CN113959997B - 一种用于同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的3d折叠比率荧光微流控装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生化分析与生物传感器技术领域，涉及一种用于同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的3D折叠比率荧光微流控装置和方法，所述装置包括：滤纸上设置有四层矩形通道，每两层通道之间可折叠；第一层矩形通道包括中央样品区和I形路径，所述中央样品区位于I形路径中部，所述I形路径两端为圆形区域；与第一层矩形通道相邻的第二层矩形通道包括所述I形路径；第三层和第四层矩形通道分别在两端设置有圆形区域，该圆形区域与第一层、第二层矩形通道中的圆形区域相对应。三维折叠μPAD具有成本低、操作简单、效率高、精度好、灵敏度高、选择性好等特点，可能为POCT领域提供一种创新方法。

Description

一种用于同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的3D折叠比率 荧光微流控装置和方法
技术领域
本发明属于生化分析与生物传感器技术领域，涉及一种用于同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的3D折叠比率荧光微流控装置和方法。
背景技术
现场即时检测(POCT)是体外诊断的一个重要分支，在现代分析化学和临床检测中发展十分迅速。POCT具有操作简单、设置方便等不可替代的优势，为家庭医疗保健、偏远地区疾病的初步诊断及快速现场检测提供了可能。纸基微流控装置(μPAD)将多个实验步骤集中在一张小纸片的亲水检测区上，具有开发简单、便携、一次性、低成本和快速POCT等许多吸引人的特点。此外，μPAD消耗样品和试剂极其少量。除了常用的蜡印法外，最近还使用市售的油性马克笔可在1分钟内轻松制作μPAD。并且可以结合适当的检测方法(如电化学、比色法、荧光法、发光法)，成功开发了各种二维和三维μPAD并广泛应用于生物分析、医学诊断和环境监测。例如，Tenda等报道了依靠生物发光共振能量转移开关产生比色信号并进行蛋白质识别的二维μPAD。Cinti等制造了二维μPAD并通过电化学方法检测啤酒样品中的乙醇。Trieu等报道了用于活细胞比色识别的三维折叠μPAD。近年来，智能手机作为一种无需仪器的分析设备，由于其高分辨率成像可对比色和荧光图片进行准确定量，这将为基于μPAD的POCT打开广阔的视野。到目前为止，开发一种用于多种分析物的简便、高效、准确并同时检测的新型μPAD仍然是非常需要的。
酶广泛存在于生物有机体中，并参与生物过程的调控，而酶活性的异常总是与某些疾病有关。血清中碱性磷酸酶(ALP)和丁酰胆碱酯酶(BChE)在临床上被认为是诊断肝功能障碍、肝硬化和慢性肝炎等肝脏疾病的两个重要生物标志物。此外，ALP和BChE的异常表达也与甲状腺功能亢进、糖尿病、高血压、癌症等有关。因此，高效、方便、灵敏、同时检测血清中ALP和BChE活性对于相关疾病的早期诊断和预后至关重要。目前，已经做出许多努力来开发用于ALP或BChE检测的方法，例如荧光法、比色法、电化学法和拉曼光谱分析法。其中，基于碳点(CDs)的荧光方法因其卓越的准确性、出色的灵敏度和高选择性而备受关注。
然而由于难以区分两种酶促反应，同时检测ALP和BChE仍然面临巨大挑战。与单一荧光信号相比，比率荧光法由于可抵消性质上的变化，能增强色变分辨率和提高的定量精确度而在现场检测方面引起了广泛关注。然而，使用μPAD对多种分析物的比率传感仍然存在障碍，例如缺少适当的反应和检测体系，以及信号转化的潜在问题。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供一种用于同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的3D折叠比率荧光微流控装置和方法，三维折叠μPAD已成功用于同时检测真实血清样本中的ALP和BChE，可用于POCT。三维折叠μPAD具有成本低、操作简单、效率高、精度好、灵敏度高、选择性好等特点，可能为POCT领域提供一种创新方法。
具体地，本发明是通过如下技术方案实现的：
在本发明的第一方面，一种用于同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的3D折叠比率荧光微流控装置，滤纸上设置有四层矩形通道，每两层通道之间可折叠；第一层矩形通道包括中央样品区和I形路径，所述中央样品区位于I形路径中部，所述I形路径两端为圆形区域；与第一层矩形通道相邻的第二层矩形通道包括所述I形路径；第三层和第四层矩形通道分别在两端设置有圆形区域，该圆形区域与第一层、第二层矩形通道中的圆形区域相对应。
在本发明的第二方面，一种用于同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的3D折叠比率荧光微流控装置，滤纸上设置有四层矩形通道，每两层通道之间可折叠；第一层矩形通道包括中央样品区和I形路径，所述中央样品区位于I形路径中部，所述I形路径两端为圆形区域；与第一层矩形通道相邻的第二层矩形通道包括所述I形路径；第三层和第四层矩形通道分别在两端设置有圆形区域，该圆形区域与第一层、第二层矩形通道中的圆形区域相对应。
在本发明的第三方面，一种同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的检测方法，所述检测方法基于所述的用于同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的3D折叠比率荧光微流控装置和/或所述的用于同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的检测系统。
在本发明的第四方面，一种可视化现场即时检测平台，所述检测平台包括所述的用于同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的3D折叠比率荧光微流控装置和/或所述的用于同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的检测系统。
本发明一个或多个实施例具有以下有益效果：
(1)、灵活且具有成本效益：3D折纸μPAD通过使用市售黑色油性马克笔和特定金属模具一步绘图轻松制备，无需任何专业技能或特殊设备。
(2)、多重检测：4层2平行通道设计的3D结构可以同时检测ALP和BChE，无干扰，而传统设计的二维试纸或侧流检测难以实现多重检测。
(3)、高选择性和准确性：通过级联催化反应(酶和底物、Cu2+和OPD)成功构建具有两种相同荧光信号指示(oxOPD和CDs)的比率荧光检测系统，可以在未经任何预处理程序下选择性和准确地检测真实人血清样品中的ALP(单位为U L-1)和BChE(单位为U mL-1)。
(4)、视觉检测方便：智能手机结合手持式紫外灯，可拍摄高分辨率的荧光图片，无需使用任何笨重的检测设备。
(5)、适用于POCT：开发的三维折叠μPAD只需要20μL真实样品，通过简单折叠和展开相邻层以启动多步反应来实现检测。
(6)、易于扩展：通过简单地改变生化反应，开发的平台可以很容易地扩展到其他检测目标。总体而言，所提出的具有独特优势的三维折叠μPAD将在未来在不同领域(例如临床诊断、个性化医疗、环境分析和食品监测)中找到广泛而出色的应用，尤其是在应用资源有限的情况下可进行POCT。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1三维折叠μPAD的制作过程：
图2：比率荧光检测机制示意图(a)和智能手机辅助三维折叠μPAD(b)用于同时可视化检测ALP和BchE；
图3(a)TEM图像(插图：HR-TEM)；(b)傅立叶变换红外光谱；(c)XPS图；(d)CDs的紫外-可见吸收光谱(黑色线)、365nm激发下的荧光发射光谱(红色线)和445nm激发下的荧光发射光谱(蓝色线)；
图4(a)ALP和(b)BChE检测的线性拟合图。插图：智能手机在365nm紫外灯激发下拍摄的荧光图片(ALP，从左到右:5,25,50,100,200,300,350U L-1,BChE,1.0,2.5,5.0,10.0,15.0,22.0,25.0U mL-1)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
目前，同时检测ALP和BChE仍然面临巨大挑战，使用μPAD对多种分析物的比率传感仍然存在障碍，缺少适当的反应和检测体系，以及信号转化的潜在问题。为此，本发明提供了一种用于同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的3D折叠比率荧光微流控装置和方法。
在本发明的一种或多种实施例中，一种用于同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的3D折叠比率荧光微流控装置，滤纸上设置有四层矩形通道，每两层通道之间可折叠；第一层矩形通道包括中央样品区和I形路径，所述中央样品区位于I形路径中部，所述I形路径两端为圆形区域；与第一层矩形通道相邻的第二层矩形通道包括所述I形路径；第三层和第四层矩形通道分别在两端设置有圆形区域，该圆形区域与第一层、第二层矩形通道中的圆形区域相对应。
所述微流控装置是一种高效、便携且实用的三维折叠纸基比例荧光微流控装置，可用于使用级联催化反应及两种相同的荧光信号指示同时检测ALP和BChE。
进一步地，所述I形路径中的圆形区域的直径为3-15mm；或，所述I形路径中两个圆形区域中间的连接路径长度为4-20mm，宽度为1-10mm；或，每两层通道之间的间距为0-0.8mm；或，所述中央样品区的直径为4-20mm。
在本发明的一种或多种实施例中，一种用于同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的检测系统，所述检测系统包括所述的微流控装置；所述微流控装置中的四层矩形通道一侧的四个圆形区域命名为A通道，A通道按照从第一层矩形通道到第四层矩形通道的方向依次装载有PPi、Cu2+、OPD和CDs；另一侧的四个圆形区域命名为B通道，B通道按照从第一层矩形通道到第四层矩形通道的方向依次装载有BTCh、Cu2+、OPD和CDs。
ALP/BChE和底物在第一层反应，然后剩余的底物和酶产物移动到第二层与Cu2+络合。一旦未反应的Cu2+到达第3层并与预载的OPD发生反应，oxOPD就会发生并转移到第4层以猝灭CDs的荧光。荧光图片由智能手机拍摄，并由RGB分析软件进行可视化定量分析。
进一步地，A通道：装载有PPi的圆形区域中还含有Mg2+；进一步地，所述PPi的浓度为3-8mM，优选的为5mM，所述PPi的体积为2-8μL，优选的为5μL；进一步地，所述Mg2+的浓度为0.05-0.2mM，优选的为0.1mM；进一步地，所述Cu2+的浓度为0.2-1.0mM，优选的为0.6mM，所述Cu2+的体积为2-10μL，优选的为5μL；进一步地，所述OPD的浓度为0.05-0.2M，优选的为0.1M，所述OPD的体积为2-10μL，优选的为5μL；进一步地，所述CDs的浓度为1-5mg ml-1，优选的为3mg ml-1，所述CDs的体积为2-10μL，优选的为5μL。
进一步地，B通道：所述BTCh的浓度为0.05-0.2M，优选的为0.1M，所述BTCh的体积为2-8μL，优选的为5μL；进一步地，所述Cu2+的浓度为2-8mM，优选的为4mM，所述Cu2+的体积为2-10μL，优选的为5μL；进一步地，所述OPD的浓度为0.05-0.2M，优选的为0.1M，所述OPD的体积为2-10μL，优选的为5μL；进一步地，所述CDs的浓度为5-15mg ml-1，优选的为10mg ml-1，所述CDs的体积为2-10μL，优选的为5μL。
进一步地，所述CDs的制备方法包括：将原料和水置于高压釜中，在180-200℃下加热反应8-15h，将得到的产物进行过滤、透析获得碳点。
进一步地，所述原料为茄子、花生、包菜、黄瓜、猕猴桃、韭菜、空心菜、玉米；优选的，为茄子；所述过滤以0.22μm膜进行过滤，收集滤液；用透析袋将滤液透析2-4天，得到的溶液再经过0.22μm膜过滤后冷却干燥，最后，将获得的碳点重新溶解在水中，备用。
在本发明的一种或多种实施例中，一种同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的检测方法，所述检测方法基于所述的用于同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的3D折叠比率荧光微流控装置和/或所述的用于同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的检测系统。
进一步地，所述检测方法包括：在第一层矩形通道的中央样品区滴加不同浓度的ALP和BchE标准溶液或人血清样品，进行孵育；然后，将第二层矩形通道折叠到第一层矩形通道上并滴加缓冲液将底物和酶产物带到第二层，继续孵育；随后，将第一层矩形通道展开，将第三层矩形通道折叠到第二层矩形通道上，并加入缓冲液使游离的Cu2+与OPD反应；最后，将第四次矩形通道折叠到第三层矩形通道；在紫外线灯下，拍摄荧光图片，并通过颜色识别器进行定量分析。
具有两种相同荧光信号指示的级联催化反应被合理设计用于ALP和BChE的比率荧光检测，具体原理：ALP的酶底物(焦磷酸PPi)和BChE的酶产物(硫代胆碱TCh)可以与Cu2+强烈络合，Cu2+将邻苯二胺(OPD)氧化成具有荧光发射的2，3-二氨基吩嗪(oxOPD)(紫外吸收峰在420nm处，荧光发射峰在565nm处)，而oxOPD通过内滤效应(IFE)猝灭碳点(CDs，最大发射峰在445nm处)的荧光，成功开发了具有445nm(来自CDs的蓝色荧光)和565nm(来自oxOPD的黄色荧光)双发射的比率荧光传感平台，用于ALP和BChE传感。ALP的加入促进了oxOPD的产生，CDs的发射峰降低，而对于BChE，观察到相反的结果。
根据检测原理，采用黑色油性马克笔和定制的金属模具一步绘图制作了由四层和两个平行通道组成的三维折叠μPAD。通过简单的折叠展开相邻层，依次启动纸上试剂间的反应，用智能手机拍摄检测区域的荧光图片，并通过手机软件对图片进行RGB值读取以达到定量分析。
在本发明的一种或多种实施例中，一种可视化现场即时检测平台，所述检测平台包括所述的用于同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的3D折叠比率荧光微流控装置和/或所述的用于同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的检测系统。
将比率荧光测定与三维折叠纸基微流控装置(μPAD)相结合的新型结果输出平台，用于碱性磷酸酶(ALP)和丁酰胆碱酯酶(BChE)的同时可视化现场即时检测(POCT)具有较高的精确度和选择性。在最佳条件下，所提出的检测平台在无需任何预处理的情况下，成功地检测了人血清样品中活性差异为3个数量级的ALP和BChE，并表现出优异的选择性、良好的精密度、良好的线性范围和高的准确度。重要的是，该平台为多种生物标志物的高通量的现场检测开辟了广阔的前景。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
实验部分
1.1碳点的制备
以茄子为原料，采用水热法合成了CDs。将茄子(25.0g)和超纯水(15.0mL)放入聚四氟乙烯内衬的高压釜中，并在190℃下加热10h。得到的深色产物通过0.22μm膜过滤，收集棕色滤液。随后，将所需溶液用透析袋(分子截留量为500Da)透析两天。得到的黄色溶液经0.22μm膜过滤后冷冻干燥。最后，将获得的CDs重新溶解在超纯水中，使浓度达到10mg mL-1储存以用来接下来的操作。
1.2 3D折叠μPAD的制作
无荧光的Whatman 4号矩形滤纸(63mm×100mm)用来制作三维折叠μPAD，将其折叠成63mm×25mm的四层矩形通道(即样品层、反应层和检测层)(图1)。将具有特定图案和尺寸的金属模具放置在纸上，然后选择市售的黑色油性记号笔绘制模具的图案以构建疏水性屏障。第一层包含一个中央样品区(直径为8毫米)和“I”形路径(宽度为3mm；长度为9mm)以将样品分成两个一致的反应/检测通道(A和B，直径为6mm)用于同时检测ALP和BChE且互不干扰。通道A的四个未折叠层的反应/检测区预先依次装载有PPi(5μL，5mM，含有0.1mM Mg2+)、Cu2+(5μL，0.6mM)、OPD(5μL，0.1M)和CDs(5μL,3mg mL-1)。对于通道B，预载丁酰硫代胆碱(BTCh，5μL，0.1M)、Cu2+(5μL，4mM)、OPD(5μL，0.1M)和CDs(5μL，10mg mL-1).最后，将每个制备好的三维折叠μPAD在室温下自然干燥，置于密封袋中于4℃下避光储存。并在1个月的储存期内未发现灵敏度显着下降。
1.3 3D折叠μPAD同时检测ALP和BChE
在第一层样品区域滴加不同浓度的ALP和BChE标准溶液或人血清样品(20μL)，置于37℃潮湿环境中孵育30min。然后将第二层折叠到第一层上并滴加Tris-HCl缓冲液(5μL，10mM，pH＝8.0)将底物和酶产物带到第二层，并在37℃下再孵育10分钟。随后将第一层展开，将第三层折叠到第二层上，并加入Tris-HCl缓冲液(5μL，10mM，pH＝8.0)使游离的Cu2+在37℃下与OPD反应25分钟。最后，将第4层折叠到第3层，在手持式紫外线灯(Ex＝365nm)下通过智能手机立即拍摄荧光图片，并通过RGB软件(颜色识别器)进行定量分析。值得注意的是，三维折叠μPAD通过折叠实现了多步有序反应，每层允许两个独立的反应而不会产生干扰。
检测方法如图2，焦磷酸(PPi，ALP的酶底物)和硫代胆碱(TCh，BChE的酶产物)可以与Cu2+配位，而游离的Cu2+将邻苯二胺(OPD)氧化成2,3-二氨基吩嗪(oxOPD，紫外吸收峰在420nm处，荧光发射峰在565nm处)，然后oxOPD通过内滤效应(IFE)抑制CDs的发射(荧光发射峰445nm处)。
结果与讨论
2.1碳点的合成与表征
当茄子(25g)与水(15mL)在聚四氟乙烯衬里的高压釜中在190℃下反应10h时，制备的CDs的荧光强度最大。为确认CDs的成功合成进行了一系列表征。从图3a可以看出，CDs是单分散的，平均直径约为5nm。图3a中插入的高分辨率透射电子显微镜(HR-TEM)图像表明CDs的晶格距离为0.21nm，这归因于石墨碳的(100)面。CDs的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)谱表明CDs在3225、2931、1766、1578、1351、1277和1070cm-1处有吸收峰(图3b)，分别属于O–H/N–H、C–H、C＝O、C＝C、C–N、C–O、C–O–C的伸缩振动。因此，可以推断CDs表面含有–COOH、–OH、–NH2。该结论可以通过CDs的X射线光电子能谱(XPS)光谱来验证。在完整的XPS测量谱中，CDs呈现O1s(531.61eV)、N1s(399.71eV)和C1s(284.81eV)峰，C、N和O的相对元素含量分别为66.75％、8.25％和25.00％(图3c)。
2.2碳点的光学性质
紫外-可见光谱显示CDs在245nm和320nm处有吸收带(图3d)，这些吸收带归因于π→π*(C＝C)和n→π*(C＝N和C＝O)电子跃迁。此前的研究发现CDs与起始物质具有相似的UV-Vis光谱，但无法检测到茄子中主要化合物苯丙素的吸收特性。可以推测，所提取物在水热处理过程中已经完全分解并碳化为CDs。荧光光谱显示CDs在365nm激发下在445nm处的最大发射峰(图3d)。当激发波长从325nm增加到395nm时，CDs的发射峰红移，表明CDs具有激发依赖行为，这是CDs的标志性特征。以硫酸奎宁为参比，CDs的相对量子产率为3.65％。
2.3同时测定ALP和BChE活性的荧光机理
对于酶活性测定，荧光法因操作简单、灵敏度高、准确度高和生物相容性好而备受关注。然而，迄今为止，报道主要集中在单一酶的测定方法上，同时检测多种酶仍然是一个挑战，更不用说一些更简单的荧光方法。有趣的是，PPi(ALP的酶反应底物)和TCh(BChE的酶反应产物)可以与Cu2+复合，而磷酸盐(Pi，ALP的酶促产物)和丁酰硫胆碱(BTCh，BChE的酶促底物)不与Cu2+反应。随后，Cu2+可以将OPD氧化成oxOPD，oxOPD是一种黄色荧光化合物，最大发射波长为565nm。因此，可以开发用于ALP(BChE)检测的级联催化反应系统PPi(BTCh)/Cu2 +/OPD。更重要的是，高精度的比率荧光方法消除了背景干扰和周围环境的影响。oxOPD在420nm处有最大吸收，可以通过IFE猝灭蓝光CDs的荧光。oxOPD的UV-vis吸收光谱与制备的CDs的激发和发射光谱有很好的重叠。同时，加入oxOPD后，CDs的荧光寿命没有改变，表明CDs和oxOPD之间发生了内滤效应。因此，可以构建具有两种相同的荧光信号指示的比率荧光体系，即oxOPD/CDs，以准确、灵敏和选择性地检测ALP(BChE)(如图1a所示)。CDs和oxOPD的不同荧光变化与ALP(BChE)活性密切相关。为了实现可视化检测，选择365nm作为激发波长。发现，随着ALP活性的增加，PPi的减少促进了更多oxOPD的产生，这有效地抑制了CDs的荧光发射。而对于BChE，则观察到相反的结果。
2.4工作原理
为了同时现场检测ALP和BChE，根据检测原理设计了具有四层和两个并行通道的3D折叠μPAD。反应试剂(PPi/BTCh、Cu2+、OPD、CDs)依次预装在不同层上，折叠相邻的两个层后，反应可以根据样品溶液的流动顺序发生，没有任何干扰。对于通道A，加入样品后，ALP分解PPi生成Pi(第一层)，未反应的PPi与Cu2+络合(第二层)，剩余的Cu2+与OPD反应形成oxOPD(第三层)，oxOPD与CDs接触以进行比率荧光检测。对于通道B，样品中的BChE催化BTCh转化为TCh(第一层)，与Cu2+(第二层)生成配合物，接下来两个过程与通道A相同。可以简单地通过智能手机拍摄检测区域的荧光图像。因此，开发了一种简单、高效、便携且稳健的POCT平台，该平台采样-结果输出特性，可用于同时检测ALP和BChE。
2.5基于三维折叠μPAD的荧光检测的优化和选择性
为获得检测ALP和BChE活性的最佳条件，对三维折叠μPAD的反应参数进行了优化。红墨水在毛细力的作用下从样品区流向反应区，说明商业黑色油性马克笔可以成功构建疏水屏障，并且最佳进样量为20μL。以上述结果为标准，将相邻两层溶液折叠后，加入5μL的Tris-HCl缓冲液(10mM、pH＝8.0)，逐层渗透并进行多步有序反应。随后，反应浓度(PPi,5mM；BTCh,0.1M；Cu2+，0.6mM用于ALP测定，4mM用于BChE测定；OPD,0.1M；CDs,ALP检测时为3mg mL-1,BChE检测时为10mg mL-1)，反应时间(酶和底物，30min；底物/酶促产物和Cu2+，10min；在三维折叠μPAD平台上对反应的缓冲环境(Tris-HCl,10mM,pH＝8.0)和反应温度(37℃)进行了研究和优化。
为了测试检测平台的选择性，对生物干扰进行了研究，包括离子、阴离子、氨基酸、牛血清白蛋白(BSA)和酶。发现对ALP和BChE测定的干扰可以忽略不计。因此，所开发平台的出色选择性使实际应用成为现实。
2.6分析性能
在最佳条件下，评估了ALP和BChE活性检测的分析优值图(线性、检测限(LOD)和重现性)。如图4a所示，随着ALP活性的增加，检测层的荧光图像逐渐由蓝色变为黄绿色，并且G/B(G与B的比值)与ALP活性之间在5.0–350.0U L-1的范围存在良好的线性关系(y＝0.0032x+0.9045，R2＝0.9875)。ALP检测的LOD估计为3.6U L-1(3σ/S，σ是空白样品的标准偏差，S是线性方程的斜率，n＝12)。与ALP检测现象相反，随着BChE活性的增加，检测层的荧光图像从黄绿色变为蓝色(图4b)。(R+G+B)/R在1.0–25.0U mL-1(y＝0.0817x+2.2636,R2＝0.9931)范围内与BChE活性具有良好的线性关系，LOD为0.4U mL-1(3σ/S)。众所周知，健康人血清样本中的ALP和BChE水平差异很大，分别为53.0-130.0U L-1和5.1-12.6U mL-1。值得注意的是，线性范围和LOD足以直接在实际样品中同时检测ALP和BChE，并且无需任何稀释步骤。最近报道的用于ALP和BChE检测的荧光方法，几乎所有的方法都是单酶分析方法，同时对于BChE分析，真实样品应该是1000倍稀释。检测性能差、选择性低，制备方法复杂。
此外，通过测量ALP(25、50和100U L-1)和BChE(1、5和10U mL-1)来评估该平台的重现性。结果表明，日内测定(三个平行传感)和日间测定(五天跨度)的相对标准偏差(RSD)值分别为1.2-4.9％和1.3-5.4％，重现性在可接受的范围里。
2.7基于3D折叠μPAD平台的人血清样本检测
为了证明所提出的三维折叠μPAD平台用于ALP和BChE检测的可行性，在无需任何预处理程序的前提下，对原发性胆道胆管炎(PBC)患者的真实血清样本进行了分析。如表1所示，发现ALP的浓度为164.06±3.39,174.36±4.36U L-1，而BChE的浓度为9.30±0.20,10.93±0.11U mL-1，这与之前的报道非常一致。当加入不同浓度的ALP和BChE后，加标回收率分别为98.1，104.0％，RSD<5.2％，表明该平台适用于真实样品中ALP和BChE的POCT检测，并且准确度高。
Figure BDA0003287100160000111
Figure BDA0003287100160000121
总之，首次构建了基于比率荧光传感的三维折叠μPAD平台，用于ALP和BChE的同时可视化POCT。该平台显示出许多优点，所提出的具有独特优势的三维折叠μPAD将在未来在不同领域(例如临床诊断、个性化医疗、环境分析和食品监测)中找到广泛而出色的应用，尤其是在应用资源有限的情况下可进行POCT。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种可视化现场即时检测平台，其特征是，所述检测平台包括用于同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的3D折叠比率荧光微流控装置和/或用于同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的检测系统；
所述3D折叠比率荧光微流控装置采用黑色油性马克笔和定制的金属模具一步绘图制作，由四层和两个平行通道组成；所述四层通道为矩形通道，每两层通道之间可折叠；第一层矩形通道包括中央样品区和I形路径，所述中央样品区位于I形路径中部，所述I形路径两端为圆形区域；与第一层矩形通道相邻的第二层矩形通道包括所述I形路径；第三层和第四层矩形通道分别在两端设置有圆形区域，该圆形区域与第一层、第二层矩形通道中的圆形区域相对应；
所述微流控装置中的四层矩形通道一侧的四个圆形区域命名为A通道，A通道按照从第一层矩形通道到第四层矩形通道的方向依次装载有PPi、Cu2+、OPD和CDs；另一侧的四个圆形区域命名为B通道，B通道按照从第一层矩形通道到第四层矩形通道的方向依次装载有BTCh、Cu2+、OPD和CDs；A通道：装载有PPi的圆形区域中还含有Mg2+；B通道：所述BTCh的浓度为0.05-0.2M，所述BTCh的体积为2-8μL。
2.如权利要求1所述的可视化现场即时检测平台，其特征是，A通道：
所述PPi的浓度为3-8mM，所述PPi的体积为2-8μL；
所述Mg2+的浓度为0.05-0.2mM；
所述Cu2+的浓度为0.2-1.0mM，所述Cu2+的体积为2-10μL；
所述OPD的浓度为0.05-0.2M，所述OPD的体积为2-10μL；
所述CDs的浓度为1-5mg ml-1，所述CDs的体积为2-10μL。
3.如权利要求2所述的可视化现场即时检测平台，其特征是，所述PPi的浓度为5mM，所述PPi的体积为5μL；
所述Mg2+的浓度为0.1mM；
所述Cu2+的浓度为0.6mM，所述Cu2+的体积为5μL；
所述OPD的浓度为0.1M，所述OPD的体积为5μL；
所述CDs的浓度为3mg ml-1，所述CDs的体积为5μL。
4.如权利要求1所述的可视化现场即时检测平台，其特征是，B通道：
所述BTCh的浓度为0.1M，所述BTCh的体积为5μL；
所述Cu2+的浓度为2-8mM，所述Cu2+的体积为2-10μL；
所述OPD的浓度为0.05-0.2M，所述OPD的体积为2-10μL；
所述CDs的浓度为5-15mg ml-1，所述CDs的体积为2-10μL。
5.如权利要求4所述的可视化现场即时检测平台，其特征是，所述Cu2+的浓度为4mM，所述Cu2+的体积为5μL；
所述OPD的浓度为0.1M，所述OPD的体积为5μL；
所述CDs的浓度为10mg ml-1，所述CDs的体积为5μL。
6.如权利要求1所述的可视化现场即时检测平台，其特征是，所述CDs的制备方法包括：将原料和水置于高压釜中，在180-200℃下加热反应8-15h，将得到的产物进行过滤、透析获得碳点。
7.如权利要求6所述的可视化现场即时检测平台，其特征是，所述原料为茄子、花生、包菜、黄瓜、猕猴桃、韭菜、空心菜、玉米粒；所述过滤以0.22μm膜进行过滤，收集滤液；用透析袋将滤液透析2-4天，得到的溶液再经过0.22μm膜过滤后冷却干燥，最后，将获得的碳点重新溶解在水中，备用。
8.如权利要求7所述的可视化现场即时检测平台，其特征是，所述原料为茄子。
9.如权利要求1所述的可视化现场即时检测平台，其特征是，所述微流控装置中，所述I形路径中的圆形区域的直径为3-15mm；或，所述I形路径中两个圆形区域中间的连接路径长度为4-20mm，宽度为1-10mm；或，每两层通道之间的间距为0-0.8mm；或，所述中央样品区的直径为4-20mm。
10.一种同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的检测方法，其特征是，所述检测方法基于权利要求1-9任一所述的可视化现场即时检测平台。
11.如权利要求10所述的一种同时检测碱性磷酸酶和丁酰胆碱酯酶的检测方法，其特征是，所述检测方法包括：在第一层矩形通道的中央样品区滴加不同浓度的ALP和BchE标准溶液或人血清样品，进行孵育；然后，将第二层矩形通道折叠到第一层矩形通道上并滴加缓冲液将底物和酶产物带到第二层，继续孵育；随后，将第一层矩形通道展开，将第三层矩形通道折叠到第二层矩形通道上，并加入缓冲液使游离的Cu2+与OPD反应；最后，将第四次矩形通道折叠到第三层矩形通道；在紫外线灯下，拍摄荧光图片，并通过颜色识别器进行定量分析。
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