CN114295569A - 半花菁分子光学探针在检测亚硫酸氢根的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了结构如式I所示的半花菁分子光学探针在检测亚硫酸氢根的应用，基于比色法、比率计法、近红外激发和发射的下转换荧光传感法或近红外激发和发射的频率上转换发光传感法，采用半花菁分子光学探针测定待测样品液中亚硫酸氢根的浓度；检测体系由有机相和水相组成，有机相为四氢呋喃；检测体系中有机相占比为0.1～10v/v％，半花菁分子光学探针的浓度为0.5～15.0μM；检测体系的pH＝2.0～7.0。本发明兼具了各种传感模式的优势，准确、灵敏、选择性好，还有效避免环境及仪器变化的波动，可实现复杂基质情况下的检测。本发明还公开了半花菁分子光学探针在制备用于检测癌细胞中亚硫酸氢根的试剂盒的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种半花菁分子光学探针在检测亚硫酸氢根的应用。
背景技术
二氧化硫(SO2)是一种具有刺激性气味的无色气体。溶于水后，以亚硫酸根(SO3 2-)和亚硫酸氢根(HSO3 -)的形式存在。在生物系统中，亚硫酸根和亚硫酸氢根可以由氨基酸、H2S等含硫物质内源性产生。大量研究证实，二氧化硫及其衍生物在生物体的正常生命活动中起着至关重要的作用。一旦二氧化硫及其衍生物在体内的平衡被打破，就会出现呼吸系统疾病、神经系统疾病等一系列可能的疾病。此外，对于各种食品、药品和饮料，二氧化硫及其衍生物还是必不可少的防腐剂和漂白剂。但是，过量的摄入会导致人体出现过敏反应甚至组织损伤。世界卫生组织(WHO)和联合国粮食及农业组织(FAO)建议，人体中亚硫酸氢根的水平应低于0.7mg kg-1。
SO2及其衍生物常用的检测方法包括电化学分析法、色谱分析法、光谱分析法(如比色法、荧光法等)，其中，荧光法受到广泛关注。荧光法常用比率荧光探针、近红外荧光探针。比率荧光探针通过测量两个不同通道的荧光强度，可以避免环境和仪器波动引起的干扰。此外，近红外荧光探针由于具有光损伤小、组织穿透能力强、能有效避免生物分子自发荧光干扰优点，也被广泛的应用于体内检测与成像。这两种传感方法均被应用于亚硫酸氢根的检测。
上述两种传感方式各有优势，但也存在不可否认的缺陷。比率荧光探针激发、发射多位于紫外-可见光区，易受到组织吸收、自发荧光的干扰，且组织穿透能力弱，无法满足在生物体内及其他一些复杂条件下的检测要求。而近红外荧光探针易受环境和仪器波动引起的干扰，导致准确度不足。因此，仅仅采用上述某一种传感方式无法避免其固有缺点，满足对亚硫酸氢根的体内或其他复杂条件下的传感和检测要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以以四种模式进行亚硫酸氢根检测的自校正半花菁分子光学探针，以克服单模式探针固有的缺陷，对亚硫酸氢根实现集多种优势于一身的检测。该半花菁分子光学探针可用于葡萄酒亚硫酸氢根的检测。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
结构如式I所示的半花菁分子光学探针在检测亚硫酸氢根的应用，
优选的，所述的应用为：基于比色法、比率计法、近红外激发和发射的下转换荧光传感法或近红外激发和发射的频率上转换发光传感法的至少一种方法，采用结构如式I所示的半花菁分子光学探针，测定待测样品液中亚硫酸氢根的浓度；其中，检测体系由有机相和水相组成，所述的有机相为四氢呋喃；检测体系中，有机相占比为0.1～10v/v％，优选为1～5v/v％，半花菁分子光学探针的浓度为0.5～15.0μM；检测体系的pH＝2.0～7.0，优选为pH＝4.0。
本发明所述的水相为纯化水和缓冲液的混合溶液或缓冲液或盐酸。
所述缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液、柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液。
具体的，所述的水相为纯化水和选自pH＝2.0～7.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、伯瑞坦-罗宾森缓冲液、柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液中的一种照体积比0.01:1～0.5:1的混合溶液，在该体积比内，检测体系的pH与缓冲液的pH保持一致。
半花菁分子光学探针具有显著的近红外吸收信号，当其与HSO3 -作用后，探针分子在近红外区域最大吸收波长处的吸收强度显著下降。作为本发明所述的半花菁分子光学探针在检测亚硫酸氢根的应用的其中一个技术方案，技术方案如下：
一种采用比色法检测亚硫酸氢根的方法，包括：
步骤(a)、半花菁分子光学探针溶于有机相中配制成探针储备液；将探针储备液和水相混合，涡旋混匀，加入不同浓度的NaHSO3水溶液，以加入等体积纯化水为空白对照，涡旋混匀得到检测体系，水浴孵育，测定紫外-可见吸收谱图；
步骤(b)、以检测体系中亚硫酸氢根的浓度为横坐标，空白对照(不加亚硫酸氢根时检测体系)711±10nm处吸光度减去加入亚硫酸氢根时检测体系711±10nm处吸光度的差值(ΔAbs)为纵坐标，建立标准曲线；
步骤(c)、按照步骤(a)测定含亚硫酸氢根的待测样品液的紫外-可见吸收谱图，得到711±10nm处的吸光度，将其代入标准曲线，计算得到待测样品液中亚硫酸氢根的浓度。
所述的检测体系中，有机相占比为0.1～10v/v％，基于检测的灵敏度和线性范围，优选为1～5v/v％，最优选为5v/v％，半花菁分子光学探针的浓度为0.5～15.0μM；检测体系的pH＝2.0～7.0，优选为pH＝4.0。
用于建立标准曲线的检测体系中NaHSO3的浓度为1.0～15.0μM。
所述的水浴孵育的温度为15～35℃，时间为0.5～3h。
半花菁分子光学探针具有显著的近红外发射信号，当其与HSO3 -作用后，探针在近红外区域最大发射波长处的发射强度显著下降，在可见光区域有新的荧光信号发射峰，发射强度显著增强，上述两发射峰的比值变化显著。作为本发明所述的半花菁分子光学探针在检测亚硫酸氢根的应用的其中一个技术方案，技术方案如下：
一种采用比率计法检测亚硫酸氢根的方法，包括：
步骤(a)、半花菁分子光学探针溶于有机相中配制成探针储备液；将探针储备液和水相混合，涡旋混匀，加入不同浓度的NaHSO3水溶液，以加入等体积纯化水为空白对照，涡旋混匀得到检测体系，水浴孵育，以450±10nm为激发波长，分别测得747±10nm处的荧光强度I2、599±10nm处的荧光强度I1，得到I1/I2；
步骤(b)、以检测体系中亚硫酸氢根浓度为横坐标、I1/I2为纵坐标建立标准曲线；
步骤(c)、按照步骤(a)测定含亚硫酸氢根的待测样品液的I1/I2，将其代入标准曲线计算得到待测样品液中亚硫酸氢根的浓度。
所述的检测体系中，有机相占比为0.1～10v/v％，基于检测的灵敏度和线性范围，优选为1～5v/v％，最优选为1v/v％，半花菁分子光学探针的浓度为0.5～15.0μM；检测体系的pH＝2.0～7.0，优选为pH＝4.0。
所述的水浴孵育的温度为15～35℃，时间为0.5～3h。
用于建立标准曲线的检测体系中NaHSO3浓度为0.1～10.0μM。
半花菁分子光学探针具有显著的近红外发射信号，当其与HSO3 -作用后，探针分子在近红外区域最大发射波长处的发射强度显著下降。作为本发明所述的半花菁分子光学探针在检测亚硫酸氢根的应用的其中一个优选技术方案，技术方案如下：
一种采用近红外激发和发射的下转换荧光传感法检测亚硫酸氢根的方法，包括：
步骤(a)、半花菁分子光学探针溶于有机相中配制成探针储备液；将探针储备液和水相混合，涡旋混匀，加入不同浓度的NaHSO3水溶液，以加入等体积纯化水为空白对照，涡旋混匀得到检测体系，水浴孵育，以550～720nm为激发波长，分别测得含NaHSO3的检测体系、空白对照743±10nm处的荧光强度I、I0，计算荧光强度的猝灭率(I0-I)/I0；
步骤(b)、以检测体系中亚硫酸氢根浓度为横坐标、743±10nm处荧光强度的猝灭率(I0-I)/I0为纵坐标建立标准曲线；
步骤(c)、按照步骤(a)测定含亚硫酸氢根的待测样品液的743±10nm处荧光强度的猝灭率，将其代入标准曲线计算得到待测样品液中亚硫酸氢根的浓度。
所述的检测体系中，有机相占比为0.1～10v/v％，基于检测的灵敏度和线性范围，优选为1v～5v/v％，最优选为3v/v％，半花菁分子光学探针的浓度为0.5～15.0μM；检测体系的pH＝2.0～7.0，优选为pH＝4.0。
所述的水浴孵育的温度为15～35℃，时间为0.5～3h。
用于建立标准曲线的检测体系中NaHSO3的浓度为0.1～5.0μM。
优选的，所述的激发波长为700nm。
半花菁分子光学探针具有显著的近红外发射信号，当其与HSO3 -作用后，探针分子在近红外区域最大发射波长处的发射强度显著下降。作为本发明所述的半花菁分子光学探针在检测亚硫酸氢根的应用的其中一个优选技术方案，技术方案如下：
一种采用近红外激发和发射的频率上转换发光传感法检测亚硫酸氢根的方法，包括：
步骤(a)、半花菁分子光学探针溶于有机相中配制成探针储备液；将探针储备液和水相混合，涡旋混匀，加入不同浓度的NaHSO3水溶液，以加入等体积纯化水为空白对照，涡旋混匀得到检测体系，水浴孵育，以808nm为激发波长，分别测得含NaHSO3的检测体系、空白对照754±10nm处的频率上转换发射强度I、I0，计算频率上转换发射强度的猝灭率(I0-I)/I0；
步骤(b)、以检测体系中亚硫酸氢根浓度为横坐标、754±10nm处频率上转换发光强度的猝灭率((I0-I)/I0)为纵坐标，建立标准曲线；
步骤(c)、按照步骤(a)测定含亚硫酸氢根的待测样品液在754±10nm处的频率上转换发射强度的猝灭率，将其代入标准曲线计算得到待测样品液中亚硫酸氢根的浓度。
所述的检测体系中，有机相占比为0.1～10v/v％，基于检测的灵敏度和线性范围，优选为1～5v/v％，最优选为2v/v％，半花菁分子光学探针的浓度为0.5～15.0μM；检测体系的pH＝2.0～7.0，优选为pH＝4.0。
所述的水浴孵育的温度为15～35℃，时间为0.5～3h。
用于建立标准曲线的检测体系中NaHSO3的浓度为0.5～35.0μM。
本发明所述的含亚硫酸氢根的待测样品液可以为葡萄酒。
本发明的另一个目的是提供结构如式I所示的半花菁分子光学探针在检测葡萄酒中亚硫酸氢根的方法，基于前述比色法、比率计法、近红外激发和发射的下转换荧光传感法或近红外激发和发射的频率上转换发光传感法测得葡萄酒中亚硫酸氢根的含量。
包括：参照前述的比色法、比率计法、近红外激发和发射的下转换荧光传感法或近红外激发和发射的频率上转换发光传感法分别建立相应的标准曲线；待测葡萄酒经纯化水稀释，将探针储备液与水相混合，再加入稀释后的葡萄酒，涡旋混匀得到检测体系，水浴孵育，按照比色法、比率计法、近红外激发和发射的下转换荧光传感法或近红外激发和发射的频率上转换发光传感法分别测得711±10nm处的吸光度、599±10nm处的荧光强度I1和747±10nm处的荧光强度I2的比值I1/I2、743±10nm处荧光强度的猝灭率、754±10nm处频率上转换发射强度的猝灭率，代入对应的线性方程，计算得到葡萄酒亚硫酸氢根的含量。
所述的葡萄酒为被7-羟基香豆素污染或未被污染的葡萄酒。
所述的葡萄酒经纯化水稀释30～150倍。
本发明的另一个目的是提供结构如式I所示的半花菁分子光学探针在制备用于检测癌细胞中亚硫酸氢根的试剂盒的应用。
本发明的有益效果：
本发明基于半花菁分子光学探针，采用比色法、比率计法、近红外激发和发射的下转换荧光传感法或近红外激发和发射的频率上转换发光传感法对亚硫酸氢根进行传感，不仅兼具了各种传感模式的优势，准确、灵敏、选择性好，还可以有效避免环境及仪器变化的波动，可实现复杂基质情况下的检测，可用于葡萄酒亚硫酸氢根的检测。
半花菁分子光学探针分子尺寸小，易被生物样品吞噬且具有大的组织穿透深度和生物体内快速排泄能力，适用于生物体内监测与传感，可基于癌细胞中亚硫酸氢根的荧光成像检测癌细胞中亚硫酸氢根。
附图说明
图1为为半花菁分子光学探针NHR(3.0μM)在不同浓度(0.0～25.0μM)NaHSO3存在时的紫外-可见吸收谱图。
图2为分子光学探针NHR(3.0μM)对不同浓度(0.0～25.0μM)NaHSO3的响应曲线。
图3为半花菁分子光学探针NHR(5.0μM)在不同浓度(0.0～15.0μM)NaHSO3存在时的荧光谱图。
图4为分子光学探针NHR(5.0μM)对不同浓度(0.0～15.0μM)NaHSO3的荧光响应曲线。
图5为有机溶剂的选择对分子光学探针NHR加入NaHSO3前后的影响。
图6为有机相-水相比例对分子光学探针NHR加入NaHSO3前后的影响。
图7为pH对分子光学探针NHR加入NaHSO3前后的影响。
图8为缓冲液的选择对分子光学探针NHR加入NaHSO3前后的影响。
图9为分子光学探针NHR(1.95μM)在不同浓度(0.0～9.0μM)NaHSO3存在时的荧光谱图。
图10为分子光学探针NHR(1.95μM)对不同浓度(0.0～9.0μM)NaHSO3的荧光响应曲线。
图11为分子光学探针NHR(5.0μM)在不同浓度(0.0～60.0μM)NaHSO3存在时的频率上转换发光谱图。
图12为分子光学探针NHR(5.0μM)对不同浓度(0.0～60.0μM)NaHSO3的响应曲线。
图13为选择性和抗干扰实验结果；1-16分别对应空白(探针分子)，Cl-,Br-,I-,HCO3 -,AcO-,SO4 2-,PO4 3-,NO3 -,柠檬酸,SCN-,Hcy,Cys,GSH,HS-,HSO3 -。
图14为激光共聚焦荧光显微镜对HeLa细胞的成像研究；图14A中，a为加探针培养，不加NaHSO3刺激下的绿色通道成像，b为红色通道成像，c为明场成像，d为明场、绿色通道和红色通道的叠加成像；图14B中，a为加探针培养和加NaHSO3刺激下的绿色通道成像，b为红色通道成像，c为明场成像，d为明场、绿色通道和红色通道的叠加成像。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
半花菁分子光学探针NHR(式I)的合成路线如下：
S1.化合物1的合成：以无水乙醇(3mL)为溶剂，N,N′-二苯基甲脒(5mmol)、原甲酸三乙酯(5mmol)和1-乙基-2,3,3-三甲基-3H-溴化吲哚(5mmol)在搅拌下、90℃加热回流2小时；反应结束后，反应液冷却至室温，将其倒入25g冰中，待冰融化后，减压过滤，分离出产物，产物用冰冷乙醚洗涤，真空干燥，得到化合物1。
S2.化合物2的合成：将新鲜蒸馏的环己酮(63.7mmol)滴加到浓硫酸(70ml，质量分数为95～98％)中，冷却到0℃，在剧烈搅拌下分次加入2-(4-二乙基氨基-2-羟基苯甲酰)苯甲酸(32mmol)；将混合物加热至90℃并保持1.5h，再冷却至室温；将得到的混合物倒入300g冰中，将质量分数为70％的高氯酸(7ml)加入到混合物中；减压过滤，分离出产物，用冷水(100mL)冲洗，得到化合物2。
S3.探针分子的合成：将化合物1(3mmol)、化合物2(3mmol)和醋酸钾(3mmol)加入到烧瓶中，用15mL乙酸酐溶解，然后在氩气保护下，50℃搅拌0.5h。将100mL水倒入烧瓶中结束反应，过滤，获得粗产物；采用硅胶柱层析，以二氯甲烷和甲醇的混合溶剂(二氯甲烷和甲醇＝125:1～30:1V/V)为洗脱剂，得到半花菁分子光学探针NHR，绿色固体粉末。
ESI-MS:计算得C38H42N2O3 +573.3112[M]+；得573.3110[M]+.
1H NMR(500MHz,MeOD)δ8.66(d,J＝13.8Hz,1H),8.20(d,J＝7.9Hz,1H),7.74(t,J＝7.5Hz,1H),7.63(t,J＝7.7Hz,1H),7.51(d,J＝7.4Hz,1H),7.39(t,J＝7.7Hz,1H),7.29–7.21(m,3H),6.77–6.67(m,3H),6.17(d,J＝14.0Hz,1H),4.16(q,J＝7.1Hz,2H),3.52(q,J＝7.2Hz,4H),2.65(t,J＝5.8Hz,2H),2.37–2.22(m,2H),1.77(s,8H),1.38(t,J＝7.2Hz,3H).
13C NMR(126MHz,MeOD)δ174.34,168.76,164.72,157.44,154.09,153.63,143.60,143.35,142.63,137.46,134.24,132.50,131.63,130.84,130.61,130.02,129.45,126.45,123.70,122.18,116.79,113.64,111.95,100.17,96.91,50.73,46.16,32.29,30.85,30.26,28.82,26.22,23.83,21.84,12.90,12.47.
实施例2
半花菁分子光学探针NHR以比色法检测亚硫酸氢根
取实施例1制备的半花菁分子光学探针NHR溶于四氢呋喃中，配制成浓度为60.0μM的储备液。取75μL储备液，加入到5mL离心管中，加入410μL纯化水和1000μL pH＝4.00 0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液，涡旋混匀，分别加入15μL浓度为0.1,0.2,0.3,0.5,0.8,1.0,1.2,1.5,2.0,2.5mM NaHSO3储备液(对应的，检测体系中NaHSO3浓度分别为：1.0,2.0,3.0,5.0,8.0,10.0,12.0,15.0,20.0,25.0μM)，以加入15μL纯化水作为空白对照，涡旋混匀得到检测体系，25℃水浴孵育60min，测定紫外-可见吸收谱图，结果如图1、图2所示。
且在可见光下，25℃水浴孵育60min后，溶液由加亚硫酸氢钠(加入2.5mMNaHSO3)前的绿色变为紫色。
图1为分子光学探针NHR(3.0μM)对NaHSO3响应的紫外-可见吸收谱图，可见，随着亚硫酸氢钠的浓度升高，711nm处的吸收逐渐减弱。
图2为图1对应的响应曲线，横坐标为检测体系中亚硫酸氢根浓度，纵坐标为不加亚硫酸氢根时711nm处吸光度(空白对照)减去加对应量亚硫酸氢根时711nm处吸光度的差值(ΔAbs.at 711nm)，当检测体系中NaHSO3的浓度在1.0～15.0μM时，探针具有很好的线性响应。
实施例3
半花菁分子光学探针NHR以比率计法检测亚硫酸氢根
取实施例1制备的分子光学探针NHR溶于四氢呋喃(THF)中，配制成浓度为500.0μM的储备液。取15μL储备液，加入到5mL离心管中，加入470μL纯化水和1000μL pH＝4.00 0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液，涡旋混匀，分别加入15μL浓度为0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.8,1.0,1.2,1.35,1.5mM NaHSO3储备液(对应的，检测体系中NaHSO3浓度分别为：0.1,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,8.0,10.0,12.0,13.5,15.0μM)，以加入15μL纯化水作为空白对照，涡旋混匀得到检测体系，25℃水浴孵育60min，以450nm为激发波长测量其荧光性质。结果如图3、图4所示。
图3为分子光学探针NHR(5.0μM)对NaHSO3响应的荧光谱图，可见，随着亚硫酸氢钠的浓度升高，747nm处的荧光强度(Fluorescence intensity,FL intensity)逐渐减弱，599nm处的荧光强度逐渐增强。
图4为对应的荧光响应曲线，横坐标为检测体系中亚硫酸氢根浓度，纵坐标为599nm处的荧光强度与747nm处的荧光强度的比值(I599/I747)，当检测体系中NaHSO3浓度在0.1～10.0μM时，探针具有很好的线性响应。
考察有机溶剂的选择对半花菁分子光学探针NHR检测NaHSO3的影响
取实施例1制备的分子光学探针NHR，分别溶于甲醇、乙醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈、丙酮中，配制成浓度为500.0μM的储备液。取15μL储备液，加入到5mL离心管中，加入470μL纯化水和1000μLpH＝4.00 0.2M磷酸氢二钠-磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液，涡旋混匀，加入15μL浓度为0.5mM NaHSO3储备液(对应的，检测体系中NaHSO3浓度：5.0μM)，涡旋混匀，25℃水浴混匀孵育60min，以450nm为激发波长测量其荧光性质。
结果如图5所示，当采用THF时，分子光学探针NHR对NaHSO3响应最好。
考察有机相-水相比例对分子光学探针NHR检测NaHSO3的影响
取实施例1制备的分子光学探针NHR溶于四氢呋喃中，配制成浓度为5.0mM的储备液。取1.5μL储备液，加入到5mL离心管中，分别加入：483.5μL纯化水(对应的，检测体系中有机相占比：1v/v‰)，6μL四氢呋喃与477.5μL纯化水(对应的，检测体系中有机相占比：5v/v‰)，13.5μL四氢呋喃与470μL纯化水(对应的，检测体系中有机相占比：1v/v％)，28.5μL四氢呋喃与455μL纯化水(对应的，检测体系中有机相占比：2v/v％)，43.5μL四氢呋喃与440μL纯化水(对应的，检测体系中有机相占比：3v/v％)，73.5μL四氢呋喃与410μL纯化水(对应的，检测体系中有机相占比：5v/v％)，148.5μL四氢呋喃与335μL纯化水(对应的，检测体系中有机相占比：10v/v％)；再加入1000μL pH＝4.00 0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液，涡旋混匀，加入15μL浓度为0.5mM NaHSO3储备液(对应的，检测体系中NaHSO3浓度：5.0μM)，涡旋混匀，25℃水浴孵育60min，以450nm为激发波长测量其荧光性质。
结果如图6所示，有机相占比为0.1～10v/v％时，分子光学探针NHR对NaHSO3均有良好响应，尤以占比为0.5v/v％时响应最好，综合考虑响应效果与检测线性范围，有机相占比可以进一步选择为1～5v/v％。
考察pH对分子光学探针NHR检测NaHSO3的影响
取实施例1制备的分子光学探针NHR溶于四氢呋喃中，配制成浓度为500.0μM的储备液。取15μL储备液，加入到5mL离心管中，加入470μL纯化水，分别加入1000μL pH＝2.00,3.00,3.50,4.00,4.50,5.00,6.00,7.00,8.00的伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液，涡旋混匀，加入15μL 0.5mM NaHSO3储备液(对应的，检测体系中NaHSO3浓度：5.0μM)，涡旋混匀，25℃水浴孵育60min，以450nm为激发波长测量其荧光性质。
结果如图7所示，pH为2.0～7.0时，分子光学探针NHR对NaHSO3均有较好响应，尤以pH＝4.0时响应最好。
考察缓冲液的选择对分子光学探针NHR检测NaHSO3的影响
取实施例1制备的分子光学探针NHR溶于四氢呋喃中，配制成浓度为500.0μM的储备液。取15μL储备液，加入到5mL离心管中，加入470μL纯化水，分别加入1000μL pH＝4.00的0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液，pH＝4.00的伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液，pH＝4.00的0.1M柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，pH＝4.00的0.2M醋酸-醋酸钠缓冲液，pH＝4.00的0.1mM盐酸水溶液，涡旋混匀，加入15μL 0.5mM NaHSO3储备液(对应的，检测体系中NaHSO3浓度：5.0μM)，涡旋混匀，25℃水浴孵育60min，以450nm为激发波长测量其荧光性质。
结果如图8所示，在上述4种缓冲液中均可以实现分子光学探针NHR对NaHSO3的良好响应，其中，0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液响应最佳。同时，不加缓冲液，仅用加入同pH的盐酸时，响应也较好。
实施例4
半花菁分子光学探针NHR以近红外激发和发射的下转换荧光传感法检测亚硫酸氢根
取实施例1制备的分子光学探针NHR溶于四氢呋喃中，配制成浓度为65.0μM的储备液。取45μL储备液，加入到5mL离心管中，加入440μL纯化水和1000μL pH＝4.00 0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液，涡旋混匀，加入15μL 0.05,0.1,0.15,0.25,0.35,0.45,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9mM NaHSO3(对应的，检测体系中NaHSO3浓度：0.5,1.0,1.5,2.5,3.5,4.5,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0μM)，以加入15μL纯化水作为空白对照，涡旋混匀得到检测体系，25℃水浴孵育60min，以700nm为激发波长测量其荧光性质。结果如图9、图10所示。
图9为分子光学探针NHR(1.95μM)在不同浓度NaHSO3存在时的荧光谱图，可见，随着亚硫酸氢钠的浓度升高，743nm处的荧光强度逐渐减弱。图10为分子光学探针NHR(1.95μM)对不同浓度NaHSO3的荧光响应曲线，横坐标为检测体系中亚硫酸氢根浓度，纵坐标为743nm处荧光强度的猝灭率((I0-I)/I0，I0为空白对照743nm处的荧光强度，I为含NaHSO3的检测体系743nm处的荧光强度)，当检测体系中NaHSO3的浓度在0.1～5.0μM时，探针具有很好的线性响应。
实施例5
半花菁分子光学探针NHR以近红外激发和发射的频率上转换发光传感法检测亚硫酸氢根
取实施例1制备的分子光学探针NHR溶于四氢呋喃中，配制成浓度为250.0μM的储备液。取30μL储备液，加入到5mL离心管中，加入455μL纯化水和1000μL pH＝4.00 0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液，涡旋混匀，加入15μL 0.05,0.1,0.2,0.5,0.8,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.5,6.0mM NaHSO3(对应的，检测体系中NaHSO3浓度：0.5,1.0,2.0,5.0,8.0,10.0,15.0,20.0,25.0,30.0,35.0,45.0,65.0)，以加入15μL纯化水作为空白对照，涡旋混匀得到检测体系，水浴(25℃)孵育60min，采用激光器，以808nm为激发波长激发测量其发光性质。结果如图11、图12所示。
图11为分子光学探针(5.0μM)对NaHSO3响应的频率上转换发光谱图，可见，随着亚硫酸氢钠的浓度升高，754nm处的频率上转换发光强度逐渐减弱。图12为对应的响应曲线，横坐标为检测体系中亚硫酸氢根浓度，纵坐标为754nm处频率上转换发光强度的猝灭率((I0-I)/I0)，I0为空白对照754nm处的频率上转换发射强度，I为含NaHSO3的检测体系754nm处的频率上转换发射强度)，当检测体系中NaHSO3的浓度在0.5～35.0μM时，探针具有很好的线性响应。
实施例6
半花菁分子光学探针NHR对NaHSO3的选择性和抗干扰能力
取实施例1制备的分子光学探针NHR溶于四氢呋喃中，配制成500.0μM储备液。取15μL储备液，加入到5mL离心管中，加入470μL纯化水和1000μL pH＝4.00 0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液，涡旋混匀，分别加入15μL纯化水或15μL 5mM其它分析物(Cl-,Br-,I-,HCO3 -,AcO-,SO4 2-,PO4 3-,NO3 -,柠檬酸,SCN-,Hcy,Cys,GSH,HS-，在检测体系中浓度均为50.0μM)或15μL 0.5mM HSO3 -(在检测体系中HSO3 -浓度为5.0μM)，涡旋混匀后，水浴(25℃)孵育60min，以450nm为激发波长测量其荧光性质，获得599nm处的荧光强度与747nm处的荧光强度的比值(I599/I747)。
取实施例1制备的分子光学探针NHR溶于四氢呋喃中，配制成500.0μM储备液。取15μL储备液，加入到5mL离心管中，加入455μL纯化水和1000μL pH＝4.00 0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液，涡旋混匀，加入15μL纯化水或15μL 5mM其它分析物(Cl-,Br-,I-,HCO3 -,AcO-,SO4 2-,PO4 3-,NO3 -,柠檬酸,SCN-,Hcy,Cys,GSH,HS-，在检测体系中浓度均为50.0μM)，加入15μL 0.5mM HSO3 -(在检测体系中HSO3 -浓度为5.0μM)，涡旋混匀，水浴(25℃)孵育60min，以450nm为激发波长测量其荧光性质，获得599nm处的荧光强度与747nm处的荧光强度的比值(I599/I747)。
结果见图5，分子光学探针NHR对各种常见离子及生物物质基本无响应，同时对亚硫酸氢根的响应基本不受各种常见离子及生物物质的影响，具有很好的抗干扰能力。
实施例7
半花菁分子光学探针NHR对葡萄酒中NaHSO3的检测试验
(1)比色法：
取实施例1制备的分子光学探针NHR溶于四氢呋喃中，配制成浓度为60.0μM的储备液。取75μL储备液，加入到5mL离心管中，加入410μL纯化水和1000μLpH＝4.00 0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液，涡旋混匀，分别加入15μL纯化水稀释60倍的葡萄酒、存在7-羟基香豆素(1.0μM)干扰的纯化水稀释60倍葡萄酒，涡旋混匀，水浴(25℃)孵育60min，测定其在711nm处的吸收值，代入实施例2所得的线性方程：ΔAbs.＝0.0124C-0.00821，计算所含亚硫酸氢根的含量。结果如表1所示。
加样回收实验：
取实施例1制备的分子光学探针NHR溶于四氢呋喃中，配制成浓度为60.0μM的储备液。取75μL储备液，加入到5mL离心管中，加入395μL纯化水和1000μL pH＝4.00 0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液，涡旋混匀，分别加入15μL纯化水稀释60倍的葡萄酒，存在7-羟基香豆素(1.0μM)干扰的纯化水稀释60倍的葡萄酒，分别加入15μL不同浓度的NaHSO3储备液，使得检测体系中NaHSO3的浓度：2.5,5.0,7.5μM，涡旋混匀，水浴(25℃)孵育60min，测定其在711nm处的吸收值，代入实施例2所得的线性方程，计算所含亚硫酸氢根的含量。结果如表1所示。
表1.比色法测定葡萄酒及存在7-羟基香豆素干扰葡萄酒中的NaHSO3含量
(2)比率计法：
取实施例1制备的分子光学探针NHR溶于四氢呋喃中，配制成浓度为500.0μM的储备液。取15μL储备液，加入到5mL离心管中，加入470μL纯化水和1000μL pH＝4.00 0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液，涡旋混匀，分别加入15μL纯化水稀释100倍的葡萄酒，存在7-羟基香豆素(1.0μM)干扰的纯化水稀释100倍葡萄酒，涡旋混匀，水浴(25℃)孵育60min，以450nm为激发波长量其荧光性质，代入实施例3所得的线性方程：I599/I747＝0.418C+0.201，计算所含亚硫酸氢根的含量。结果如表2所示。
加样回收实验：
取实施例1制备的分子光学探针NHR溶于四氢呋喃中，配制成浓度为500.0μM的储备液。取15μL储备液，加入到5mL离心管中，加入455μL纯化水和1000μL pH＝4.00 0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液，涡旋混匀，分别加入15μL纯化水稀释100倍的葡萄酒，存在7-羟基香豆素(1.0μM)干扰的纯化水稀释100倍的葡萄酒，分别加入15μL不同浓度的NaHSO3储备液，使得检测体系中NaHSO3的浓度：1.5,3.0,4.5μM，涡旋混匀，水浴(25℃)孵育60min，以450nm为激发波长测量其荧光性质，代入实施例3所得的线性方程，计算所含亚硫酸氢根的含量。结果如表2所示。
表2.比率计法测定葡萄酒及存在7-羟基香豆素干扰葡萄酒中的NaHSO3含量
(3)近红外激发和发射的下转换荧光传感法
取实施例1制备的分子光学探针NHR溶于四氢呋喃中，配制成浓度为65.0μM的储备液。取45μL储备液，加入到5mL离心管中，加入440μL纯化水和1000μL pH＝4.00 0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液，涡旋混匀，分别加入15μL纯化水稀释150倍的葡萄酒，存在7-羟基香豆素(1.0μM)干扰的纯化水稀释150倍葡萄酒，涡旋混匀，水浴(25℃)孵育60min，以700nm为激发波长测量其荧光性质，获得743nm处荧光强度的猝灭率，将其代入实施例4所得的线性方程：(I0-I)/I0＝0.1849C-0.0552，计算所含亚硫酸氢根的含量。结果如表3所示。
加样回收实验：
取实施例1制备的分子光学探针NHR溶于四氢呋喃中，配制成浓度为65.0μM的储备液。取45μL储备液，加入到5mL离心管中，加入425μL纯化水和1000μL pH＝4.00 0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液，涡旋混匀，分别加入15μL纯化水稀释150倍的葡萄酒，存在7-羟基香豆素(1.0μM)干扰的纯化水稀释150倍葡萄酒，分别加入15μL不同浓度的NaHSO3储备液，使得检测体系中NaHSO3浓度：1.0,2.0,3.5μM，水浴(25℃)孵育60min，涡旋混匀，以700nm为激发波长测量其荧光性质，获得743nm处荧光强度的猝灭率，将其代入实施例4所得的线性方程，计算所含亚硫酸氢根的含量。结果如表3所示。
表3.近红外激发和发射的下转换荧光传感法测定葡萄酒及存在7-羟基香豆素干扰葡萄酒中的NaHSO3含量
(4)近红外激发和发射的频率上转换发光传感法
取实施例1制备的分子光学探针NHR溶于四氢呋喃中，配制成浓度为250.0μM的储备液。取30μL储备液，加入到5mL离心管中，加入455μL纯化水和1000μL pH＝4.00 0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液，涡旋混匀，分别加入15μL纯化水稀释30倍的葡萄酒，存在7-羟基香豆素(1.0μM)干扰的纯化水稀释30倍的葡萄酒，涡旋混匀后，水浴(25℃)孵育60min，以808nm激光器激发测量其发光性质，获得754nm处频率上转换发光强度的猝灭率，将其代入实施例5所得的线性方程：(I0-I)/I0＝0.00939C+0.04359，计算所含亚硫酸氢根的含量。结果如表4所示。
加样回收实验：
取实施例1制备的分子光学探针NHR溶于四氢呋喃中，配制成浓度为250.0μM的储备液。取30μL储备液，加入到5mL离心管中，加入440μL纯化水和1000μL pH＝4.00 0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液，涡旋混匀，分别加入15μL纯化水稀释30倍的葡萄酒，存在7-羟基香豆素(1.0μM)干扰的纯化水稀释30倍葡萄酒，分别加入15μL不同浓度的NaHSO3储备液，使得检测体系NaHSO3中浓度：5.0,10.0,15.0μM,，涡旋混匀，水浴(25℃)孵育60min，以808nm为激光波长激发测量其发光性质，获得754nm处频率上转换发光强度的猝灭率，将其代入实施例4所得的线性方程，计算所含亚硫酸氢根的含量。结果如表4所示。
表4.近红外激发和发射的频率上转换发光传感法测定葡萄酒及存在7-羟基香豆素干扰葡萄酒中的NaHSO3含量
结果显示，分子光学探针NHR可有效检测葡萄酒及存在7-羟基香豆素干扰葡萄酒中的NaHSO3。
实施例8
荧光共聚焦显微镜对HeLa细胞的成像研究试验
分子光学探针NHR应用到HeLa细胞中对亚硫酸氢钠进行荧光成像
具体操作步骤如下：取实施例1制备的分子光学探针NHR溶于四氢呋喃与pH＝4.00的0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液的混合溶液中(有机相:水相＝3:97V/V)，配制成2.0μM的探针储备液，将探针储备液加入到两个育有HeLa细胞的培养皿中，并对培养皿进行编号：一号培养皿、二号培养皿，在二氧化碳培养箱中培养30分钟，用pH＝7.4的PBS缓冲液洗涤细胞三次；往二号培养皿中加入1mM NaHSO3溶液，一号培养皿不加NaHSO3；均置于二氧化碳培养箱中培养90分钟，采用共聚焦显微镜进行成像。
一号培养皿成像结果见图14A。用488nm的激光进行激发，在明场通道(c)可以观看到细胞的轮廓图，在绿色通道(a)(520～625nm)对细胞进行荧光成像时，观察到几乎无荧光信号；在红色通道(b)(>635nm)对细胞进行荧光成像时，观察到较强的荧光信号。对二号培养皿进行成像研究，结果见图14B。发现在绿色通道(a)出现较强荧光信号；在红色通道(b)几乎无荧光信号。说明分子光学探针NHR能够在细胞内对NaHSO3进行比率计荧光成像，可以制备用于检测癌细胞中亚硫酸氢根的试剂盒。
Claims (10)
1.结构如式I所示的半花菁分子光学探针在检测亚硫酸氢根的应用，
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：基于比色法、比率计法、近红外激发和发射的下转换荧光传感法或近红外激发和发射的频率上转换发光传感法，采用结构如式I所示的半花菁分子光学探针，测定待测样品液中亚硫酸氢根的浓度；其中，检测体系由有机相和水相组成，所述的有机相为四氢呋喃；检测体系中，有机相占比为0.1～10v/v％，优选为1～5v/v％，半花菁分子光学探针的浓度为0.5～15.0μM；检测体系的pH＝2.0～7.0，优选为pH＝4.0。
3.一种采用比色法检测亚硫酸氢根的方法，其特征在于：包括：
步骤(a)、半花菁分子光学探针溶于有机相中配制成探针储备液；将探针储备液和水相混合，涡旋混匀，加入不同浓度的NaHSO3水溶液，以加入等体积纯化水为空白对照，涡旋混匀得到检测体系，水浴孵育，测定紫外-可见吸收谱图；
步骤(b)、以检测体系中亚硫酸氢根的浓度为横坐标，空白对照711±10nm处吸光度减去加入亚硫酸氢根时检测体系711±10nm处吸光度的差值为纵坐标，建立标准曲线；
步骤(c)、按照步骤(a)测定含亚硫酸氢根的待测样品液的紫外-可见吸收谱图，得到711±10nm处的吸光度，将其代入标准曲线，计算得到待测样品液中亚硫酸氢根的浓度。
4.一种采用比率计法检测亚硫酸氢根的方法，其特征在于：包括：
步骤(a)、半花菁分子光学探针溶于有机相中配制成探针储备液；将探针储备液和水相混合，涡旋混匀，加入不同浓度的NaHSO3水溶液，以加入等体积纯化水为空白对照，涡旋混匀得到检测体系，水浴孵育，以450±10nm为激发波长，分别测得747±10nm处的荧光强度I2、599±10nm处的荧光强度I1，得到I1/I2；
步骤(b)、以检测体系中亚硫酸氢根浓度为横坐标、I1/I2为纵坐标建立标准曲线；
步骤(c)、按照步骤(a)测定含亚硫酸氢根的待测样品液的I1/I2，将其代入标准曲线计算得到待测样品液中亚硫酸氢根的浓度。
5.一种采用近红外激发和发射的下转换荧光传感法检测亚硫酸氢根的方法，其特征在于：包括：
步骤(a)、半花菁分子光学探针溶于有机相中配制成探针储备液；将探针储备液和水相混合，涡旋混匀，加入不同浓度的NaHSO3水溶液，以加入等体积纯化水为空白对照，涡旋混匀得到检测体系，水浴孵育，以550～720nm、优选为700nm为激发波长，分别测得含NaHSO3的检测体系、空白对照743±10nm处的荧光强度I、I0，计算荧光强度的猝灭率(I0-I)/I0；
步骤(b)、以检测体系中亚硫酸氢根浓度为横坐标、743±10nm处荧光强度的猝灭率(I0-I)/I0为纵坐标，建立标准曲线；
步骤(c)、按照步骤(a)测定含亚硫酸氢根的待测样品液的743±10nm处荧光强度的猝灭率，将其代入标准曲线计算得到待测样品液中亚硫酸氢根的浓度。
6.一种采用近红外激发和发射的频率上转换发光传感法检测亚硫酸氢根的方法，包括：
步骤(a)、半花菁分子光学探针溶于有机相中配制成探针储备液；将探针储备液和水相混合，涡旋混匀，加入不同浓度的NaHSO3水溶液，以加入等体积纯化水为空白对照，涡旋混匀得到检测体系，水浴孵育，以808nm为激发波长，分别测得含NaHSO3的检测体系、空白对照754±10nm处的频率上转换发射强度I、I0，计算频率上转换发射强度的猝灭率(I0-I)/I0；
步骤(b)、以检测体系中亚硫酸氢根浓度为横坐标、754±10nm处频率上转换发光强度的猝灭率((I0-I)/I0)为纵坐标，建立标准曲线；
步骤(c)、按照步骤(a)测定含亚硫酸氢根的待测样品液在754±10nm处的频率上转换发射强度的猝灭率，将其代入标准曲线计算得到待测样品液中亚硫酸氢根的浓度。
7.根据权利要求3-6任一项所述的检测亚硫酸氢根的方法，其特征在于：所述的检测体系中，有机相占比为0.1～10v/v％，优选为1～5v/v％，半花菁分子光学探针的浓度为0.5～15.0μM；检测体系的pH＝2.0～7.0，优选为pH＝4.0。
8.根据权利要求3-6任一项所述的检测亚硫酸氢根的方法，其特征在于：所述的水浴孵育的温度为15～35℃，时间为0.5～3h。
9.一种半花菁分子光学探针在检测葡萄酒中亚硫酸氢根的方法，其特征在于：包括：参照权利要求3-6任一项建立标准曲线；待测葡萄酒经纯化水稀释，将探针储备液与水相混合，再加入稀释后的葡萄酒，涡旋混匀得到检测体系，水浴孵育，按照比色法、比率计法、近红外激发和发射的下转换荧光传感法或近红外激发和发射的频率上转换发光传感法分别测得711±10nm处的吸光度、599±10nm处的荧光强度I1和747±10nm处的荧光强度I2的比值I1/I2、743±10nm处荧光强度的猝灭率、754±10nm处频率上转换发射强度的猝灭率，代入对应的线性方程，计算得到葡萄酒亚硫酸氢根的含量。
10.结构如式I所示的半花菁分子光学探针在制备用于检测癌细胞中亚硫酸氢根的试剂盒的应用。
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| CN116082450B (zh) * | 2022-06-16 | 2024-06-04 | 山东大学 | 一种近红外比率型pH荧光探针及其制备方法与其在破骨吸收成像中的应用 |
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