激光(如：785nm)得到表面增强拉曼散射效应，可以有效避免和减少来自样品背景荧光的干扰。并设计了特殊的单链DNA分子对纳米粒子进行修饰，在其表面控制连接了经过设计的特殊单链DNA，例如，对汞离子捕获来说，其序列含有连续的T碱基，能够和汞离子特异性的结合形成T-Hg2+-T的结构，它可以特异性识别和捕获汞离子。省去特殊的标记分子，可直接利用DNA的表面增强拉曼散射光谱进行定量检测，通过分析某些特征拉曼峰的光谱强度比值，例如，可以用I(736cm^-1)/I(660cm^-1)光谱指标分析，从而实现对PCB的高灵敏度、高特异性、痕量、无损、定量检测；

本发明中制备的金包裹二氧化硅纳米颗粒形貌和粒径均一性好，其等离子体激元共振吸收出现在750nm处，在785nm^-1激光激发下有较强SERS增强效应；经过处理的单链DNA在基底的表面具有高度统一的状态，当适配体与汞离子作用时，单链DNA会发生构象改变，其拉曼光谱强度变化的大小与被适配体捕获在金壳层表面的汞离子数量成一定的比例关系，从而基于SERS技术对汞离子特异性和定量化的测量。本发明的基于DNA修饰的SERS基底检测低浓度汞离子的方法具有高灵敏度，高特异性的优点，检测低限约为50nM；并且测量操作简单，成本低，可实现实时、快速测量。

附图说明

图1为本发明的基于DNA修饰的SERS基底检测低浓度汞离子的方法原理图。

图2为本发明的基于DNA修饰的SERS基底检测低浓度汞离子的方法的工艺流程图。

图3为本发明的优选实施例的SEM、TEM、UV-Vis和SERS方法对SiO₂@Au核壳纳米颗粒进行表征分析图。

图4为本发明的优选实施例的基于DNA修饰的SERS基底对不同浓度Hg²⁺前后观测单链DNA分子的拉曼光谱变化图。

图5本发明的优选实施例的基于DNA修饰的SERS基底对Hg²⁺检测的特异性验证分析图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

参见图2，本发明的一种基于DNA修饰的SERS基底检测低浓度汞离子的方法，包括以下步骤：

(1)采用分步法制备均匀的金包裹二氧化硅纳米颗粒，并利用偶联剂将核壳结构纳米颗粒固定在石英玻璃片上构建SERS基底。

具体包括：

1a:首先制备二氧化硅纳米颗粒。

1b:合成Au金种子，具体合成1-3nm的Au金种子。

1c:制备SiO₂@Au核壳结构纳米颗粒。

1d：将SiO₂@Au核壳结构纳米颗粒固定在石英玻璃片。

(2)将单链DNA分子通过巯基修饰在金包裹二氧化硅纳米颗粒的金壳层的表面构建DNA适配体修饰的SERS基底：适配体DNA的一端连接巯基，通过巯基共价修饰连接到纳米颗粒的金壳层表面，调节DNA分子的浓度，控制DNA分子在金属表面的数量及状态，该单链DNA分子包括捕获片段和信号输入片段，该捕获片段包括T碱基，且可和汞离子特异性相互作用形成T-Hg²⁺-T的结构，该信号输入片段包括连续的G碱基和A碱基，G碱基和A碱基的SERS信号比值作为DNA在金属表面状态的光谱标准。优选的，单链DNA分子中包括依次排列的5-15个T碱基数、5-10个G碱基和5-10个A碱基。

(3)把制备的DNA适配体修饰的SERS基底浸泡在含有汞离子的溶液中，等待2-4小时后取出，用去离子水清洗；

(4)基于DNA适配体修饰的SERS基底的拉曼光谱测量：利用G碱基和A碱基的SERS信号比值作为DNA在金属表面状态的光谱标准测量，通过分析特征拉曼峰及其比值变化实现对汞离子的定量特异性检测。优选的，测量时，用近红外激光激发待测样品，优选的，激发波长为785nm的激光激发待测样品。用特征拉曼峰的光谱强度的比值I(736cm^-1)/I(660cm^-1)作为光谱指标进行分析。

参见图1，本发明的基于DNA修饰的SERS基底定量检测汞离子的方法，DNA分子的末端的巯基便于将单链DNA分子固定在金属的表面；靠近巯基端设计有连续的T碱基，根据T碱基可以和Hg²⁺特异性的形成T-Hg²⁺-T的结构，该部分的碱基可以特异性的结合汞离子，作用是汞离子的捕获片段。在单链DNA的外端为连续的G碱基和A碱基，基于A碱基和G碱基在组成DNA的四种碱基中有最强的SERS信号，连续的G碱基和A碱基的拉曼信号的比值作为定量检测的信号输出部分，作用是拉曼信号输出片段。这种DNA适配体修饰的SERS传感器工作原理如下：在汞离子加入后，其首先和单链DNA中捕获片段特异性的结合，继而引发单链DNA的结构及其在金属表面的取向的改变。对应的，基于单链DNA适配体修饰的SERS基底信号发生改变，信号输出片段中G碱基和A碱基信号的比值I(736cm^-1)/I(660cm^-1)发生变化，分析该比值则可以实现对汞离子实现免标记定量特异性检测。

本发明的优选实施例的基于DNA修饰的SERS基底检测低浓度汞离子的方法：

步骤1：金包裹二氧化硅材料的基底制备及表征

(1.1)合成1-3nm金种子，在45mL的超纯水中加入0.5mL浓度为1.0M的氢氧化钠，紧接着加入50mM的THPC。在这里，THPC既做还原剂也用做表面活性剂。混合溶液剧烈搅拌5min后，加入36μL浓度为1.0M的氯金酸溶液。反应液的颜色立即从无色转变成深棕色，降低搅拌速度，继续搅拌15min。得到的反应液保存在4℃的冰箱里备用。然后，合成APTES修饰的二氧化硅纳米颗粒。对于制备二氧化硅纳米球，先把一定比例的氨水溶液(30wt％)与纯酒精溶液混合，再加入一定量的TEOS溶液，混合溶液低速搅拌过夜。这样制备得到二氧化硅颗粒直径范围100-500nm可调。取10mL乳白色产物加入过量的APTES(200μL)，混合液在常温条件下搅拌过夜。为了增加APTES在二氧化硅表面的连接效率，含有的APTES与二氧化硅的混合液78℃水浴2h，不断的添加酒精溶液维持反应体积恒定。APTES修饰的二氧化硅纳米粒子用酒精洗涤超声分散3次，最终溶解在6mL纯酒精中。之后，把金种子与二氧化硅连接。取150μL新鲜制备的APTES修饰的二氧化硅溶液加入到20mL未稀释的金种子溶液中。为提高金种子和二氧化硅的连接量可以在反应液中加入一定量氯化钠溶液。混合液轻微摇晃10min后，静置12h。为除去未固定在二氧化硅表面的金种子，超纯水与酒精交替清洗制备好的材料，最终连接金种子的二氧化硅纳米粒子溶解在4mL的纯水中。

(1.2)进行金壳层生长：25mg的碳酸钾溶液加入到100mL的超纯水中搅拌10min，接着加入36μL浓度为1.0M的氯金酸溶液。30min后，反应液的颜色逐渐从淡黄色转变成无色透明，说明金溶胶离子化。反应液封口放置于4℃冰箱中冷藏备用。取10mL冷藏的氯金酸溶液，加入含有金种子修饰的二氧化硅纳米粒子的水溶液150μL，立即添加10μL还原剂甲醛，温和搅拌，提高金溶液还原速率。反应溶液在15min内从淡紫红色转变为深绿色，通过离心分离终止反应。最终得到的金包裹二氧化硅纳米材料，离心洗涤后在超纯水中保存。

(1.3)将金包裹二氧化硅核壳纳米颗粒固定在石英片上，制作成SiO₂@Au核壳纳米颗粒分散均匀的SERS基底。为此，先把石英片浸泡在新鲜配制的水虎溶液(硫酸：过氧化氢＝7：3)中2h，可以80℃水浴提高石英片表面羟基化的效率。得到的石英片用大量去离子水冲洗，氮气吹干。在20mL超纯水中滴加20μL APTES溶液，新鲜处理的石英片浸在APTES溶液中15min后取出，酒精和水溶液交替冲洗，氮气吹干。氨基化的石英片浸没在新鲜制备的金包裹二氧化硅水溶液中，避光过夜处理。固定有材料的石英基片小心的用超纯水淋洗，自然晾干备用。

(1.4)通过TEM、UV-vis光谱及SEM对制备的SiO₂@Au核壳纳米颗粒进行表征。参见图3，由图3a中的单个核壳结构的TEM照片可以确定氧元素、硅元素和金元素的分布。从元素的分布中可以看出，金元素处于氧元素及硅元素的外部，中间颜色较淡，氧元素和硅元素重叠，说明金壳层包裹在二氧化硅的表面。由图3b中的纳米颗粒的UV-vis光谱显示，其吸收峰在750nm附近，有利于红光激发的SERS检测；由图3d中的SEM图片可以看出，核壳结构大小均一，每一个二氧化硅的表面均包裹有金壳层；由图3d中对比单链DNA分别在532nm和785nm激光激发条件下的SERS光谱可以看出，单链DNA在785nm激光激发条件下可以获得高信噪比的SERS信号。其原因为纳米颗粒可以和785nm激光形成共振，从而可以避开生物样品荧光，有利于单链DNA信号的检测。

步骤(2)用适配体即单链DNA分子修饰SiO₂@Au核壳纳米颗粒

把能够识别汞离子的适配体，即一种特殊序列的单链DNA连接到SiO₂@Au核壳纳米颗粒的表面。这种适配体富含T碱基，可以特异性的和汞离子结合形成T-Hg²⁺-T结构；适配体的另一端含有连续的G碱基和A碱基，可以作为DNA在金属表面状态拉曼指标。具体操作如下：把单链DNA进行预备处理并连接到纳米颗粒的金壳层上。这里选取巯基修饰的含有26碱基的单链DNA，即：5’-SH-(CH2)6-TTTTTTTTTTGGGGGGGGAAAAAAAA-3’作为汞离子的检测的适配体。巯基修饰的单链DNA在10mM的TCEP水溶液中孵育2h，利用NAP-5(GE healthcare)盐层析柱纯化去除过量的TCEP和盐离子。活化的单链DNA通过紫外可见吸收光谱在260cm^-1吸收值处标定其浓度，单链DNA浓度控制在20μM。单链DNA经90℃水浴10-15min后，立即冰水浴30min。5μL加热处理过的单链DNA样品滴加在新鲜制备的基底上，将基底放置于湿润的环境中，4℃保存过夜。连接好DNA的基底用纯水冲洗，去除非共价连接游离的单链DNA。

步骤(3)：汞离子的SERS光谱检测与分析

对于水溶液中汞离子检测，测量主要过程如下：把固定有巯基修饰的单链DNA的SERS基片浸泡在不同浓度的PCB水溶液中2h，样品用清水冲洗干燥之后，然后利用XploRA(HORIBA JOBIN YVON)拉曼光谱仪进行拉曼光谱测量，测量激发光使用785nm激光。

参见图4，单链DNA适配体与汞离子作用，其在SERS基底上的构象发生变化，由此而导致SERS光谱发生变化，结果如图4a所示。拉曼光谱上主要出现660cm^-1(归属于鸟嘌呤的呼吸振动)，736cm^-1(归属于腺嘌呤的呼吸振动)等几个显著的拉曼峰，考察它们对应的比值，分析发现I(736cm^-1)/I(660cm^-1)，被检测的汞离子浓度之间有确定的数值关系，如图4b所示。利用此关系，我们可以对汞离子进行定量测量。实验中，我们将固定有巯基修饰的单链DNA(40μM)的基片浸泡在不同浓度的汞离子水溶液中2小时。在测量拉曼光谱之前，基片经超纯水冲洗去除未特异性相互作用的汞离子，自然晾干。当汞离子的浓度变化，对应的主要拉曼峰比值发生相应改变，证明本发明体系对汞离子有良好的检测效果。在图4b中，汞离子的浓度在5×10^-3-5×10^-8M范围内，均有良好的检测效果，并且检测极限可达5×10^-8M。

步骤(4)检测体系的特异性考察

SERS基底对Hg²⁺检测的特异性验证：将修饰好DNA的SERS基底与汞离子和其它金属离子相互作用2小时。其中，Hg²⁺的浓度设定在1μM，其它金属离子的浓度设定在1mM。参见图5，从图5的结果可以看出，本体系对汞离子检测拥有良好的特异性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种基于DNA修饰的SERS基底检测低浓度汞离子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用分步法制备均匀的金包裹二氧化硅纳米颗粒，并利用偶联剂将核壳结构纳米颗粒固定在石英玻璃片上构建SERS基底；

(2)将单链DNA分子通过巯基修饰在金包裹二氧化硅纳米颗粒的金壳层的表面：适配体DNA的一端连接巯基，通过巯基共价修饰连接到纳米颗粒的金壳层表面，该单链DNA分子包括捕获片段和信号输入片段，该捕获片段包括T碱基，且可和汞离子特异性相互作用形成T-Hg²⁺-T的结构，该信号输入片段包括连续的G碱基和A碱基，G碱基和A碱基的SERS信号比值作为DNA在金属表面状态的光谱标准；

(3)把制备的DNA适配体修饰的SERS基底浸泡在含有汞离子的溶液中，再用去离子水清洗；

(4)基于DNA适配体修饰的SERS基底的拉曼光谱测量：利用G碱基和A碱基的SERS信号比值作为DNA在金属表面状态的光谱标准测量，通过分析特征拉曼峰及其比值变化实现对汞离子的定量特异性检测；

步骤(4)中，拉曼光谱测量时，用近红外激光激发待测样品，得到拉曼光谱后，用G碱基和A碱基的拉曼信号强度比值，即I(736cm^-1)/I(660cm^-1)定量分析汞离子浓度。

2.根据权利要求1所述的基于DNA修饰的SERS基底检测低浓度汞离子的方法，其特征在于：该单链DNA分子中包括依次排列的5-15个T碱基数、5-10个G碱基和5-10个A碱基。

3.根据权利要求2所述的基于DNA修饰的SERS基底检测低浓度汞离子的方法，其特征在于：该单链DNA为巯基修饰的含有依次排列的5-15个T碱基数、5-10个G碱基和5-10个A碱基的单链DNA。

4.根据权利要求1所述的基于DNA修饰的SERS基底检测低浓度汞离子的方法，其特征在于：将单链DNA分子通过巯基修饰在金包裹二氧化硅纳米颗粒的金壳层的表面，或者将单链DNA分子通过巯基修饰在纯金、纯银或者金银混合材料的金壳层表面。