CN112816414B - 基于双发射镧系mof的碱性磷酸酶检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于双发射镧系MOF的碱性磷酸酶检测试剂盒及检测方法。包括酶解反应底物、酶激活剂和双发射镧系MOF,所述双发射镧系MOF与所述酶解反应底物以及酶激活剂分开存放,所述双发射镧系MOF的配体和镧系离子分别具有特征蓝色荧光和特征绿色荧光。本发明方法可以实现碱性磷酸酶的高灵敏检测,检测限低至0.002mU/mL,不仅灵敏度高,还具有较强的抗干扰能力。本发明所需材料、试剂简单易得,检测过程简单,为临床样本中碱性磷酸酶的活性检测提供了一种高灵敏度、高准确度、高便携性的新方法。
Description
技术领域
本发明属于分析化学及临床检验领域,具体涉及一种基于双发射镧系MOF的碱性磷酸酶试剂盒及检测方法。
背景技术
碱性磷酸酶(ALP)在细胞生长、凋亡、信号传导过程中起重要作用,它被广泛用作癌症(骨细胞癌、前列腺癌)等疾病临床诊断的生物标志物,因此,建立高灵敏度、高准确度、高便携的碱性磷酸酶活性分析方法非常必要。
目前已经建立了多种检测碱性磷酸酶活性的方法,包括同位素标记法、比色法、电化学法、荧光法和表面增强拉曼光谱法等。其中,荧光法具有简单、灵敏度高、响应速度快、仪器要求低等优点,非常适合于便携、实时检测。目前的碱性磷酸酶荧光检测方法,大多数需要通过繁琐的有机合成来制备合适的底物分子,纯化成本高且耗时,基于半导体量子点的方法受限于其毒性较大,而基于贵金属纳米粒的方法又因昂贵且稳定性差而不宜普及。因此,开发新型荧光探针用于碱性磷酸酶活性分析具有重要价值。
镧系金属有机骨架材料(metal-organic framework,MOF)是一类新兴的多孔、晶态材料,其具有合成简单、结构多样可调、可精确设计、发光单色性好、可构建多发光中心等优点,有望将其开发成高灵敏、高准确酶活性荧光传感器。目前,还没有将镧系MOF应用于碱性磷酸酶活性检测的报道,因此,基于镧系MOF开发基于全新机理的酶活性检测方法,具有重要意义。此外,现有荧光检测法很难实现高灵敏裸眼可视化检测(荧光发射峰单一、光谱宽而单色性差),而基于理论设计筛选合适的有机配体,构建出双发射镧系MOF,则可以很好的解决该问题,有效实现荧光颜色随碱性磷酸酶活性而显著变化,实现裸眼可视化检测,推动更加便携、高灵敏的碱性磷酸酶活性检测方法走向临床应用。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种基于镧系MOF的碱性磷酸酶试剂盒及应用,该试剂盒操作简单、样本需求小(仅25μL)、灵敏度高,荧光颜色变化大而易于实现裸眼可视化检测。
本发明提供的试剂盒的检测原理:所采用的双发射镧系MOF对于磷酸根离子具有高选择性响应性,磷酸根可引起双发射镧系MOF的双发射峰反向变化(绿色荧光峰淬灭,蓝色荧光峰增强),这保证了高准确度、高灵敏度和裸眼可视化。以廉价易得的磷酸酯钠为底物,碱性磷酸酶催化底物产生磷酸根,磷酸根和双发射镧系MOF发生强相互作用:一方面和镧系离子发生配位作用,阻碍了有机配体向镧系离子的能量转移途径;另一方面与有机配体发生阴离子-Π相互作用,促进有机配体分子内电荷转移,削弱了配体分子向镧系离子的能量转移强度。以上两方面作用导致镧系MOF中镧系离子主导的绿色荧光发射淬灭,而有机配体主导的蓝色荧光发射增强,最终呈现出荧光颜色由绿色向蓝色变化的现象,在一定的特征峰强度下可有效实现裸眼可视化检测。
本发明提供的方案如下:
一种基于双发射镧系MOF的碱性磷酸酶检测试剂盒,包括酶解反应底物、酶激活剂和双发射镧系MOF,所述双发射镧系MOF与所述酶解反应底物以及酶激活剂分开存放,所述双发射镧系MOF的配体和镧系离子分别具有特征蓝色荧光和特征绿色荧光。
优选地,所述双发射镧系MOF的配体和镧系离子的蓝色荧光的峰强度以及绿色荧光的峰强度比值为(10:1)~(1:10),更加优选为(5:1)~(1:5)。
优选地,所述酶解反应底物为可被碱性磷酸酶水解的磷酸酯钠,更加优选廉价易得的维生素C磷酸酯钠(AAP),所述酶激活剂为二价镁离子盐。
优选地,所述酶解反应底物、酶激活剂、双发射镧系MOF的用量比为(50-800)nmol:(50-300)nmol:(50-300)mg。
优选地,所述双发射镧系MOF的有机配体为芳香有机配体。
优选地,所述双发射镧系MOF的有机配体包括均苯四甲酸(Pyromellitic acid,PTC)、3,3',5,5'-联苯四甲酸(Biphenyl-3,3',5,5'-tetracarboxylic acid,BPTC)和[1,1′:4′,1″]三联苯-3,3″,5,5″-四甲酸([1,1′:4′,1″]Terphenyl-3,3″,5,5″-tetracarboxylic acid,TPTC);所述镧系离子包括三价铕盐和铽盐。
优选地,所述双发射镧系MOF制备方法为,将有机配体溶解于有机溶剂中,将镧系离子金属盐溶解于一级水中,首先将少量镧系离子金属盐溶液加入到有机配体溶液中,超声促进成核过程,接着,将剩余镧系离子金属盐溶液合并入有机配体溶液,转移到高压反应釜,油浴加热后冷却到室温,洗涤干燥即得。
优选地,所述试剂盒包括离心管和独立的分装盒,所述酶解反应底物以及酶激活剂置于所述离心管底部,所述双发射镧系MOF置于所述分装盒内。
优选地,所述离心管的上部可拆卸连接有超滤内管,所述超滤内管的一端通过毛细孔连通离心管内部,另一端固定有可取出的玻璃纤维试纸。
本发明的另一目的是提供上述基于双发射镧系MOF的碱性磷酸酶检测试剂盒在碱性磷酸酶活性分析领域的应用。
本发明的另一目的是提供一种基于镧系MOF的碱性磷酸酶检测方法,可采用上述的试剂盒,步骤如下:
(1)将酶解反应底物、酶激活剂以及Tris-甘氨酸缓冲液、待测血清混匀;
(2)将所得混合液置于恒温摇床中,在温度20-37℃条件下进行酶解反应;
(3)酶解反应完毕后,向混合液中加入双发射镧系MOF,再次混匀,所述双发射镧系MOF的配体和镧系离子分别具有特征蓝色荧光和特征绿色荧光;
(4)检测混合液的荧光信号,根据特征蓝色荧光和特征绿色荧光的变化分析得到待测血清中磷酸酶含量。
优选地,所述检测离心管内混合液荧光信号的方法包括:a,直接荧光光谱仪检测,优选采用将光谱数据转换为色度比值的方式进行数据分析;b,转染后在紫外光下利用RGB提取软件辅助进行肉眼可视化检测。
优选地,步骤(2)中待测血清的加入量低至0.25μL。
上述碱性磷酸酶试剂盒的检测机理:
借助试剂盒内酶解反应底物被碱性磷酸酶催化产生磷酸根离子,磷酸根离子通过强相互作用淬灭双发射镧系MOF中镧系离子的特征绿色荧光,同时增强配体的特征蓝色荧光。这样的双发射设计不仅具有更高的准确度(自校正),还具备更高灵敏度(双响应),不仅如此,由于镧系MOF中镧系离子特征荧光光谱狭窄、单色性好、色纯度高,且绿色、蓝色均为RGB三原色,双发射荧光混合显色后很容易实现裸眼可视化的最佳灵敏度。
本发明的有益效果:
(1)本发明提供的碱性磷酸酶试剂盒具有高灵敏碱性磷酸酶活性响应特性,且操作便携,检测限低至0.002mU/mL;
(2)基于本发明提供的碱性磷酸酶试剂盒,同时具有操作简单、响应快、高准确度、高灵敏度优势;最重要的是可实现高灵敏裸眼可视化检测(绿色到蓝色);
(3)本发明证明了相同检测条件下,基于色度比的分析方式相比于基于双波长比率荧光的方式优势显著;
(4)本方法具有良好的选择性,检测结果准确,受干扰物影响小,对磷酸酶具有优异的选择性;
(5)可应用于微量样本(仅需25μL)中碱性磷酸酶活性的高灵敏、高准确、裸眼可视化检测,适合用于临床样本中碱性磷酸酶活性检测以及相关的早期癌症诊断。
附图说明
图1是采用不同有机配体制备的镧系MOF材料的透射电镜图(a、b、c采用的有机配体分别为PTC、BPTC、TPTC);
图2是用于ALP检测的MOF的光谱图和色度图(a、b代表Tb-PTC,c、d代表Tb-BPTC,e、f代表Tb-TPTC);
图3是本发明一种基于双发射镧系MOF的裸眼可视化碱性磷酸酶检测方法的原理图;
图4是本发明一种基于双发射镧系MOF的裸眼可视化碱性磷酸酶检测试剂盒的结构示意图和检测流程图,其中图a的结构示意图,图中的附图标注1为离心管、2为超滤内管、3为毛细孔、4为塑料垫圈、5为玻璃纤维试纸;图b为检测流程图;
图5是实施例1以双波长比率荧光为纵坐标的Tb-BPTC对ALP活性的响应标准曲线;
图6是实施例1以光谱转换的色度比B/G为纵坐标的Tb-BPTC对ALP活性的响应标准曲线;
图7是Tb-BPTC对于ALP检测的选择性以及抗干扰能力,图中a为阴阳离子类干扰物,b为酶、氨基酸类干扰物。
具体实施方式
为更好的理解本发明,下面的实施例是对本发明的进一步说明,但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
双发射镧系MOF材料由芳香有机配体和镧系离子通过预成核-溶剂热法制备而得,以Tb-BPTC为例:将1mmol BPTC溶解于30mL N,N-二甲基甲酰胺中,将0.5mmol Tb(NO3)3溶解于5mL一级水中,首先将50μL Tb(NO3)3溶液加入到有机配体溶液中,超声10min,促进成核过程。接着,将剩余Tb(NO3)3溶液合并入有机配体溶液,转移到高压反应釜,在160℃条件下油浴加热3小时,然后自然冷却到室温,最后采用N,N-二甲基甲酰胺和无水乙醇各洗2次,在45℃条件下真空干燥即得Tb-BPTC。采用同样的方法制备得到Tb-PTC和Tb-TPTC。
实施例1
应用制备的Tb-BPTC检测人血清中的ALP活性(荧光光谱仪检测)
方法:取50μL血清,将4μL 50mM AAP和5μL 20mM MgSO4与之混合,再加上一定量的缓冲液(pH=9.5,10mM Tris-甘氨酸缓冲液)以使总体积达到0.5mL,将混合物置于恒温振荡器(1000rpm)中,并在37℃下反应60分钟。反应完成后,添加450μL水和50μL Tb-BPTC(2mgmL-1)。采用荧光光谱仪测量,将反应溶液混合10分钟并转移至比色皿中以监测荧光光谱。
在绘制标准曲线时,比较了基于色度比的分析方式和基于双波长比率荧光的分析方式:
直接以双波长比率荧光为纵坐标的Tb-BPTC对ALP活性的响应标准曲线如图5所示。
采用如下方式将光谱数据转换为色度比:
1)采用CIE1931软件,将光谱数据导入,获取每条光谱对应的色坐标X、Y、Z值;
2)采用以上X、Y、Z值,通过表1中公式进行转换,得到B/G比值。采用B/G比值为纵坐标,重新绘制标准曲线,如图6所示。
表1.荧光光谱数据对应的XYZ色坐标体系向RGB色彩体系的转换公式
可知,将光谱数据通过以下公式转换为色度比值后,线性明显更好,相关系数r从0.9411提升为0.9981,这更有利于获取准确的检测结果。
通过荧光光谱分析和色度分析相结合的方式对不同的MOF材料的灵敏度进行了测试,测试结果如附图2所示。可见Tb-BPTC的颜色变化是最明显,即灵敏度最高。
基于比率荧光分析方式,本实施例采用荧光光谱检测ALP活性的结果如表2所示。
表2.人血清中ALP活性测定及加标回收实验结果(荧光光谱仪测定,n=3)
实施例2
应用制备的Tb-BPTC,结合本发明提供的试剂盒(图4a)检测人血清中的ALP活性(可视化检测)
过程如下:将4μL 50mM AAP、5μL 20mM MgSO4、466μL缓冲液(pH=9.5,10mM Tris-甘氨酸缓冲液)和25μL血清在离心管中混合,将其置于恒温摇床(1000rpm)中,并在37℃下反应60分钟。反应完成后,加入250μL水和250μL Tb-BPTC溶液(2mg mL-1)。所得反应液可以通过毛细孔快速渗滤、将超滤内管中的玻璃纤维试纸转染,然后在10分钟后用镊子取出玻璃纤维试纸并转移到紫外灯下,在紫外灯下可以实现高灵敏裸眼识别检测(随着碱性磷酸酶活性从0-8mU mL,颜色由绿色变成蓝色)。在254nm紫外光激发下,可以通过智能手机软件World of Color进行RGB色度分析,从而实现对ALP活性的可视化定量。检测过程参考附图4b,可视化检测结果见表3。
表3.人血清中ALP活性测定及加标回收实验结果(可视化测定,n=3)
实施例3
采用荧光光谱仪检测法和双波长比率荧光的分析方式,测试了Tb-BPTC对ALP活性测定的选择性和抗干扰能力。具体测试参数为AAP 200μM,Mg2+浓度100μM,ALP 0mU mL-1或10mU mL-1,pH=9.5,10mM Tris-甘氨酸缓冲液,在37摄氏度下反应60分钟,Tb-BPTC浓度100μg mL-1。阴离子和阳离子的干扰物质浓度为100μM。氨基酸和葡萄糖干扰物质的浓度为100μM。BSA干扰物质的浓度为2μg mL-1。干扰酶的活性为100mU mL-1。测试结果如图7所示。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明保护的范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所做的任何修改,等同替换和改进等,均应包含在发明的保护范围之内。
以上所述是本发明的优选实施方式而已,当然不能以此来限定本发明之权利范围,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和变动,这些改进和变动也视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种基于双发射镧系MOF的碱性磷酸酶检测试剂盒,其特征在于,包括酶解反应底物、酶激活剂和双发射镧系MOF,所述双发射镧系MOF与所述酶解反应底物以及酶激活剂分开存放,所述双发射镧系MOF的配体和镧系离子分别具有特征蓝色荧光和特征绿色荧光;所述酶解反应底物为可被碱性磷酸酶水解的磷酸酯钠,所述酶激活剂为二价镁离子盐;所述双发射镧系MOF的有机配体为3,3',5,5'-联苯四甲酸,所述镧系离子为 铽盐。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述双发射镧系MOF的配体和镧系离子的蓝色荧光的峰强度以及绿色荧光的峰强度比值为(10:1)~(1:10)。
3.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述酶解反应底物、酶激活剂、双发射镧系MOF的用量比为(50-800)nmol:(50-300)nmol:(50-300)mg。
4.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括离心管和独立的分装盒,所述酶解反应底物以及酶激活剂置于所述离心管底部,所述双发射镧系MOF置于所述分装盒内。
5.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述离心管的上部可拆卸连接有超滤内管,所述超滤内管的一端通过毛细孔连通离心管内部,另一端固定有可取出的玻璃纤维试纸。
6.如权利要求1~5任一项所述基于双发射镧系MOF的碱性磷酸酶检测试剂盒在碱性磷酸酶活性分析领域的应用。
7.一种基于镧系MOF的碱性磷酸酶检测方法,其特征在于,步骤如下:
(1)将酶解反应底物、酶激活剂以及Tris-甘氨酸缓冲液、待测血清混匀;
(2)将所得混合液置于恒温摇床中,在温度20-37℃条件下进行酶解反应;
(3)酶解反应完毕后,向混合液中加入双发射镧系MOF,再次混匀,所述双发射镧系MOF的配体和镧系离子分别具有特征蓝色荧光和特征绿色荧光;所述酶解反应底物为可被碱性磷酸酶水解的磷酸酯钠,所述酶激活剂为二价镁离子盐;所述双发射镧系MOF的有机配体为3,3',5,5'-联苯四甲酸,所述镧系离子为 铽盐;
(4)检测混合液的荧光信号,根据特征蓝色荧光和特征绿色荧光的变化分析得到待测血清中磷酸酶含量。
8.如权利要求7所述的检测方法,其特征在于,所述检测混合液荧光信号的方法包括:a,直接荧光光谱仪检测;b,转染后在紫外光下利用RGB提取软件辅助进行肉眼可视化检测。
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