CN106996929A - 集成化的电化学发光纸质微流控芯片及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种集成化的电化学发光纸质微流控芯片及其制备方法与应用该芯片进行乙肝表面抗原检测的方法。纸质微流控芯片的制作方法包括：制备电极层；在纸上制备纸通道层，并在抗体包埋区和检测区固定抗体，以及在样品区表面覆盖滤血膜，以实现纸通道层的功能化；采用热压技术制备自上而下包含上密封层、纸通道层、电极层和下密封层的电化学发光纸质微流控芯片。应用该芯片进行乙肝表面抗原检测的方法包括：将全血样品滴于加样区，样品在流动过程中发生免疫反应，清洗，置于电化学发光检测仪中进行检测。本发明具有功能丰富、检测灵敏度高、使用简单方便和成本低，集样品前处理、混合、反应和检测于一体的优点，可广泛应用于医学检测领域。

Description

集成化的电化学发光纸质微流控芯片及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于医学检测领域，涉及一种集成化的电化学发光纸质微流控芯片及该芯片的制备方法，还涉及应用该芯片进行乙肝表面抗原检测的方法。
背景技术
乙肝表面抗原(HBsAg)检测是临床诊断乙型肝炎的一项重要指标，目前常用酶联免疫法和罗氏电化学发光检测系统对其进行检测。酶联免疫法操作繁琐、无法进行定量检测，不适用于实时快速检测；而罗氏电化学发光检测系统存在设备体积庞大、价格高昂的局限性，不适用于现场即时检测和广泛推广使用。因此，急需一种检测灵敏度高，同时操作简单、检测仪器便于携带的新型检测方法。
纸质微流控芯片(paper-based microfluidic analytical devices，μPADs)是一种新兴的微流控分析技术平台，它以纸张作为基底材料，通过各种加工修饰方法，在纸上形成具有一定构造的亲/疏水微细通道网络，并与相关的分析仪器共同组成“纸上微型实验室”(lab on paper)，可应用于量小、复杂液体样品的高效、快速检测，具有操作简便、储存运输方便、价格低廉、易于修饰等优良特性，适用于临床诊断及现场即时检测。
纸质微流控芯片的图案通道形成方法有紫外光刻、喷墨打印、喷墨溶剂刻蚀、等离子体处理、绘图、丝网印刷、柔印、激光处理、融蜡浸透及蜡打印等，其中蜡打印的方法最为简便，适用于大规模的纸质微流控芯片制造。纸质微流控芯片的检测方法有比色法、化学发光法、电化学法、荧光法等。Kubota等人应用电化学法在纸芯片上进行维生素C和尿酸的检测，但是该检测技术灵敏度不高、特异性较差，不适用于免疫检测。Liu Zhihong等人设计了基于荧光检测的纸质微流控芯片，但是荧光检测需要外加光源，背景干扰较大，而且荧光试剂易发生淬灭。
电化学发光(Electrochemiluminescence，ECL)是指直接利用电化学反应形成激发态发光体来发光或通过电解产物之间、电解产物与体系中某组分之间进行化学反应产生光辐射而实现分析物测定的发光分析技术，是电化学分析与化学发光分析相结合的产物。与其它检测方法相比，电化学发光检测以其自动、快速、特异性强、灵敏度高和线性检测范围宽等优点展示出良好的应用前景。于京华课题组首次将电化学发光检测与纸质微流控芯片相结合，制备了基于电化学发光检测的三维纸芯片，实现了肿瘤标志物的检测，但其在实际应用方面还是存在一定局限性，该纸芯片纸通道的构造较为简单，仍需要手工进行样品的分离、试剂的滴加、洗涤分离等步骤，操作繁琐、耗时，不利于广泛应用。
为提高检测灵敏度、简化操作流程，制备一种可用于临床诊断和现场即时检测的纸质微流控芯片，本发明将电化学发光检测技术与微流控技术相结合，制备了一种集成化的电化学发光纸质微流控芯片。通过纸通道的优化设计和各区抗体的固定，本发明将样品前处理、混合、反应和检测等步骤集成于一张纸质微流控芯片，整个检测过程只需加入样品和清洗液，无需人工加入各种反应试剂，实现了全血样品中乙肝表面抗原的分离、传输和检测。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于：提供一种功能丰富、检测灵敏度高、使用简单方便和成本低的，集样品前处理、混合、反应和检测于一体的，集成化的电化学发光纸质微流控芯片。
本发明的第二目的在于：提供一种功能丰富、检测灵敏度高、使用简单方便和成本低的，集样品前处理、混合、反应和检测于一体的，集成化的电化学发光纸质微流控芯片的制备方法。
本发明的第三目的在于：提供一种功能丰富、检测灵敏度高、使用简单方便和成本低的，集样品前处理、混合、反应和检测于一体的，用于乙肝表面抗原检测的纸质微流控芯片的实现方法。
本发明所采取的第一技术方案是：
一种集成化的电化学发光纸质微流控芯片，包括自上而下分布的上密封层、纸通道层、电极层和下密封层，所述纸通道层集样品前处理、混合、反应和检测于一体。
进一步，所述纸通道层包括样品区、侧向免疫层析通道、抗体包埋区、检测区和废液区，所述样品区上覆盖有滤血膜，所述侧向免疫层析通道的前端与样品区连接，所述抗体包埋区位于侧向免疫层析通道的近样品区端，所述检测区与侧向免疫层析通道的末端连接，所述废液区位于检测区的末端和侧向免疫层析通道两侧。
进一步，所述电极层包括工作电极、对电极和参比电极，所述工作电极、对电极和参比电极位于检测区的下方并为检测区提供电化学发光反应所需的电压；所述上密封层设有正对着样品区的加样区和正对着检测区的检测口。
本发明所采取的第二技术方案是：
一种集成化的电化学发光纸质微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
制备电极层；
在纸上制备纸通道层，并在抗体包埋区和检测区固定抗体，以及在样品区表面覆盖滤血膜，以实现纸通道层的功能化；
采用热压技术制备自上而下包含上密封层、纸通道层、电极层和下密封层的电化学发光纸质微流控芯片。
进一步，所述制备电极层这一步骤采用了丝网印刷技术及超疏水膜修饰技术来制备电极层；所述在抗体包埋区和检测区固定抗体这一步骤，分别采用了包埋的方法在抗体包埋区进行抗体包埋和自组装的方法在检测区进行抗体固定。
进一步，所述在纸上制备纸通道层这一步骤，其具体为：使用CorelDRAW X6软件设计纸通道层结构，然后以Whatman 1号层析纸作为基底材料，使用喷蜡打印机打印出纸通道。
本发明所采取的第三技术方案是：
应用集成化的电化学发光纸质微流控芯片进行乙肝表面抗原检测的方法，包括以下步骤：
将全血样品滴加于纸质微流控芯片的加样区，通过滤血膜对滴入的全血样品进行血细胞的过滤，得到分离血细胞后的样品；
分离血细胞后的样品在流动的过程中发生免疫反应，使得分离血细胞后的样品中的乙肝表面抗原最终在检测区形成双抗体夹心复合物；
在加样区加入三丙胺清洗液，使得三丙胺清洗液流经检测区时洗去未结合的抗体和蛋白，同时使得三丙胺作为共反应物参与电化学发光反应；
将纸质微流控芯片置于电化学发光检测仪中进行检测，得到相应的乙肝表面抗原响应曲线，并根据乙肝表面抗原响应曲线和预先建立的乙肝表面抗原工作曲线计算全血样品中乙肝表面抗原的浓度。
进一步，所述分离血细胞后的样品在流动的过程中发生免疫反应，使得分离血细胞后的样品中的乙肝表面抗原最终在检测区形成双抗体夹心复合物这一步骤，其包括：
分离血细胞后的样品在毛细管作用力下沿侧向免疫层析通道流动；
分离血细胞后的样品在流经三联吡啶钌标记的乙肝表面抗体包埋区时，溶解包埋的乙肝表面抗体并在流动的过程中与之发生免疫反应，得到抗原-抗体复合物；
抗原-抗体复合物在流过检测区时，被自组装固定于检测区的抗乙肝表面抗原捕获抗体捕获，形成双抗体夹心复合物。
进一步，所述的三丙胺清洗液由磷酸盐缓冲液、三丙胺、去垢剂和防腐剂组成，pH＝6.8。
进一步，所述的乙肝表面抗原响应曲线为反映电化学发光强度与时间关系的曲线，所述的乙肝表面抗原工作曲线是反映电化学发光强度的峰面积与乙肝表面抗原浓度关系的曲线，所述预先建立的乙肝表面抗原工作曲线所采用的线性拟合公式为：y＝2.95126+0.38073x，其中，y为发光强度的峰面积值以10为底时的对数值，x为乙肝表面抗原的浓度以10为底时的对数值。
本发明的芯片的有益效果是：包括自上而下分布的上密封层、纸通道层、电极层和下密封层，纸通道层集样品前处理、混合、反应和检测于一体，将样品前处理、免疫反应和电化学发光检测功能集成于一张纸芯片，功能更丰富，且能通过电化学发光法进行乙肝表面抗原定量检测，检测灵敏度高、使用简单方便和成本低。
本发明的制备方法的有益效果是：包括制备电极层，在纸上制备纸通道层，并在抗体包埋区和检测区固定抗体，以及在样品区表面覆盖滤血膜，采用热压技术制备自上而下包含上密封层、纸通道层、电极层和下密封层的电化学发光纸质微流控芯片的步骤，通过制备将样品前处理、免疫反应和电化学发光检测功能集成于一张纸芯片，功能更丰富，且能通过电化学发光法进行乙肝表面抗原定量检测，检测灵敏度高、使用简单方便和成本低。
本发明的乙肝表面抗原检测的方法的有益效果是：包括通过滤血膜对滴入的全血样品进行血细胞的过滤，分离血细胞后的样品在流动的过程中发生免疫反应，在加样区加入三丙胺清洗液，以及置于电化学发光检测仪中进行检测的步骤，基于侧向免疫层析和双抗体夹心法原理，将样品前处理、混合反应和检测步骤集成于一张芯片上完成，实现了全血样品中乙肝表面抗原HBsAg的分离、传输和检测，功能更丰富；包括置于电化学发光检测仪中进行检测的步骤，能通过电化学发光法定量检测出全血样品中乙肝表面抗原的浓度，检测灵敏度高、使用简单方便和成本低。
附图说明
图1为本发明一种集成化的电化学发光纸质微流控芯片的整体结构示意图；
图2为本发明一种集成化的电化学发光纸质微流控芯片的各层结构的分解图；
图3为本发明一种集成化的电化学发光纸质微流控芯片的制备方法的整体流程图；
图4为本发明应用集成化的电化学发光纸质微流控芯片进行乙肝表面抗原检测的方法的实现方法的整体流程图；
图5为本发明实施例一乙肝表面抗原响应曲线的示意图；
图6为本发明实施例一乙肝表面抗原工作曲线的两种表示方式示意图。
具体实施方式
参照图1和图2，一种集成化的电化学发光纸质微流控芯片，包括自上而下分布的上密封层C、纸通道层B、电极层A和下密封层D，所述纸通道层B集样品前处理、混合、反应和检测于一体。
参照图1和图2，进一步作为优选的实施方式，所述纸通道层B包括样品区1、侧向免疫层析通道2、抗体包埋区3、检测区4和废液区5，所述样品区1上覆盖有滤血膜6，所述侧向免疫层析通道2的前端与样品区1连接，所述抗体包埋区3位于侧向免疫层析通道2的近样品区端，所述检测区4与侧向免疫层析通道2的末端连接，所述废液区5位于检测区4的末端和侧向免疫层析通道2两侧。
参照图1和图2，所述电极层A包括工作电极A1、对电极A2和参比电极A3，所述工作电极A1、对电极A2和参比电极A3位于检测区4的下方并为检测区4提供电化学发光反应的电压；所述上密封层C设有正对着样品区1的加样区7和正对着检测区4的检测口8。
参照图3，一种集成化的电化学发光纸质微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
制备电极层；
在纸上制备纸通道层，并在抗体包埋区和检测区固定抗体，以及在样品区表面覆盖滤血膜，以实现纸通道层的功能化；
采用热压技术制备自上而下包含上密封层、纸通道层、电极层和下密封层的电化学发光纸质微流控芯片。
进一步作为优选的实施方式，所述制备电极层这一步骤采用了丝网印刷技术及超疏水膜修饰技术来制备电极层；所述在抗体包埋区和检测区固定抗体这一步骤，分别采用了包埋的方法在抗体包埋区进行抗体包埋和自组装的方法在检测区进行抗体固定。
进一步作为优选的实施方式，所述在纸上制备纸通道层这一步骤，其具体为：使用CorelDRAW X6软件设计纸通道层结构，然后以Whatman 1号层析纸作为基底材料，使用喷蜡打印机打印出纸通道。
参照图4，应用集成化的电化学发光纸质微流控芯片进行乙肝表面抗原检测的方法，包括以下步骤：
将全血样品滴加于纸质微流控芯片的加样区，通过滤血膜对滴入的全血样品进行血细胞的过滤，得到分离血细胞后的样品；
分离血细胞后的样品在流动的过程中发生免疫反应，使得分离血细胞后的样品中的乙肝表面抗原最终在检测区形成双抗体夹心复合物；
在加样区加入三丙胺清洗液，使得三丙胺清洗液流经检测区时洗去未结合的抗体和蛋白，同时使得三丙胺作为共反应物参与电化学发光反应；
将纸质微流控芯片置于电化学发光检测仪中进行检测，得到相应的乙肝表面抗原响应曲线，并根据乙肝表面抗原响应曲线和预先建立的乙肝表面抗原工作曲线计算全血样品中乙肝表面抗原的浓度。
进一步作为优选的实施方式，所述分离血细胞后的样品在流动的过程中发生免疫反应，使得分离血细胞后的样品中的乙肝表面抗原最终在检测区形成双抗体夹心复合物这一步骤，其包括：
分离血细胞后的样品在毛细管作用力下沿侧向免疫层析通道流动；
分离血细胞后的样品在流经三联吡啶钌标记的乙肝表面抗体包埋区时，溶解包埋的乙肝表面抗体并在流动的过程中与之发生免疫反应，得到抗原-抗体复合物；
抗原-抗体复合物在流过检测区时，被自组装固定于检测区的抗乙肝表面抗原捕获抗体捕获，形成双抗体夹心复合物。
进一步，所述的三丙胺清洗液由磷酸盐缓冲液、三丙胺、去垢剂和防腐剂组成，pH＝6.8。
进一步作为优选的实施方式，所述的乙肝表面抗原响应曲线为反映电化学发光强度与时间关系的曲线，所述的乙肝表面抗原工作曲线是反映电化学发光强度的峰面积与乙肝表面抗原浓度关系的曲线，所述预先建立的乙肝表面抗原工作曲线所采用的线性拟合公式为：y＝2.95126+0.38073x，其中，y为发光强度的峰面积值以10为底时的对数值，x为乙肝表面抗原的浓度以10为底时的对数值。
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步解释和说明。
实施例一
针对现有技术缺乏一种使用简单方便、耗时短，能够实现现场快速检测的电化学发光纸质微流控芯片来进行乙肝表面抗原检测的问题，本发明提出了基于一种集成化电化学发光纸质微流控芯片及其制备方法和应用该芯片来进行乙肝表面抗原检测的方法，实现了将样品前处理、混合、免疫反应和电化学发光检测等步骤集成于一张纸质微流控芯片的功能，并且具有检测灵敏度高、使用简单方便和成本低的特点。下面从纸质微流控芯片的结构与制备、乙肝表面抗原检测方法和具体实施效果对本发明的实现原理和过程进行详细说明：
(一)纸质微流控芯片的结构和制备
如图2所示，该纸质微流控芯片由电极层A、纸通道层B、上密封层C和下密封层D组成。
如图2中A所示，电极层A包含工作电极A1、对电极A2和参比电极A3，用于提供电化学发光反应的电压。电极层A采用丝网印刷技术及超疏水膜修饰技术制备，具体制备方法如下：使用CorelDRAW X6软件设计如图2中A所示的电极层；然后将设计好的电极印制在纸芯片上，印制时导电层和参比电极A3浆料均采用现有的导电银浆，绝缘层浆料采用现有的绝缘浆并对其进行超疏水化处理，对电极A2浆料采用现有的导电碳浆，工作电极A1采用掺杂有纳米颗粒的自行设计的导电碳浆。
如图2中B所示，纸通道层B由样品区1、侧向免疫层析通道2、三联吡啶钌Ru(bpy)3 2+标记的乙肝表面抗体包埋区3、检测区4和废液区5这五部分组成。纸通道层的具体制备方法如下：使用CorelDRAW X6软件设计纸通道层结构，然后以Whatman 1号层析纸作为基底材料，使用喷蜡打印机打印出如图2中B所示的纸通道层(图2中B的疏水区用黑色表示，亲水区用白色表示)；接着，将完成打印的层析纸放置在125℃的加热台上加热1min，使表面蜡层渗透到层析纸内，并在样品区1的表面覆盖一层滤血膜6，以过滤血细胞，使得本发明可直接用于全血样品的检测而无需额外的血细胞分离过程。本发明侧向免疫层析通道2的宽为2mm，长为35mm，可以延长层析的时间，实现抗原-抗体的充分结合。Ru(bpy)3 2+标记的乙肝表面抗体包埋于侧向免疫层析通道2的近样品区端，当样品流经该区域时，抗体迅速溶解并在层析过程中与乙肝表面抗原充分结合。抗乙肝表面抗原捕获抗体通过自组装技术(如分子交联法等)稳定固定于检测区4，乙肝表面抗原-标记抗体复合物流经该区时被捕获抗体捕获，由电极层A施加电压后，在三丙胺的共同作用下，发生电化学发光反应。废液区5位于检测区4的末端和侧向免疫层析通道2两侧，用于提供液体在纸表面层析的驱动力同时储存废液。
上密封层C和下密封层D，用于有效减少样品和试剂的蒸发、防止污染。如图2中C所示，上密封层C采用透明密封材料的盖片，留有为样品区1添加样品的加样区7以及用于进行观察和电化学发光检测的检测口8。如图2中D所示，下密封层D以透明密封材料的衬底片作为密封层。
(二)乙肝表面抗原的检测方法
本发明基于侧向免疫层析原理，应用双抗体夹心法，通过三联吡啶钌-三丙胺(即Ru(bpy)3 2+-TPA)电化学发光法来检测全血样品9中的乙肝表面抗原浓度。参照图1、2和4，本发明检测乙肝表面抗原的具体过程为：首先将100微升全血样品9滴入纸质微流控芯片的加样区7；然后通过滤血膜6对滴入的全血样品9进行过滤；接着，经滤血膜6分离血细胞后的样品在毛细管作用力下沿侧向免疫层析通道2流动；当分离血细胞后的样品流经Ru(bpy)3 2+标记的乙肝表面抗体包埋区3时，Ru(bpy)3 2+标记的乙肝表面抗体迅速溶解并与样品中的乙肝表面抗原发生免疫反应，结合形成抗原-抗体复合物；抗原-抗体复合物沿着纸通道水平方向(即图1中的水平箭头方向)进行侧向移动；抗原-抗体复合物移动至检测区4时，被预先通过自组装固定于该区的抗乙肝表面抗原捕获抗体捕获形成双抗体夹心复合物；反应12min后，在加样区7加入200微升三丙胺清洗液(该三丙胺清洗液由磷酸盐缓冲液、三丙胺、去垢剂和防腐剂组成，pH＝6.8，例如采用磷酸盐缓冲液300mmol/L、三丙胺180mmol/L和去垢剂≦0.1％制成的三丙胺清洗液)，充分洗涤；3min后，将纸质微流控芯片置于电化学发光检测仪中进行检测(纸质微流控芯片的检测区4需置于光电倍增管的检测范围内)；然后采用Origin 6.0软件对通过光电倍增管得到的峰型图进行分析并计算峰面积，最后根据预先建立的电化学发光纸质微流控芯片检测乙肝表面抗原的工作曲线计算样品中乙肝表面抗原HBsAg的浓度。电化学发光反应过程的发光强度的峰面积与三联吡啶钌的浓度呈线性关系，故通过光电倍增管检测出光强度后，即可通过建模和曲线拟合法测出全血样品中乙肝表面抗原的浓度。
(三)具体实施效果
应用(一)的芯片和(二)的方法进行乙肝表面抗原检测，可得到如图5所示的乙肝表面抗原响应曲线，其中，应用电化学发光纸质微流控芯片检测乙肝表面抗原的最小检测限为0.020ng/ml。从图5可知，对于0.2025ng/ml阳性样品的乙肝表面抗原来说，其峰高值为1450，噪声值为50；而对于阴性样品来说，其一直稳定在100附近即峰高值为100，噪声值为50。故可以根据峰高值的大小来区分阳性样品和阴性样品。
电化学发光纸质微流控芯片检测乙肝表面抗原工作曲线则分别如图6(a)和图6(b)所示。其中，图6(a)是反映电化学发光强度峰面积的对数值与乙肝表面抗原浓度关系的曲线。而图6(b)则反映了电化学发光强度峰面积的对数值y与乙肝表面抗原浓度的对数值x间呈良好的线性关系：y＝2.95126+0.38073x，r2＝0.99157。
而应用本发明的电化学发光纸质微流控芯片对同一乙肝表面抗原阳性样品进行了八次重复检测，其CV值(标准差与均值的比率，反映了单位均值上的离散程度)如下表1所示：
表1 HBsAg检测重复性实验结果
本实施例具有以下优点：
(1)本实施例设计并制备了可用于电化学发光法检测乙肝表面抗原的纸质微流控芯片，该芯片以纸质为基底，综合采用了蜡打印技术、抗体定区固定技术和微流控技术，将样品前处理、混合、反应和检测等步骤集成于一张纸质微流控芯片，整个检测过程只需加入样品和清洗液，无需人工加入各种反应试剂，实现了全血样品中乙肝表面抗原的分离、传输和检测；该芯片还将电极层、纸通道层、密封层集成于一体，成本低廉、操作简单、使用方便，可以实现现场实时快速检测。
(2)本实施例通过电化学发光法进行乙肝表面抗原定量检测，检测灵敏度高，克服了传统检测方法灵敏度低、特异性差、定量不精确的局限性。
(3)本实施例的纸质微流控芯片在样品区的表面覆盖了一层滤血膜，以过滤血细胞，使得本发明可直接用于全血样品的检测而无需额外的血细胞分离过程。
(4)本实施例的纸质微流控芯片设计有上下密封层，可以有效减少样品和试剂的蒸发、防止污染。
(5)本实施例建立了乙肝表面抗原工作曲线，经过校准后可用于样品中乙肝表面抗原的定量检测。
与现有技术相比，本发明将样品前处理、混合、反应和检测等步骤集成在一张纸质微流控芯片上，实现了全血样品中乙肝表面抗原的分离、传输和检测，只需加入全血样品，15min后即可完成检测，使用简单方便；采用电化学发光法作为检测手段，检测灵敏度高，反应可控。
以上是对本发明的较佳实施进行了具体说明，但本发明并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可做作出种种的等同变形或替换，这些等同的变形或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.一种集成化的电化学发光纸质微流控芯片，其特征在于：包括自上而下分布的上密封层、纸通道层、电极层和下密封层，所述纸通道层集样品前处理、混合、反应和检测于一体。
2.根据权利要求1所述的一种集成化的电化学发光纸质微流控芯片，其特征在于：所述纸通道层包括样品区、侧向免疫层析通道、抗体包埋区、检测区和废液区，所述样品区上覆盖有滤血膜，所述侧向免疫层析通道的前端与样品区连接，所述抗体包埋区位于侧向免疫层析通道的近样品区端，所述检测区与侧向免疫层析通道的末端连接，所述废液区位于检测区的末端和侧向免疫层析通道两侧。
3.根据权利要求2所述的一种集成化的电化学发光纸质微流控芯片，其特征在于：所述电极层包括工作电极、对电极和参比电极，所述工作电极、对电极和参比电极位于检测区的下方并为检测区提供电化学发光反应所需的电压；所述上密封层设有正对着样品区的加样区和正对着检测区的检测口。
4.一种集成化的电化学发光纸质微流控芯片的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
制备电极层；
在纸上制备纸通道层，并在抗体包埋区和检测区固定抗体，以及在样品区表面覆盖滤血膜，以实现纸通道层的功能化；
采用热压技术制备自上而下包含上密封层、纸通道层、电极层和下密封层的电化学发光纸质微流控芯片。
5.根据权利要求4所述的一种集成化的电化学发光纸质微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述制备电极层这一步骤采用了丝网印刷技术及超疏水膜修饰技术来制备电极层；所述在抗体包埋区和检测区固定抗体这一步骤，分别采用了包埋的方法在抗体包埋区进行抗体包埋和自组装的方法在检测区进行抗体固定。
6.根据权利要求4所述的一种集成化的电化学发光纸质微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述在纸上制备纸通道层这一步骤，其具体为：使用CorelDRAW X6软件设计纸通道层结构，然后以Whatman 1号层析纸作为基底材料，使用喷蜡打印机打印出纸通道。
7.应用集成化的电化学发光纸质微流控芯片进行乙肝表面抗原检测的方法，其特征在于：包括以下步骤：
将全血样品滴加于纸质微流控芯片的加样区，通过滤血膜对滴入的全血样品进行血细胞的过滤，得到分离血细胞后的样品；
分离血细胞后的样品在流动的过程中发生免疫反应，使得分离血细胞后的样品中的乙肝表面抗原最终在检测区形成双抗体夹心复合物；
在加样区加入三丙胺清洗液，使得三丙胺清洗液流经检测区时洗去未结合的抗体和蛋白，同时使得三丙胺作为共反应物参与电化学发光反应；
将纸质微流控芯片置于电化学发光检测仪中进行检测，得到相应的乙肝表面抗原响应曲线，并根据乙肝表面抗原响应曲线和预先建立的乙肝表面抗原工作曲线计算全血样品中乙肝表面抗原的浓度。
8.根据权利要求7所述的应用集成化的电化学发光纸质微流控芯片进行乙肝表面抗原检测的方法，其特征在于：所述分离血细胞后的样品在流动的过程中发生免疫反应，使得分离血细胞后的样品中的乙肝表面抗原最终在检测区形成双抗体夹心复合物这一步骤，其包括：
分离血细胞后的样品在毛细管作用力下沿侧向免疫层析通道流动；
分离血细胞后的样品在流经三联吡啶钌标记的乙肝表面抗体包埋区时，溶解包埋的乙肝表面抗体并在流动的过程中与之发生免疫反应，得到抗原-抗体复合物；
抗原-抗体复合物在流过检测区时，被自组装固定于检测区的抗乙肝表面抗原捕获抗体捕获，形成双抗体夹心复合物。
9.根据权利要求7所述的应用集成化的电化学发光纸质微流控芯片进行乙肝表面抗原检测的方法，其特征在于：所述的三丙胺清洗液由磷酸盐缓冲液、三丙胺、去垢剂和防腐剂组成，pH=6.8。
10.根据权利要求7、8或9所述的应用集成化的电化学发光纸质微流控芯片进行乙肝表面抗原检测的方法，其特征在于：所述的乙肝表面抗原响应曲线为反映电化学发光强度与时间关系的曲线，所述的乙肝表面抗原工作曲线是反映电化学发光强度的峰面积与乙肝表面抗原浓度关系的曲线，所述预先建立的乙肝表面抗原工作曲线所采用的线性拟合公式为：y= 2.95126+0.38073x，其中，y为发光强度的峰面积值以10为底时的对数值，x为乙肝表面抗原的浓度以10为底时的对数值。
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