CN114674799A - 一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，包括以下步骤：S1：将4‑氨基苯磷酸钠盐添加至缓冲液中，获得第一混合液；S2：在所述第一混合液中，加入碱性磷酸酶得到第二混合液；S3：加热使所述第二混合液反应后得到第三混合液；S4：在所述第三混合液中，加入(3‑氨基丙基)三甲氧基硅烷液体，继续加热得到第四混合液；S5：通过荧光光谱仪收集所述第四混合液在455nm处的发射峰强度，并根据发射峰强度计算碱性磷酸酶的活性。仅通过低温加热和原位碳点的生成，实现对碱性磷酸酶ALP的高精度、可视化检测。具有选择性好，灵敏度高的特点，检出限低至0.075μU/mL，可用于对人体血清中或其他环境中碱性磷酸酶的进行灵敏检测，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本申请涉及酶检测技术领域，尤其涉及一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法及试剂盒。
背景技术
碱性磷酸酶(ALP)是一种哺乳动物组织中的重要水解酶，具有催化磷酸酯的水解和磷酸化功能。作为医疗诊断的关键生物标记物，ALP主要存在于肝脏、肾脏、肠道、骨骼和血清中，健康成人血清中ALP活性范围为46～190mU/mL，若表达水平异常，会造成心力衰竭、肾功能恶化、肝功能障碍、胆汁淤积、血管钙化、骨病和乳腺癌等疾病。为了保护人类健康，对ALP进行早期诊断与检测是迫在眉睫的事情。迄今为止，对ALP的检测方法主要包括：比色法、表面增强拉曼散射法、电化学分析法和色谱分析法等。在这些检测方法中，荧光检测技术因其固有的优势，如高灵敏度、实时检测和原位成像的特点而被广泛关注。目前，有机荧光分子、半导体量子点、金纳米簇、铜纳米簇等多种荧光材料被用于ALP的检测中。但是有机荧光探针水溶性较差，半导体量子点毒性较大，荧光共聚物制备步骤复杂且费时，贵金属纳米簇成本较高且稳定性差。因此，开发能够用于人类血清中快速、简便、灵敏检测ALP活性的方法是当前研究的重点。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，包括以下步骤：
S1：将4-氨基苯磷酸钠盐添加至缓冲液中，获得第一混合液；
S2：在所述第一混合液中，加入碱性磷酸酶得到第二混合液；
S3：加热使所述第二混合液反应后得到第三混合液；
S4：在所述第三混合液中，加入(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷液体，继续加热得到第四混合液；
S5：通过荧光光谱仪收集所述第四混合液在455nm处的发射峰强度，并通过发射峰强度计算碱性磷酸酶的活性。
在其中一个实施例中，所述第一混合液中4-氨基苯磷酸钠盐溶液的浓度为1-100mM。
在其中一个实施例中，所述步骤S3的加热温度为40-90℃，所述步骤S3的加热时间为15-120min。
在其中一个实施例中，步骤S4中所述(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷液体与所述第三混合液的体积比为1:7-3:4。
在其中一个实施例中，步骤S4的加热温度为30-90℃，加热时间为10-100min。
在其中一个实施例中，在步骤S4完成后，进行步骤S5之前，还包括步骤S5a：向所述第四混合液中加入参比物。
在其中一个实施例中，所述参比物为罗丹明、荧光金纳米团簇、荧光碳量子点、荧光硅量子点、荧光CdTe量子点中的至少一种，所述参比物在紫外光照下呈现红色。在其中一个实施例中，所述参比物在反应体系中的浓度为0.01-0.1mg/mL。
本发明相较于现有技术，其有益效果在于，仅通过低温加热和原位碳点的生成，实现对碱性磷酸酶的高精度、可视化检测。具有选择性好，灵敏度高的特点，检出限低至0.075μU/mL，可用于人体血清中或其他环境中对碱性磷酸酶进行灵敏检测，具有广阔的应用前景。
另一方面，本发明还提出一种用于碱性磷酸酶的高灵敏荧光检测的试剂盒，包括：缓冲液、4-氨基苯磷酸钠盐、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷液体，所述试剂盒通过权利要求1所述的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法实现对碱性磷酸酶活性的检测。
在其中一个实施例中，还包括参比物，所述参比物为罗丹明、荧光金纳米团簇、荧光碳量子点、荧光硅量子点、荧光CdTe量子点中的至少一种，所述参比物在紫外光照下呈现红色，通过比率荧光探针的构建，将检测精度提高一个数量级。
这种试剂盒仅通过较低温度的加热，再结合常用的紫外灯，即可实现对碱性磷酸酶的裸眼可视化、快速、高灵敏检测，成本低，效率高，具有广阔的应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明：
图1示出了本发明实施例对碱性磷酸酶的检测方法的步骤流程图；
图2示出了本发明实施例S1-S3步骤的最佳反应条件：(a)4-氨基苯磷酸钠盐浓度；(b)缓冲液pH；(c)二乙醇胺浓度；(d)温度；(e)反应时间；
图3示出了本发明实施例S4步骤的最佳反应条件：(a)温度；(b)反应时间；(c)APTMS与第三混合液的体积比；
图4示出了本发明实施例荧光法检测ALP的光谱及线性关系；
图5示出了本发明实施例中制备的CDs的TEM照片；
图6示出了本发明实施例中制备的CDs的XRD数据；
图7示出了本发明实施例中制备的CDs的XPS数据；
图8示出了本发明实施例中制备的CDs的FTIR数据；
图9示出了本发明实施例比率荧光法检测ALP的光谱及线性关系；
图10示出了本发明实施例检测ALP的特异性数据。
具体实施方式
为了更详细地阐明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明的技术方案做进一步阐述。
结合图1-10，在本申请中，提出了一种可视化的、低成本且高灵敏度的对碱性磷酸酶的荧光检测方法，首先通过以下的步骤确定对碱性磷酸酶的检测限：
将4-氨基苯磷酸钠盐(APP)添加至缓冲液中，获得第一混合液；将所述第一混合液均分为若干份，除去一份不加碱性磷酸酶(ALP)作为空白对照组外，分别加入不同活性的碱性磷酸酶得到第二混合液；随后，加热使各组所述第二混合液反应后得到多组第三混合液；在多组第三混合液中，分别加入定量(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷液体(APTMS)，继续加热得到第四混合液；通过荧光光谱仪收集所述第四混合液在455nm处的发射峰强度，并根据发射峰强度计算碱性磷酸酶的活性。通过调节4-氨基苯磷酸钠盐的浓度、缓冲液pH值、加热反应温度或加热反应时间，确定了灵敏度最高的检测条件。在大量的探索实验中，参考图2，在APP浓度为25mM，缓冲液为DEA且缓冲液的pH值为9.4且浓度为1M，加热温度为70℃且加热时间为105min的情况下，得到的产物碳量子点(CDs)的荧光强度最大，相应地对ALP的检测灵敏度和检测效率最佳。
在得到上述最优条件后，按照该条件制备若干份第三混合液，分别加入不同体积比的APTMS溶液，继续加热得到第四混合液；通过荧光光谱仪收集所述若干组第四混合液在455nm处的发射峰强度，并通过发射峰强度和碱性磷酸酶的活性构建线性关系，计算检出限。通过调节这个过程中加热温度、加热时间及APTMS的体积比，确定了灵敏度最高的检测条件。在大量的探索实验中，参考图3，在反应温度为70℃、反应时间为80min且APTMS与第三混合液的体积比为1:3的情况下，得到的产物碳量子点(CDs)的荧光强度最大，相应地对ALP的检测灵敏度和检测效率最佳。
具体地，结合探究实验的最优结果，经过以下的实验确定碱性磷酸酶的检测限：
首先，将250μL含1mM、MgCl2的二乙醇胺缓冲液(DEA,pH 9.4)、20μL的APP(25mM)和30μL不同活性的ALP溶液依次加入离心管中，并在70℃下孵育105min。接下来，在离心管中继续加入100μL的APTMS,继续在70℃下孵育80min反应结束。通过荧光光谱仪在380nm的激发光下收集455nm发射峰的强度数据，得到检出限。可以观察到随着ALP的不断增加，生成的CDs的量也不断增加，引起了位于455nm的发射峰的荧光强度不断增加，如图4a所示。与此同时，将得到的ALP活性和荧光强度的关系曲线进行线性拟合，在0.00075-75mU/mL的范围内，得到如图4b所示的线性方程，其函数关系如下式所示：
(F-F0)/F0＝86CALP+0.065
式中，CALP为ALP的活性，单位为U/mL，F0为ALP加入前体系的荧光强度，F为ALP加入体系后(即测试样)的荧光强度。其线性相关系数R2为0.993，线性范围为0.00075-75mU/mL，检测限为0.75μU/mL。
同时，由于ALP的活性的降低，产生的CDs的荧光强度也随之降低。可在日光灯下观察到溶液淡黄色的减弱，在紫外灯(λex＝365nm)下可观察到溶液蓝色荧光逐渐变弱的颜色变化情况。
利用透射电镜进行表征，结果如图5所示，碳量子点分散性好且粒径较为均匀，平均粒径为4.13nm。图6为CDs的XRD图谱，从图中可以看到出现了明显的衍射峰，其衍射角2θ＝23°,对应于石墨的(220)晶面。用XPS及傅里叶变换红外光谱对CDs组成进行了表征，结果如图7、8所示。从其XPS全谱图中可看出，碳量子点主要包含C、N、O三种元素；其C1s分峰拟合，得到三个峰位于284.7eV，285.9eV，288eV分别对应C-C/C＝C、C-N和C＝O/C＝N；N1s分峰得到的2个峰位于399.3eV，400.3eV分别对应氨基氮和吡咯氮；而O1s分峰拟合得到的两个峰对应于C＝O(531.1eV)和C-OH/C-O-C(532.2eV)。而从其傅里叶变换红外光谱可以看出3140和3400cm-1的振动峰对应于-NH2和-OH官能团。而其位于2930cm-1,1620cm-1,1476cm-1,1040–1120cm-1and 930cm-1的特征吸收峰则分别归属于-CH2,C＝N,C-N＝,C-O/C-N和C-H振动。我们从XRD谱及傅里叶变换红外光谱可以看出该碳点不仅在水中具有很好的分散性，其表面丰富的含氮基团还使其具有更好的荧光性能。
另外，为了进一步提高检测的灵敏度并实现更为直观的可视化检测，我们根据ALP检测结果中的产物CDs的光学特性，在检测的过程中引入罗丹明、荧光金纳米团簇、荧光碳量子点、荧光硅量子点、荧光CdTe量子点中的至少一种，所述参比物在紫外光照下呈现红色，可作为参比构建比率荧光检测平台。在此，引入罗丹明作为参比，其他条件保持不变；在380nm的激发光下收集荧光光谱数据，得到不同ALP活性下的光谱，如图9a所示。在红色罗丹明的存在下，随着ALP活性的增加，CDs的荧光强度不断增加，而两者发射峰强度的比值不断减小。对其位于455nm和580nm的荧光发射峰的比值与ALP的浓度活性的关系曲线进行线性拟合，得到如图9b所示的线性方程，其函数关系如下式所示：
I455/I580＝-26.6CALP+4.88
式中，CALP为ALP的活性，单位为U/mL，I455为CDs的发射峰处的荧光强度，I580为罗丹明发射峰处的荧光强度。其线性相关系数R2为0.995，线性范围为0.000075-75mU/mL，检测限为0.075μU/mL。
同时，由于ALP活性的降低，产生的CDs的荧光强度也随之降低。可在日光灯下观察到溶液淡黄色的减弱，在紫外灯(λex＝365nm)下可观察到溶液荧光由蓝色逐渐过度到紫色，最终变为红色的颜色变化情况。和前述单一荧光探针相比，其检出限进一步降低，并能显著提高裸眼可视化检测的效果。
传感平台要真正实现真实样品的检测，不仅需要较高的灵敏度，更需要具有较高的选择性。为了评估开发的传感平台在实际应用中的可行性，我们对真实场景中可能存在的一些干扰分子(牛血清蛋白、葡萄糖氧化酶、胃蛋白酶、脲酶及各种氨基酸和金属离子)进行了研究。其中，干扰分子的浓度是所检测碱性磷酸酶活性的5倍，其余实验条件均一致。图10显示的是对于荧光法和比率荧光法的干扰物实验。明显观察到所构建的检测平台在对碱性磷酸酶进行检测时不会受到相似干扰物微不足道的影响。
根据上述对碱性磷酸酶的检测条件的探究，本发明提出了一种对碱性磷酸酶的高灵敏度、可视化检测方法，包括以下步骤：
S1：将4-氨基苯磷酸钠盐添加至缓冲液中，获得第一混合液；
S2：在所述第一混合液中，加入碱性磷酸酶得到第二混合液；
S3：加热使所述第二混合液反应后得到第三混合液；
S4：在所述第三混合液中，加入(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷液体，继续加热得到第四混合液；
S5：通过荧光光谱仪收集所述第四混合液在455nm处的发射峰强度，并根据发射峰强度计算碱性磷酸酶的活性。
这种方法相较于现有技术，其有益效果在于，仅通过低温加热和原位碳点的生成，就可实现对ALP的高精度、可视化检测。具有选择性好，灵敏度高的特点，检出限低至0.75μU/mL，且可用于人体血清或其他环境中ALP的灵敏检测。同时，根据上述探究实验结果推断反应过程发生了席夫碱反应，即在碱性环境中可以促进底物的氧化和新物质的生成。所以在对ALP进行检测的过程中，缓冲液的pH优选值为8.0-10.2,优选地，缓冲液选自二乙醇胺缓冲液、伯瑞坦-罗宾森、磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中的任意一种均可；第一混合液中的APP的浓度优选为1-100mM。对第二混合液中的加热反应温度优选为40-90℃，进一步优选地，对第二混合液中的加热反应温度优选为70℃；此过程的加热反应时间优选为15-120min。在另外一些优选实施例中，对第三混合液与APTMS加热反应温度优选为30-90℃，进一步优选地，对第三混合液与APTMS加热反应温度优选为70℃；加热反应时间优选为10-100min。APTMS与第三混合液的体积比优选为1:7-3:4，最优地，APTMS与第三混合液的体积比优选为1:3。存在最适温度、反应时间及试剂用量，使得产物CDs的产量最高，即荧光光谱仪可测得最高的荧光强度。
进一步地，本发明中提出的对碱性磷酸酶的检测方法，还可以在步骤S4完成后进行S5a：向所述第四混合液中加入参比物。这些参比物为罗丹明、荧光金纳米团簇、荧光碳量子点、荧光硅量子点、荧光CdTe量子点中的至少一种，所述参比物在紫外光照下呈现红色，这些参比物在紫外光照下与反应产物CDs的淡蓝色荧光呈现明显差异，可用于构建比率荧光探针，提高可视化效果。优选地，所述参比物在反应体系中的浓度为0.01-0.1mg/mL，最优选的，所述参比物在反应体系中的浓度为0.025mg/mL。
通过比率荧光探针的构建，将检测精度提高一个数量级，使得对ALP的检出限达到0.075μU/mL，并能显著提高裸眼可视化检测的效果。
另一方面，本发明还根据上述对碱性磷酸酶的检测方法，提出一种试剂盒用于执行上述检测步骤以实现对碱性磷酸酶的检测。试剂盒包括：缓冲液、4-氨基苯磷酸钠盐、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷液体，再结合简单的光谱仪设备即可实现对碱性磷酸酶的高精度、可视化检测。
相应地，为了提高检测效果，试剂盒中还可以包括上述参比物，优选地，参比物为罗丹明、荧光金纳米团簇、荧光碳量子点、荧光硅量子点、荧光CdTe量子点中的至少一种，所述参比物在紫外光照下显红色。
以下结合实施例对本申请中提出的方案的检测效果进行描述：
实施例1：运用两种方法对血清中的碱性磷酸酶进行检测
从健康志愿者身上取得人血清样品，使用前用1×PBS缓冲液稀释50倍。然后通过添加不同活性的ALP制备标准样品，代替步骤S2中加入的ALP溶液。配置ALP浓度活性分别为1.88mU/mL、3.75mU/mL、7.5mU/mL和37.5mU/mL的血清溶液其他条件保持不变，反应结束后收集对应荧光数据与所得线性方程进行对比，测试该ALP荧光检测平台在真实样品测试中的准确性。测试结果如下表所示。
结果表明，该策略对真实样品的检测与添加剂浓度几乎一致。在血清中，荧光法和比率荧光探针检测的回收率分别为95.2％-101.3％和96％-101％。此外，他们的相对偏差(RSD)均未超过7.7％。所以，本文所提出的ALP检测策略是可靠的，可以用于真实样品的测定。
最后，应当予以说明的是：以上所述实施例仅仅是本发明为清楚地说明本发明所作的较佳举例，但这并不是对本发明的实施方案的限制，所属领域的普通技术人员应当理解，以上方案中技术特征可以任意组合，在上述具体实施方式的基础上还可以做出其它不同形式的修改或对部分技术特征进行同等替换，这里无法对所有的实施方式予以穷举，因而，凡在本发明的精神和原则之内，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的所有的任何修改、改进、等同替换等等，都应处于本发明请求保护的技术范围之内。
Claims (10)
1.一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将4-氨基苯磷酸钠盐添加至缓冲液中，获得第一混合液；
S2：在所述第一混合液中，加入碱性磷酸酶得到第二混合液；
S3：加热使所述第二混合液反应后得到第三混合液；
S4：在所述第三混合液中，加入(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷液体，继续加热得到第四混合液；
S5：通过荧光光谱仪收集所述第四混合液在455nm处的发射峰强度，并根据发射峰强度计算碱性磷酸酶的活性。
2.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶的荧光检测方法，其特征在于，所述第一混合液中4-氨基苯磷酸钠盐溶液的浓度为1-100mM。
3.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶的荧光检测方法，其特征在于，所述步骤S3的加热温度为40-90℃，所述步骤S3的加热时间为15-120min。
4.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶的荧光检测方法，其特征在于，步骤S4中所述(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷液体与所述第三混合液的体积比为1:7-3:4。
5.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶的荧光检测方法，其特征在于，步骤S4的加热温度为30-90℃，加热时间为10-100min。
6.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶的荧光检测方法，其特征在于，在步骤S4完成后，进行步骤S5之前，还包括步骤S5a：向所述第四混合液中加入参比物。
7.根据权利要求6所述的碱性磷酸酶的荧光检测方法，其特征在于，所述参比物为罗丹明、荧光金纳米团簇、荧光碳量子点、荧光硅量子点、荧光CdTe量子点中的至少一种，所述参比物在紫外光照下呈现红色。
8.根据权利要求6所述的碱性磷酸酶的荧光检测方法，其特征在于，所述参比物在反应体系中的浓度为0.01-0.1mg/mL。
9.一种用于碱性磷酸酶的高灵敏荧光检测的试剂盒，其特征在于，包括：缓冲液、4-氨基苯磷酸钠盐、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷液体，所述试剂盒通过权利要求1所述的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法实现对碱性磷酸酶活性的检测。
10.根据权利要求9所述的用于碱性磷酸酶的高灵敏荧光检测的试剂盒，其特征在于，还包括参比物，所述参比物为罗丹明、荧光金纳米团簇、荧光碳量子点、荧光硅量子点、荧光CdTe量子点中的至少一种，所述参比物在紫外光照下呈现红色。
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