CN111269715B - 一种比率荧光探针及其在可视化检测谷胱甘肽中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种比率荧光探针及其在可视化检测谷胱甘肽中的应用,其中比率荧光探针是基于蓝色碳点和橙色金纳米团簇双通道荧光信号构建的合体系。基于该比率探针结合铜离子构筑的荧光猝灭体系能用于荧光增强检测谷胱甘肽,其中比率探针的蓝色荧光信号充当内标保持稳定,猝灭的橙色荧光能被谷胱甘肽恢复,通过测定橙色与蓝色荧光强度比与谷胱甘肽浓度之间的线性关系,实现对谷胱甘肽的定量监测。本发明方法只需利用一个手持式的紫外灯就可实现对谷胱甘肽的可视化检测,具有反应快速、灵敏度高、选择性好、抗干扰性能力强,检测限低等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种比率荧光探针及其在可视化检测谷胱甘肽中的应用,是通过构筑比率荧光探针荧光增强型可视化检测,可用于人体血清中谷胱甘肽水平的定量监测。
背景技术
随着人类生活水平的提高,人们对健康的关注度也越来越大。许多重大疾病在早期往往无明显症状但伴随着一些生物分子水平的变化,因此急需一种生物小分子的定量监测的方法。谷胱甘肽作为人类生物系统中最丰富的非蛋白质硫醇化合物,其在基因表达和信号传递等多种细胞功能起着关键作用。谷胱甘肽的异常与多种人类疾病有关,例如阿尔茨海默氏症,癌症,衰老,艾滋病和帕金森氏病。谷胱甘肽异常水平从某种程度上可以表明身体健康状况,因此,定量检测人体血清中谷胱甘肽的含量可以实现实时监测人体健康具有十分重要的意义。
常见的仪器检测方法包括气相色谱法、高效液相色谱法、质谱法等在某种程度上都能用来实现定量检测,但这些方法存在一定弊端,仪器较笨重,样品前处理过程较繁琐且耗时长,选择性和灵敏度不够好,不利于快速、实时的监测,因而需发展一种高效、便利、快速的检测手段来实现对谷胱甘肽的检测。
荧光分析法是近些年来兴起的检测方法,由于荧光纳米材料良好的发光性能以及极好的选择性和灵敏性得到了广泛关注。相比于单色荧光探针,比率荧光探针通过引入内标物质,建立两种荧光信号的强度比与待测物浓度之间的关系可实现定量检测,解决了单一荧光强度受环境因素影响的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种比率荧光探针及其在可视化检测谷胱甘肽中的应用。本发明比率荧光探针用于谷胱甘肽检测时具有灵敏度高、选择性好、反应快速等特点。
本发明比率荧光探针,是由蓝色碳点和橙色金纳米团簇双通道荧光信号构建的混合体系。
进一步地,所述比率荧光探针中,蓝色碳点与橙色金纳米团簇按照荧光强度比为1:1的比例混合。
所述金纳米团簇是谷胱甘肽修饰的金纳米团簇。
本发明比率荧光探针的制备方法,包括如下步骤:
步骤1:蓝色碳点的制备
将1.725g L-脯氨酸溶于20mL超纯水中,溶解完全后转移到体积为50mL的聚四氟乙烯反应釜中,200℃下反应6h;反应结束后冷却至室温,得到的碳点溶液用截留分子量为1000的透析袋透析48h,后于4℃下保存;
步骤2:橙色发光金纳米团簇的制备
开始制备之前,将实验中要用到的所有玻璃仪器和磁力搅拌子先用王水浸泡30-120分钟,随后用超纯水清洗多次至洁净备用。向圆底烧瓶中加入3-6mL的10mM新鲜制备的谷胱甘肽溶液,0.2-0.4mL的100mM氯金酸溶液,6.8-13.6mL超纯水,在25℃下剧烈搅拌5分钟,然后升温到70℃下缓慢搅拌反应24小时,直至溶液变成浅黄色,于4℃下保存备用;
步骤3:比率荧光探针的构建
将步骤1获得的将蓝色碳点溶液溶于pH为7.4的10mM PBS缓冲液中,然后加入步骤2获得的橙色谷胱甘肽修饰的金纳米团簇溶液,使之混合均匀,得到比率荧光探针。
本发明比率荧光探针是由蓝色荧光信号与橙色荧光信号强度比为1:1制备的,在单一激发波长300nm激发下,发射出412nm的蓝色荧光及602nm的橙色荧光,通过构建两者荧光强度比与谷胱甘肽浓度之间的关系可实现定量可视化检测。
本发明比率荧光探针的应用,是作为检测试剂用于对谷胱甘肽的可视化定性检测。具体包括如下步骤:
首先向本发明比率荧光探针中加入铜离子溶液,利用铜离子与金纳米团簇之间的聚集诱导作用猝灭橙色荧光,蓝色荧光保持稳定;然后向体系中加入待测溶液,猝灭的橙色荧光被加入的待测溶液中含有的谷胱甘肽部分恢复,在365nm紫外灯照射下即可实现对谷胱甘肽的可视化检测。
本发明比率荧光探针的应用,是作为检测试剂用于对谷胱甘肽的定量检测。具体包括如下步骤:
步骤1:首先向本发明比率荧光探针中加入铜离子溶液,利用铜离子与金纳米团簇之间的聚集诱导作用猝灭橙色荧光,蓝色荧光保持稳定;然后向体系中逐步梯度加入谷胱甘肽溶液,猝灭的橙色荧光被加入的谷胱甘肽逐步恢复,通过测定的橙色与蓝色荧光强度的比值与加入的谷胱甘肽浓度建立标准曲线;
步骤2:向本发明比率荧光探针中加入铜离子溶液,利用铜离子与金纳米团簇之间的聚集诱导作用猝灭橙色荧光,蓝色荧光保持稳定;然后向体系中加入待测溶液,并测定获得其橙色与蓝色荧光强度的比值,通过步骤1获得的标准曲线可以获得谷胱甘肽的浓度值,从而实现对谷胱甘肽的定量检测。
所述铜离子溶液为Cu(NO3)2溶液。
所述谷胱甘肽溶液为新鲜制备的还原型谷胱甘肽溶液。
本发明比率荧光探针是利用橙色荧光先被铜离子猝灭然后基于荧光打开来检测谷胱甘肽。本发明中,不断加大谷胱甘肽的浓度,橙色金团簇的荧光逐渐恢复,在365nm紫外灯下呈现一系列不同荧光颜色的变化,从而可实现对谷胱甘肽的可视化检测。
本发明中利用碳点和金纳米团簇混合体系构筑的比率荧光探针检测谷胱甘肽的原理是先利用铜离子与金纳米团簇之间的聚集诱导作用猝灭橙色荧光,蓝色荧光保持稳定,不断加入谷胱甘肽后,由于铜离子与谷胱甘肽巯基强烈的螯和作用导致铜离子从团簇表面剥离,从而橙色荧光恢复,基于这种荧光关闭-打开方法,通过建立橙色荧光信号与蓝色荧光信号的强度和谷胱甘肽浓度之间的关系可实现谷胱甘肽的定量检测。
本发明的有益效果体现在:
1、本发明实现了比率荧光检测谷胱甘肽,扩大了荧光颜色变化的范围,相比于其他单色荧光检测显示出了可视化的特点,有效解决了单色荧光强度的不稳定的问题。
2、本发明可实现方便、快速、定量检测谷胱甘肽,在一定程度上可避免使用大型仪器,只需要一个便携式紫外灯就可完成可视化检测。
3、本发明制备的比率探针体系具有良好的稳定性,且对谷胱甘肽具有优异的灵敏度(检测下限为0.19μM)、选择性和抗干扰性,能够有效地避免其他杂质的干扰,响应快速。
附图说明
图1为蓝色碳点(a)、比率荧光探针(b)橙色金团簇(c)的荧光发射图。
图2为加入不同浓度铜离子的荧光谱图,插图为在365nm紫外灯下荧光照片。
图3是向比率探针和铜离子混合溶液中不断加入谷胱甘肽的荧光光谱图,插图为365nm紫外灯下荧光照片。
图4是比率荧光探针中蓝色碳点与橙色金团簇荧光强度比与谷胱甘肽浓度之间的线性关系图。
图5比率荧光探针的选择性图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例来对本发明的技术方案作进一步说明:
实施例1:
1、蓝色碳点的制备
将1.725g L-脯氨酸溶于20mL超纯水,溶解完全后转移到体积为50mL的聚四氟乙烯反应釜中,200℃下反应6h,冷却至室温后,得到的碳点溶液用截留分子量为1000的透析袋透析48h,后保存在4℃冰箱。
2、橙色发光金团簇的制备
开始制备之前,将实验中要用到的所有玻璃仪器和磁力搅拌子先用王水浸泡30-120分钟,后用超纯水清洗多次至洁净备用,向圆底烧瓶中加入3mL的10mM新鲜制备的谷胱甘肽溶液,0.2mL的100mM氯金酸溶液,6.8mL超纯水,在25℃下剧烈搅拌5分钟,然后升温到70℃下缓慢搅拌反应24小时直至溶液变成浅黄色,最终保存在4℃冰箱备用。
3、比率荧光探针的构筑
将25μL蓝色碳点溶液溶于pH为7.4的10mM PBS缓冲液中,然后加入50μL橙色谷胱甘肽修饰的金团簇溶液使总体积保持2mL,使之混合均匀,得到比率探针。
4、铜离子猝灭比率荧光探针的橙色荧光
向步骤3中制备的比率荧光探针溶液中不断加入10-3M的Cu(NO3)2母液,最终4μMCu(NO3)2能将橙色荧光几乎猝灭完全,探针整体呈现由橙色到蓝色的变化。
5、可视化检测水中的谷胱甘肽
向步骤4中得到的比率探针和Cu(NO3)2的混合体系中依次加入0,2,5,10,15,20,25,30,35,40,45和50μM谷胱甘肽,5分钟后,在365nm手持式紫外灯照射下,通过裸眼可以清晰地看到,随着谷胱甘肽浓度的增加,混合溶液颜色呈现由蓝色到紫色再到橙色的可视化转变,实现了可视化监测谷胱甘肽。
实施例2:
1、蓝色碳点的制备
本步骤的实施过程同实施例1。
2、橙色发光金团簇的制备
本步骤的实施过程同实施例1。
3、比率荧光探针的构筑
本步骤的实施过程同实施例1。
4、铜离子猝灭比率荧光探针的橙色荧光
本步骤的实施过程同实施例1。
5、比率荧光探针定量检测水中的谷胱甘肽向制备好的比率探针和Cu(NO3)2的混合体系中依次加入0,2,5,10,15,20,25,30,35,40,45和50μM谷胱甘肽,5分钟后,利用荧光光谱仪监测412nm处蓝色信号和602nm橙色信号的荧光强度,通过建立两者荧光强度比(I602/I412)与谷胱甘肽浓度的关系可实现定量检测谷胱甘肽。
6、标准曲线的绘制
当激发波长为300nm条件下,记录混合体系在350~750nm波长范围内的荧光光谱,如图3所示。图4是了比率荧光探针荧光强度比(I602/I412)与谷胱甘肽浓度(0-50μM)之间的关系图,其中横坐标为谷胱甘肽的浓度,纵坐标为比率探针602nm和412nm处的荧光强度比值。
实施例3:
1、蓝色碳点的制备
本步骤的实施过程同实施例1。
2、橙色发光金团簇的制备
本步骤的实施过程同实施例1。
3、比率荧光探针的构筑
本步骤的实施过程同实施例1。
4、铜离子猝灭比率荧光探针的橙色荧光
本步骤的实施过程同实施例1。
5、比率荧光探针定量检测水中的谷胱甘肽
本步骤实施过程同实施例2。
6、比率探针的选择性测试
如图5所示,向比率探针和Cu(NO3)2的混合体系中不加任何干扰介质,以及分别加入浓度为100μM无机离子(Na+,K+,Ca2+,Fe2+),葡萄糖,果糖,氨基酸(Glu,Arg,Leu,Val,Ala,Thr),BSA,AA,CSSG和50μMCys。结果显示只有Cys有轻微影响,其他物质对该探针荧光强度无影响,表明该探针对谷胱甘肽具有较好的选择性。
Claims (2)
1.一种比率荧光探针的应用,其特征在于:
所述比率荧光探针作为检测试剂用于对谷胱甘肽的可视化定性检测,包括如下步骤:
首先向比率荧光探针中加入铜离子溶液,利用铜离子与金纳米团簇之间的聚集诱导作用猝灭橙色荧光,蓝色荧光保持稳定;然后向体系中加入待测溶液,猝灭的橙色荧光被加入的待测溶液中含有的谷胱甘肽部分恢复,在365 nm紫外灯照射下即可实现对谷胱甘肽的可视化检测;
所述比率荧光探针是由蓝色碳点和橙色金纳米团簇双通道荧光信号构建的混合体系;
所述比率荧光探针中,蓝色碳点与橙色金纳米团簇按照荧光强度比为1:1的比例混合;
所述金纳米团簇是谷胱甘肽修饰的金纳米团簇。
2.一种比率荧光探针的应用,其特征在于:
所述比率荧光探针作为检测试剂用于对谷胱甘肽的定量检测,包括如下步骤:
步骤1:首先向比率荧光探针中加入铜离子溶液,利用铜离子与金纳米团簇之间的聚集诱导作用猝灭橙色荧光,蓝色荧光保持稳定;然后向体系中逐步梯度加入谷胱甘肽溶液,猝灭的橙色荧光被加入的谷胱甘肽逐步恢复,通过测定的橙色与蓝色荧光强度的比值与加入的谷胱甘肽浓度建立标准曲线;
步骤2:向比率荧光探针中加入铜离子溶液,利用铜离子与金纳米团簇之间的聚集诱导作用猝灭橙色荧光,蓝色荧光保持稳定;然后向体系中加入待测溶液,并测定获得其橙色与蓝色荧光强度的比值,通过步骤1获得的标准曲线获得谷胱甘肽的浓度值,从而实现对谷胱甘肽的定量检测;
所述比率荧光探针是由蓝色碳点和橙色金纳米团簇双通道荧光信号构建的混合体系;
所述比率荧光探针中,蓝色碳点与橙色金纳米团簇按照荧光强度比为1:1的比例混合;
所述金纳米团簇是谷胱甘肽修饰的金纳米团簇。
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Dual-emissive nanohybrid of carbon dots and gold nanoclusters for sensitive determination of mercuric ions;Yehan Yan等;《Nano Research》;20160514;第9卷(第7期);第2088-2096页 * |
Selective detection of glutathione based on the recovered fluorescence of BSA-AuNCs/Cu2+ system;Yining Zhu等;《Micro & Nano Letters》;20190814;第14卷(第9期);第952-956页 * |
Yanying Wang等.A ratiometric fluorometric and colorimetric probe for the β-thalassemia drug deferiprone based on the use of gold nanoclusters and carbon dots.《Microchimica Acta》.2018,第185卷(第442期),第1-9页. * |
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CN111269715A (zh) | 2020-06-12 |
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