CN114011480A - 一种电化学发光微流控检测芯片及用于蛋白检测的试剂盒 - Google Patents

一种电化学发光微流控检测芯片及用于蛋白检测的试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN114011480A
CN114011480A CN202111301615.4A CN202111301615A CN114011480A CN 114011480 A CN114011480 A CN 114011480A CN 202111301615 A CN202111301615 A CN 202111301615A CN 114011480 A CN114011480 A CN 114011480A
Authority
CN
China
Prior art keywords
chip
electrochemiluminescence
sided adhesive
detection
flow channel
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111301615.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114011480B (zh
Inventor
方雪恩
刘丽玲
熊桧文
王耀华
范斌
朱晨鑫
孔继烈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Superchip Biotechnology Co ltd
Shanghai Igenetec Diagnostics Co ltd
Original Assignee
Shanghai Superchip Biotechnology Co ltd
Shanghai Igenetec Diagnostics Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Superchip Biotechnology Co ltd, Shanghai Igenetec Diagnostics Co ltd filed Critical Shanghai Superchip Biotechnology Co ltd
Priority to CN202111301615.4A priority Critical patent/CN114011480B/zh
Publication of CN114011480A publication Critical patent/CN114011480A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114011480B publication Critical patent/CN114011480B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/305—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells optically transparent or photoresponsive electrodes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明公开了一种电化学发光微流控检测芯片及用于蛋白检测的试剂盒。本发明提供了一种电化学发光微流控检测芯片，包含叠置的芯片上盖、单面胶电极层、双面胶流道层和芯片下盖；芯片上盖包含加样区；芯片下盖设有凹槽及开口槽；单面胶电极层包含单面胶层加样区，单面胶电极层在与芯片上盖接触的一侧表面设置有胶层，在与双面胶流道层接触的一侧表面设置有多个电极，电极包括工作部分及导出部分；双面胶流道层包含样本流动通道及开槽，开槽位于样本流动通道的末端处；样本流动通道包括加样孔区、流道检测区和废液槽区。本发明提供的电化学发光微流控检测芯片适于超高灵敏度、精密度的即时检验。

Description

一种电化学发光微流控检测芯片及用于蛋白检测的试剂盒
技术领域
本发明属于电化学发光检测技术领域，涉及一种电化学发光微流控检测芯片及用于蛋白检测的试剂盒。
背景技术
心肌肌钙蛋白(Cardiac Troponin,cTn)是目前诊断心肌梗死(Acute MyocardiacInfarction，AMI)和对急性冠状动脉综合征(ACS)危险分层的黄金标志物。传统的cTn检测方法灵敏度、精密度相对不高，难以被检测发现，基本无法在表面健康人群中检测出来，在缺血症状或心电图改变不典型时，这有可能导致延迟诊断甚至误诊，不利于早期诊断、风险评估和预后判断。
根据《高敏感方法检测心肌肌钙蛋白临床应用中国专家共识》中提到，高敏心肌肌钙蛋白(hs-cTn)的定义需要满足2个条件：①正常人群的第99百分位值处的变异系数＜10％；②在健康人群中，低于第99百分位值的检出率要超过50％(最佳状态＞50％)。hs-cTn需要更高的灵敏度和精密度。传统心肌肌钙蛋白免疫分析的灵敏度只能达到100ng/mL(μg/L)左右的级别，而高敏免疫分析的灵敏度需要高达10ng/L甚至更低。目前市场上已有多种检测心肌肌钙蛋白的诊断试剂。从技术上来看，主要有免疫层析法、酶联免疫法、化学发光法和电化学发光法等为主的技术平台。其中免疫层析法难以克服其本身基材的固有缺陷，如硝酸纤维素膜对蛋白固定能力有限、手工组装步骤繁琐等因素带来的人为误差导致精密度较大、灵敏度较低等缺点，在实际临床检验中存在很多问题。酶联免疫法成熟度较高，但操作复杂、检测时间长，对操作者有一定技术要求，该方法逐渐被取代。化学发光法和电化学发光法的优点是定量精确，灵敏度和特异性高，检测范围宽，便于实现高通量自动化，是中心实验室最常用的检测方法，但这种检测仪器昂贵，且占地比较大，不适用于在急诊、ICU、胸痛中心等科室的使用。
专利文献1：CN106807461A公开一种用于荧光免疫检测的微流控芯片及其制备方法，其包括芯片基板，基板上开设微流控通道，微流控通道包括依次连通的样本滴加区、全血过滤区、抗体包被区、反应区、检测区、质控区和废液收集区，全血过滤区设有红细胞滤血膜。检测时，在离心力驱动下，全血样本经过过滤区去除血细胞随后进行检测。该方案一方面全血过滤膜分离时会带来检测干扰和样本浪费，另一方面蛇形管道状的反应区很容易残留样本，对检测灵敏度产生不利的影响。此外，直接在基板上开设通道的制备方法加工成本较高，且单纯用离心力控制液体可能液体流速过快，不利于层析反应的进行。
专利文献2：CN108414769A公开了一种用于心衰标志物检测的蛋白芯片，蛋白芯片的制备方法包括(1)黑玻片预处理；(2)抗体溶液点样；(3)封闭工艺制得所述蛋白芯片。该发明实现联合检测心肌标志物芯片诊断试剂盒。黑玻片要在NaOH预处理液中浸泡16～24h，纯化水清洗2～8次，再硅烷水溶液中浸泡20～60min。处理工序非常复杂，费时费工，产生大量废水，不利于环保。且处理批次之间差异大，不利于批量化生产，同时也导致了芯片生产成本较高。
专利文献3：CN105259162A公开了一种定量检测全血中脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片，其由顶部胶带、芯片基板和底部胶带构成，其中芯片基板上的过滤区、磁颗粒标记BNP抗体包被区、反应区、清洗区、检测区、流体释放通道依次连接。该方法中采用抗体修饰的磁颗粒，制备方法相对复杂，微流控芯片在检测中需要设备电磁铁牵引芯片中磁颗粒运动，对设备复杂性要求高。此外，过滤区包含滤血膜，也会存在检测干扰和样本浪费等问题。
专利文献4：CN110773246A公开了一种微流控芯片及用于高敏肌钙蛋白检测的试剂盒，所述微流控芯片包含叠置的三层，所述芯片上层包含加样区，芯片下层设有凹槽，芯片中间层为双面胶层，在所述双面胶层上用有胶区和无胶区分隔出样本流动通道，所述样本流动通道包括流道检测区，所述流道检测区为弧形，所述流道检测区与废液槽区交接的拐弯处流道宽度小于流道检测区流道中间弧形段的宽度。该发明通过微流控技术进一步提升了免疫层析试剂性能，获得了分析灵敏度高和精密度高的高敏肌钙蛋白定量检测系统。该检测系统的最低检测限约为5ng/L，小于第99百分位的参考上限(第99百分位为6ng/L)，线性范围为5～50000ng/L。但在实际临床应用中，高敏肌钙蛋白的检测需要越灵敏的试剂越能更好地把存在风险的接近健康人群体内极低的肌钙蛋白的含量也能测试出来，更精准的诊断AMI、识别更多处于疾病潜在危险的患者，从而大大提高了AMI的检出率；同时，也使得分析评估健康人群cTn水平更加可靠和精准。
发明内容
发明要解决的问题
为了进一步提高例如高敏肌钙蛋白等蛋白的检测试剂的灵敏度，使临床诊断更加精准。本发明提供了一种电化学发光微流控检测芯片，首先，对于微流控技术实现了对检测试剂性能的进一步提升；其次，提供了一种用于可以用于例如高敏肌钙蛋白检测的微流控检测芯片，解决了临床上对例如高敏肌钙蛋白等蛋白的检测需求的痛点问题；再次，提供了超高灵敏度的即时检验(Point-of-care Testing,POCT)电化学发光微流控检测芯片，为进一步开发其他相关需要高灵敏度和高精密度的试剂提供成熟的平台。
用于解决问题的方案
本发明的第一方面提供了一种电化学发光微流控检测芯片，所述电化学发光微流控检测芯片包含叠置的芯片上盖、单面胶电极层、双面胶流道层和芯片下盖；其中，所述芯片上盖包含加样区；所述芯片下盖设有凹槽及开口槽；所述单面胶电极层包含单面胶层加样区，所述单面胶电极层在与所述芯片上盖接触的一侧表面设置有胶层，所述单面胶电极层在与所述双面胶流道层接触的一侧表面设置有多个电极，所述电极包括工作部分及导出部分；所述双面胶流道层包含样本流动通道及开槽，所述开槽位于所述样本流动通道的末端处；所述样本流动通道包括加样孔区、流道检测区和废液槽区，其中，所述加样孔区与所述芯片上盖的加样区及所述单面胶电极层的单面胶层加样区相对应；所述流道检测区与所述单面胶电极层的多个电极的工作部分相对应；所述废液槽区与所述芯片下盖的凹槽至少部分重叠；所述开槽与所述芯片下盖的开口槽相对应，并与所述单面胶电极层的多个电极的导出部分相对应。
在本发明的一些实施方案中，所述单面胶电极层的基底材质为聚氯乙烯。
在本发明的一些优选的实施方案中，所述单面胶电极层的基底材质为黑色的聚氯乙烯。
在本发明的一些实施方案中，所述单面胶电极层与所述芯片上盖接触的一侧表面设置的胶层的材料为聚对苯二甲酸乙二醇酯胶或聚甲基丙烯酸甲酯胶。
在本发明的一些实施方案中，所述电极包括工作电极、参比电极和对电极。
在本发明的一些优选的实施方案中，所述工作电极和所述对电极为碳电极，所述参比电极为银/氯化银电极。
在本发明的一些实施方案中，所述工作电极包括第一工作电极和第二工作电极，所述第一工作电极的工作部分包被有检测抗体，所述第二工作电极的工作部分包被有质控抗体。
在本发明的一些优选的实施方案中，所述工作电极的工作部分经纳米金修饰后包被抗体。
在本发明的一些实施方案中，所述检测抗体特异性识别并结合待测蛋白，所述质控抗体为抗免疫球蛋白抗体。
在本发明的一些实施方案中，所述芯片下盖点样有电化学发光材料探针标记的捕获抗体，点样所述捕获抗体的位置对应于所述双面胶流道层的样本流动通道中流道检测区靠近加样孔区的一端。
在本发明的一些实施方案中，所述捕获抗体特异性识别并结合待测蛋白。
在本发明的一些优选的实施方案中，所述检测抗体与所述捕获抗体特异性识别并结合待测蛋白的不同表位。
在本发明的一些实施方案中，所述电化学发光材料探针选自鲁米诺类探针、钌联吡啶类探针、量子点类探针或金纳米簇探针中的任一种。
在本发明的一些实施方案中，所述电化学发光材料探针修饰在二氧化硅材料上，进而与捕获抗体结合。
本发明的第二方面提供了一种蛋白检测试剂盒，所述试剂盒内包括一个或多个如本发明第一方面所述的电化学发光微流控检测芯片。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括共反应剂和样本稀释液。
在本发明的一些优选的实施方案中，所述样本稀释液中包含质量百分比0.1％-0.5％的曲拉通-100。
发明的效果
本发明优势显而易见。首先，本发明提供的电化学发光微流控检测芯片将电化学发光技术与微流控免疫芯片技术相结合，电化学发光的标记物具有循环参与电化学发光反应的能力，其具有灵敏度高、选择性好、背景信号低、线性范围宽等优点。相较于化学发光法能更有效地进行极低浓度样品检测。最适合用于开发检测对高灵敏度要求的超敏肌钙蛋白试剂。其次，本发明属于POCT的快速诊断系统，相较于市场上成熟的大型电化学发光，具有操作简便、样本需求量小(约20μl样本量)、反应时间短，仅需约10分钟即可得出结果、成本低等优势，尤其更适于高通量的检测。同时，本发明提供的芯片也更适于灵敏度高的便携式PMT进行检测，例如微型PMT，以及适于小型的电化学发光系统进行电化学反应，提高了其检测的便捷性及效率，并进一步提高了其灵敏度，降低了对大型检测设备的需求及设备成本。上述优势使得本发明提供的芯片适用于中小型医院和急诊的需求。顺应了国家倡导的分级诊疗制度，将高尖端检测技术输送进中小型医院成为可能。
附图说明
图1为本发明实施例中提供的电化学发光微流控检测芯片的芯片上盖的结构示意图。
图2为本发明实施例中提供的电化学发光微流控检测芯片的单面胶电极层的结构示意图。
图3为本发明实施例中提供的电化学发光微流控检测芯片的双面胶流道层的结构示意图。
图4为本发明实施例中提供的电化学发光微流控检测芯片的芯片下盖的结构示意图。
图5为本发明实施例中提供的电化学发光微流控检测芯片的四层组合顺序示意图。
图6为本发明实施例中提供的电化学发光微流控检测芯片的芯片整体结构及其给电装置示意图。
图7为给本发明实施例中提供的电化学发光微流控检测芯片接通电极给电装置的示意图。
图8为实施例1制备的电化学发光微流控检测芯片检测cTnT的标准曲线。
图9为实施例1制备的电化学发光微流控检测芯片检测cTnT的线性相关性曲线。
图10为实施例1制备的电化学发光微流控检测芯片检测cTnT的血浆样本相关性。
图11为实施例1制备的电化学发光微流控检测芯片检测cTnT的全血样本相关性。
图12为实施例1制备的电化学发光微流控检测芯片检测cTnT的血清样本相关性。
图13为实施例1制备的电化学发光微流控检测芯片测试10倍稀释与原倍样本相关性。
图14为实施例2制备的电化学发光微流控检测芯片检测PCT的标准曲线。
图15为对比例制备的微流控芯片检测PCT的标准曲线。
图16为实施例2制备的电化学发光微流控检测芯片检测PCT的线性相关性曲线。
图17为对比例制备的微流控芯片检测PCT的线性相关性曲线。
附图标记说明
100芯片上盖；200单面胶电极层；300双面胶流道层；400芯片下盖；
101加样区；
201C工作电极；202参比电极；203对电极；204T工作电极；205单面胶层加样区；
301有胶区；302无胶区；303加样孔区；304流道检测区；305废液槽区；306开槽；
401凹槽；402开口槽。
具体实施方式
以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方案、具体例子而进行，但本发明不限定于这些实施方案、具体例子。
需要说明的是：
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方式”、“另一些具体/优选的实施方式”、“实施方式”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方式有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方式中，并且可存在于其它实施方式中或者可不存在于其它实施方式中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方式中。
本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含一系列步骤或单元的过程、方法或系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
<电化学发光微流控检测芯片>
本发明提供了一种电化学发光微流控检测芯片，所述微流控检测芯片包含叠置的四层：由上至下依次为芯片上盖、单面胶电极层、双面胶流道层和芯片下盖。芯片的形状可以是类椭圆形、方形、长方形、多边形或者圆形，优选地，其形状为类椭圆形以实现更好地握持。在本发明的一个具体实施方式中，芯片上、下盖的厚度均为1.5～2.5mm，如果厚度太薄，则芯片加载样本量过小并且容易变形，如果厚度太厚，透光性会受到影响，影响检测结果，同时也不符合芯片小型化的需求。单面胶电极层的厚度为0.05～0.5mm，双面胶流道层的厚度为0.05～0.5mm。芯片上盖和下盖之间通过单面胶电极层和双面胶流道层粘贴，或者通过单面胶电极层和双面胶流道层粘贴和卡扣共同进行密合固定。
芯片上盖和芯片下盖的材料选自聚苯乙烯、聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate,PMMA)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、玻璃或聚碳酸酯中的一种；优选的，所述芯片上盖和芯片下盖的材料选自聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯或聚碳酸酯；所述双面胶流道层的基底材料为聚氯乙烯(Polyvinyl chloride,PVC)，双面胶流道层的基底的两侧表面涂覆有胶层，胶层为聚对苯二甲酸乙二醇酯胶(polyethylene glycolterephthalate,PET)或聚甲基丙烯酸甲酯胶。所述单面胶电极层的基底材料为聚氯乙烯。在单面胶电极层的基底的一侧表面涂覆有聚对苯二甲酸乙二醇酯胶或聚甲基丙烯酸甲酯胶，并且，在一些优选的实施方式中，单面胶电极层的基底的一侧表面涂覆的胶层与所述双面胶流道层的基底两侧表面胶层材料相同。在本发明的一些优选的实施方式中，单面胶电极层与双面胶流道层的厚度相同；优选地，均为0.2mm。在本发明的另一些优选的实施方式中，单面胶电极层与双面胶流道层的基底材料相同；优选地，均为PVC材料。PVC材料是一种乙烯基的聚合物质，其是一种非结晶性材料，具有不易燃性、高强度、耐高温以及优良的几何稳定性，适于在单面胶电极层上印制丝网印刷电极时的高温烧结加工。在本发明的一些可选的实施方式中，所述单面胶电极层的基底可以为无色、黑色或其他任意颜色。在本发明的一些优选的实施方式中，所述单面胶电极层的基底颜色为黑色。黑色与无色透明或其他任意颜色的基底相比，不反射任何颜色的光，也无光损失。同时黑色的基底可降低背景信号，提高电化学发光信噪比。同时，电化学发光微流控检测芯片在检测仪器中进行检测时，检测仪器中采用的光电倍增管(photomultiplier tube,PMT)是灵敏度非常高的光探测器件，采用黑色的基底(例如黑色的PVC材质)也起到保护检测仪器PMT的作用。
在本发明的一些实施方式中，单面胶电极层的基底未涂覆聚对苯二甲酸乙二醇酯胶或聚甲基丙烯酸甲酯胶的一侧表面设置有丝网印刷电极，以将丝网印刷电极整合到电化学发光微流控检测芯片的内部。在例如PVC材质上设置丝网印刷电极的方法无特殊的限制，在一些具体的实施方式中，为控制电极重复性，可以采用一次性丝网印刷方式在单面胶电极层的基底的无胶一面通过高温烧结工艺制备丝网印刷电极。在本发明的一些具体实施方式中，单面胶电极层上设置的丝网印刷电极采用三电极体系，包括工作电极(WE)，参比电极(RE)和对电极(AE)，其中，工作电极设置有2个，包括C工作电极和T工作电极。其中工作电极和对电极为碳电极，碳电极具有稳定性良好，且相较于其他电极价格更便宜，参比电极为银/氯化银电极，可以提供稳定电位的参比，使得工作电极电位被准确测量。两根工作电极共用一根参比电极和对电极，节省空间。单面胶电极层上设置的丝网印刷电极的工作部分(即，发生电化学反应的部分)设置的位置与双面胶流道层的样本流动通道的流道检测区位置相对应，使得四根电极刚好位于样本流动通道的流道检测区内部，确保能够完全和底液接触导通。各电极的导出部分设置的位置与双面胶流道层的开槽位置相对应，检测时，用于与PCB板接触，确保与检测仪器导通。在本发明的芯片设计，采用PCB板触控接电形式，配套便携式一次性电极，且检测时，电极浸泡到溶液中，使得电极面对准PMT，且加上了电压。
在一些具体的实施方式中，四个电极尺寸略小于样本流动通道的流道检测区部分的通道宽度，各电极的工作部分的直径在1.5-2.5mm范围内，优选地，电极的工作部分的直径为1.8mm。在本发明的一些优选的实施方式中，顺着样本流动的方向，在芯片中，四个电极的排列顺序依次为T工作电极、对电极、参比电极以及C工作电极。
本发明的丝网印刷电极设置在单面胶电极层的基底无胶一侧，避免了在双面胶流道层加入丝网印刷电极，由于双面胶流道层的双面均具有粘性，在有胶面上印刷丝网印刷电极操作不便的问题，以及在印刷过程中和试剂组装过程中因胶的粘性可能导致对电极造成破损的可能性的风险。其次，是因为检测仪器中的PMT装置固定在检测仪器内部，位于检测端口下方，为了保证能够检测到对应信号，工作电极、对电极、参比电极也是朝下方。因此，本发明的单面胶电极层采用单面胶黏贴式，将有胶一面黏贴在芯片上盖，无胶一面附着丝网印刷电极。
在本发明的一些优选的实施方式中，在单面胶电极层上印刷好的C工作电极和T工作电极上做预处理。具体地，预处理方式为纳米金修饰电极。在经纳米金修饰的电极上，使纳米颗粒与抗体之间形成Au-N共价作用，提高抗体(例如肌钙蛋白抗体)包被效率，进一步提高检测性能。
在本发明的一些实施方式中，T工作电极包被有检测抗体，用于检测待测蛋白；C工作电极包被有抗免疫球蛋白抗体，作为质控抗体。本领域技术人员可以根据待测抗原的种类，选择检测抗体及抗免疫球蛋白抗体。例如，当电化学发光微流控检测芯片用于检测心肌肌钙蛋白时，T工作电极可以包被有鼠抗人心肌肌钙蛋白抗体，而C工作电极包被有抗鼠免疫球蛋白抗体。
本发明的单面胶电极层还设置有单面胶层加样区，单面胶层加样区的形状与双面胶流道层的加样孔区形状相对应。
本发明的芯片上盖主要用于将样本引入检测区域，所述芯片上盖包含加样区，在其上设有用于添加样本的孔，孔可设计成可与生物实验中常规实验的标准规格的移液枪枪头严密匹配的圆形，直径可在2mm～3mm之间，通过孔添加的样本可以沿着样本流动通道流动。由于本发明采用的重力和毛细管作用自驱动和短时离心相结合，本发明的加样区中无需固定有全血过滤装置如全血滤膜等，可以减少样本浪费，提高样本利用效率。加样区的形状与双面胶流道层的加样孔区形状相对应。在一种可能的实施方式中，加样区为不规则扇形。芯片上盖还包括通气孔，即加样区通气孔和废液池通气孔。所述通气孔为与大气相通的通孔，优选是圆形通孔以改善样本溶液的流动性，直径可在0.5～2.0mm范围内。在一种可能的实施方式中，芯片上盖设置1个加样区通气孔和1个废液池通气孔。在另一种可能的实施方式中，加样区通气孔可以设置多个，取决于加样区的个数。为了有利于芯片的组装和固定，芯片上盖还可以设置安装定位孔，在本发明的一个具体实施方式中设置2个安装定位孔。
本发明的双面胶流道层为双面胶层，在所述双面胶流道层上用有胶区和无胶区分隔出样本流动通道，并且在样本流动通道的末端处，双面胶流道层开设有开槽，用于容纳给电弹片，即给芯片的丝网印刷电极的导出部分加电预留出空间，同时也是便于与检测仪器上的给电装置更好的接触电源。
所述样本流动通道包括加样孔区、流道检测区、废液槽区，其中所述加样孔区与所述芯片上盖的加样区相对应，所述废液槽区与所述芯片下盖的凹槽(即芯片下盖的废液槽)至少具有部分重叠，所述流道检测区为弧形。当将芯片上下盖和单面胶电极层、双面胶流道层密合后，所述废液槽区的主要作用在于存储废液，即相当于废液池。本发明的双面胶流道层中，减小流道检测区与废液槽区交接的拐弯处流道宽度，使其小于流道检测区流道中间弧形段的宽度，这样就使得即使施加短的离心时间时离心后的废液也能够完全停留在废液槽内，提高了例如高敏心肌蛋白检测准确度。在本发明中流道检测区与废液槽区交接的拐弯处流道宽度是指拐弯处的平均宽度，在本发明的一个具体实施方式中采用游标卡尺测试拐弯处流道宽度10次，取平均值。流道检测区流道中间弧形段的宽度指的也是平均宽度。优选地，流道检测区与废液槽区交接的拐弯处流道宽度比流道检测区流道中间弧形段的宽度＝1:1.5～2.5，进一步优选为1:2。在本发明的一个具体实施方式中，流道检测区的弯曲半径25～35mm(参见专利文献CN108414773A，以固定装置的旋转托盘离心轴心为圆心的半径)，弧度在1.8～2.2rad范围内，所述流道中间弧形段宽度为2-4mm，进一步优选所述流道中间弧形段宽度为2.5-4mm，所述拐弯处流道宽度为1-2mm，进一步优选1-1.5mm。
本发明的芯片下盖设有凹槽(即芯片下盖的废液槽)以便于收集离心时流道检测区甩出的残余废液，凹槽与双面胶流道层的废液槽区部分重叠，为异形，深度在1-2mm。芯片下盖还设置有与双面胶流道层样本流动通道的末端处的开槽位置相对应，形状相同的开口槽，用于容纳给电弹片。
在本发明的一些实施方案中，在本发明的芯片下盖点样有电化学发光材料探针标记的捕获抗体，捕获抗体可以特异性识别并结合待测蛋白。点样捕获抗体的位置对应于双面胶流道层的样本流动通道中流道检测区靠近加样孔区的一端，使得加样后，待测样本中的待测蛋白首先与电化学发光材料探针标记的捕获抗体特异性结合，之后与液体共同流经T工作电极及C工作电极，与其上的检测抗体、抗免疫球蛋白抗体结合。在一些优选的实施方案中，捕获抗体与检测抗体特异性识别并结合待测蛋白不同的表位。
电化学发光传感器的检测性能主要取决于电化学发光材料的性能及信号变化程度，因此选择合适的电化学发光材料和设计恰当的信号放大策略是非常重要的。在本发明的一些实施方式中，捕获抗体标记的电化学发光材料探针选自鲁米诺类探针、钌联吡啶类探针、量子点类探针或金纳米簇探针等中的一种做为标记探针。在本发明的一些优选的实施方式中，捕获抗体标记的电化学发光材料探针为钌联吡啶类探针。如以三氯联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+及其衍生物为例，该发光材料具有化学可逆、发光效率高、灵敏度高等优点，已广泛应用于急性心肌梗死生物标志物的临床检测中。此外，如本领域技术人员所了解的，电化学发光材料探针进行电化学发光反应时，需要配合使用共反应剂，本领域技术人员可以根据电化学发光材料探针选择相应的共反应剂。
采用[Ru(bpy)3]2+作为电化学发光材料探针的电化学发光反应原理如下：
反应包括电化学反应、化学发光和循环三个过程：
①电化学反应过程：
在工作电极上(阳极)加一定的电压能量作用下，二价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+释放电子发生氧化反应而成为三价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)3]3+，同时，电极表面的三丙胺(TPA)也释放电子发生氧化反应而成为阳离子自由基TPA+，并迅速自发脱去一个质子而形成三丙胺自由基TPA·，这样，在反应体系中就存在具有强氧化性的三价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)3]3+和具有强还原性的三丙胺自由基TPA·。
②化学发光过程：
具有强氧化性的三价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)3]3+和具有强还原性的三丙胺自由基TPA·发生氧化还原反应，结果使三价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)3]3+还原成激发态的二价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+，其能量来源于三价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)3]3+与三丙胺自由基TPA·之间的电势差，激发态[Ru(bpy)3]2+发生辐射跃迁到基态并以释放出一个波长为620nm光子的方式释放能量，而成为基态的[Ru(bpy)3]2+。
③循环过程：
上述化学发光过程后，反应体系中仍存在二价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+和三丙胺(TPA)，使得电极表面的电化学反应和化学发光过程可以继续进行，这样，整个反应过程可以循环进行。通过循环过程，测定信号不断的放大，从而使检测灵敏度大大提高，所以电化学发光(ECL)测定具有高灵敏的特点。
为了进一步提高捕获抗体标记电化学发光材料探针的效率和材料稳定性，在本发明的一些更优选的实施方式中，将电化学发光材料探针修饰在二氧化硅材料上，然后再进一步标记捕获抗体。二氧化硅是一种无毒、无味、无污染的非金属材料。该物质近似单分散分布，具有分散性好、比表面积巨大、极好的光学性能和化学稳定性等优良性能，是一类重要的新型多孔材料，可提高蛋白标记效率。
在检测cTn抗原，且Ru(bpy)3 2+标记捕获抗体与待测样本进行预反应的情况下，电化学发光微流控检测芯片进行免疫反应后测试原理如下：
检测时，将待测样本(例如，全血/血清/血浆)用样本稀释液进行稀释，例如采用样本稀释液将待测样本稀释10倍，取部分加入加样孔。当液体流经芯片的捕获区时，经Ru(bpy)3 2+标记的cTn捕获抗体与待测蛋白特异性结合，形成结合物，并继续随液体流动，流经T工作电极时，结合物与T工作电极上包被的cTn检测抗体通过免疫反应特异性结合，形成cTn双抗体的三明治夹心结构，并被固定在T工作电极上。反应10分钟后，从加样孔再加入共反应剂，将通道内液体冲走后进行测试。当待测样本中的cTn抗原浓度高，形成的三明治夹心复合物多，测试信号高，反之信号低。而其余没有反应的三联吡啶钌-捕获抗体标记复合物与另一固定在C工作电极上的抗免疫球蛋白抗体(例如羊抗鼠多克隆抗体，作为质控抗体)结合。通过给电装置在电极上施加一定的电压进行电化学反应，反应释放的能量用于激发发光体，当发光体从激发态返回基态时产生光发射。由T工作电极与对电极组成传输电子，形成电流回路，T工作电极与参比电极组成形成电压回路，用来测试工作电极的电化学反应。从而根据电化学反应的光发射强度比值，测试光信号实现对待测样本cTn浓度高低的分析。工作电极C同理。
本发明提供的电化学发光微流控检测芯片可以采用具有高灵敏度光电倍增管(PMT)的检测仪器采集电化学发光信号。芯片检测过程中，反应包括了电化学和化学发光两个过程。具有发光标记物质的结合物与包被于电极上的抗体发生特异的结合反应后，进入样本流动通道的流道检测区，然后由电启动发光反应，含TPA的共反应剂进入流道检测区，同时电极加电产生光子。光强度与发电化学发光材料探针-捕获抗体-抗原-检测抗体复合物的量呈线性关系，由检测仪器的PMT检测光强度，可计算出待测蛋白的含量。在本发明中，第一次进样抗原，第二次进样共反应剂，第二次进样和第一次进样之间留出一个气泡间隙，第一次进样例如约25微升刚好能浸润所有电极，第二次进样量大于第一次进样，且流速快于第一次进样。由于气泡存在，第二次进样的共反应剂液体推动第一次进样的抗原液体迅速流动至废液池，达到快速洗涤的目的。从而较现有的电化学发光检测，本发明的电化学发光微流控检测芯片操作简便、快速，并且不同样本间的检测实现了免清洗。
<蛋白检测试剂盒>
本发明进一步提供了一种蛋白检测试剂盒，所述的蛋白检测试剂盒包括一个或多个本发明前述的电化学发光微流控检测芯片。
在一些具体的实施方式中，蛋白检测试剂盒还包含共反应剂。
在一些具体的实施方式中，蛋白检测试剂盒还包含样本稀释液，所述的样本稀释液中包含质量百分比范围为0.1％-0.5％的曲拉通-100(Triton X-100)，优选为0.2％。检测时，采用样本稀释液稀释待测样本，通过调节样本稀释液中的表面活性剂Triton X-100的质量百分比，达到调整流速的效果。Triton X-100的使用质量百分比高，液体的流动速度快，Triton X-100的使用质量百分比低，液体的流动速度慢。在一些更具体的实施方式中，样本稀释液为包含质量百分比0.1％-0.5％的曲拉通-100、质量百分比为0.5-2％的BSA以及质量百分比为0.5-5％的NaCl的PB溶液(0.05-0.2M，pH＝7.4)。
实施例及应用例
以下实施例及应用例以心肌肌钙蛋白T(cTnT)和降钙素原(PCT)检测试剂盒的制备过程为例对本发明进行说明。
实施例1：检测心肌肌钙蛋白T的试剂盒的制备
一、制备电化学发光材料探针标记的捕获抗体
1、钌硅纳米粒子(RuSi-NH2)的合成(本步骤中所有未特殊标识出的试剂均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，以下简称阿拉丁。)
1.1、取7.5mL环己烷，1.77mL Triton X-100，1.6mL 1-己醇，400μL去离子水，80μL40mM氯化六水合二氯三联吡啶钌于50mL离心管内，在室温条件下充分混匀5min；
1.2、向步骤1.1获得的反应物中分别加入100μL四乙氧基硅烷(TEOS)和60μL氨水，室温条件下搅拌2小时；
1.3、向步骤1.2获得的反应物中加入10mL丙酮，充分混匀5min，破乳，获得合成物；
1.4、收集步骤1.3获得的合成物：在转速12000rpm、温度为4℃的条件下离心5min，去上清，获得沉淀物；
1.5、在步骤1.4中获得的沉淀物中加入6mL乙醇洗涤一次，同步骤1.4的离心条件进行离心，去上清，获得沉淀物；
1.6、在步骤1.5中获得的沉淀物中加入200μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，充分混合30min；
1.7、清洗：采用6mL去离子水和6mL乙醇交替各洗涤步骤1.6获得产物1次，均同步骤1.4的离心条件进行离心，去上清，获得沉淀物；
1.8、收集样品：将步骤1.7获得的沉淀物置于60℃烘箱干燥2小时，收集粉末，室温下干燥保存备用。
2、钌硅纳米粒子探针标记的捕获抗体的制备
2.1、分别配制400mM/L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和100mM/L的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)溶液(上述两种试剂均购于默克Sigma)；
2.2、采用PBS(pH＝7.4，下同)将心肌肌钙蛋白T标记抗体(作为捕获抗体)稀释至1mg/mL；
2.3、取10μL步骤2.2中稀释的1mg/mL的心肌肌钙蛋白T标记抗体，分别加入200μL步骤2.1中配置的400mM/L的EDC和100mM/L的NHS溶液中，充分混匀，37℃条件下充分搅拌2h(上述抗体购于海肽生物上海有限公司)；
2.4、向步骤2.3获得的溶液中加入3mL 0.8mg/mL钌硅纳米粒子37℃条件下充分搅拌2h；
2.5、经步骤2.4搅拌后，将所得产物在转速12000rpm、温度为4℃条件下离心10min，去上清，获得沉淀物；
2.6、将步骤2.5获得的沉淀物中加入1mL含1％BSA的PBS溶液充分混匀、洗涤，同步骤2.5的离心条件进行离心，去上清，获得沉淀物，即RuSi-NH2探针标记的捕获抗体；
2.7、收集钌硅纳米粒子探针标记的捕获抗体：向步骤2.6获得的沉淀物中加入1mLPBS溶液，将沉淀物分散重悬，2-8℃储存备用。
二、共反应剂的制备
配制共反应剂，其含有0.1M三丙胺(TPrA)、质量百分比0.2％曲拉通-100(TritonX-100)的PBS溶液。
三、制备电化学发光微流控检测芯片
1、制备芯片四层结构
采用模具制备得到芯片上盖、芯片下盖以及单面胶电极层，采用激光雕刻机对双面胶流道层进行刻蚀。如图1-5所示，实施例1所使用的电化学发光微流控检测芯片包含如下四层结构：芯片上盖100、单面胶电极层200、双面胶流道层300和芯片下盖400。芯片上盖100的材质是PMMA，形状为类椭圆形，芯片上盖100的厚度为2.0mm。如图1所示，芯片上盖100包含加样区101，加样区101的形状为不规则扇形。
单面胶电极层200的基底材质为黑色的PVC，单面胶电极层200的基底的一侧表面涂覆有PET胶，单面胶电极层200的厚度为0.2mm。单面胶电极层200的基底的另一侧表面上制备丝网印刷电极，包括C工作电极201、参比电极202、对电极203和T工作电极204。此外，单面胶电极层200还设置有单面胶层加样区205。
进一步地，在本实施例中，单面胶电极层200的丝网印刷电极制备方法如下：
1)单面胶电极层200的丝网印刷电极制备
在单面胶电极层上无胶的一面丝网印刷上4个电极，分别为C工作电极201、参比电极202、对电极203和T工作电极204。其中参比电极202为银/氯化银电极，C工作电极201、T工作电极204和对电极203为碳电极；
将单面胶电极层200有胶一面按照定位孔粘贴在芯片上盖100上，备用。
2)C工作电极与T工作电极的修饰及抗体包被
2.1)各取2μL球形金纳米颗粒分别滴涂在T工作电极204上和C工作电极201上，置于37℃烘箱干燥5min；
2.2)采用PBS将羊抗鼠质控抗体(购于长沙博友生物科技有限公司)和心肌肌钙蛋白T包被抗体(作为检测抗体)(购于海肽生物上海有限公司)分别稀释至1mg/mL，取2μL1mg/mL的心肌肌钙蛋白T包被抗体点涂在T工作电极204上，取2μL 1mg/mL的羊抗鼠质控抗体点涂在C工作电极201上，2-8℃孵育过夜；
2.3)采用超纯水分别冲洗步骤2.2)获得的T工作电极204和C工作电极201后，采用洗耳球吹干，并在37℃烘箱干燥30min，干燥保存备用。
双面胶流道层300的基底材质为PVC，双面胶流道层300的基底的两侧表面涂覆有PET胶，双面胶流道层300的厚度为0.2mm。采用激光雕刻机对双面胶流道层300进行刻蚀，用有胶区301和无胶区302分隔出样本流动通道(即无胶区302)，如图3所示。并且在样本流动通道的末端处，开设有开槽306，用于容纳给电弹片。所述样本流动通道可细分为加样孔区303、流道检测区304、废液槽区305三个区域，其中所述加样孔区303与所述芯片上盖的加样区101形状相同，所述废液槽区305与所述芯片下盖的凹槽401至少具有部分重叠。流道中间弧形段宽度A为3mm，长度为30mm，所述流道检测区的弯曲半径32mm，弧度2.09rad，流道检测区与废液槽区交接的拐弯处流道宽度B为1.2mm，该宽度采用游标卡尺测试拐弯处流道宽度10次，取平均值。
芯片下盖400的材质是PMMA，形状与芯片上盖100相匹配，芯片下盖400的厚度为2.0mm。如图4所示，芯片下盖400包括一收集离心时残余废液的凹槽401，为异形，长宽深的最大尺寸为32mm×3.3mm×1.5mm。芯片下盖400还设置有与双面胶流道层300的样本流动通道的末端处的开槽306位置相对应，形状相同的开口槽402，用于容纳给电弹片。用点样仪将步骤一中制备的2.5μL钌硅纳米粒子探针标记的捕获抗体点样于芯片下盖400的捕获区位置处，37℃烘箱干燥过夜备用。
2、电化学发光微流控检测芯片组装
将芯片上盖100置于组装治具上，贴上单面胶电极层200，将芯片下盖400置于组装治具上，将双面胶流道层300的一面附着层斯下粘贴于芯片下盖400上，然后将双面胶流道层300另一面附着层撕下，将贴好单面胶电极层200的芯片上盖100与芯片下盖400合起来。并用压卡仪压紧，用铝箔袋干燥、密封保存备用。
四、样本稀释液的制备
制备样本稀释液，其为包含质量百分比0.2％的曲拉通-100(Triton X-100)、质量百分比为1％的BSA以及质量百分比为0.9％的NaCl的PB溶液(0.1M,pH＝7.4的磷酸缓冲液)。
应用例1
一、标准曲线的制备
1、系列浓度参考品的制备：
用人基质阴性血清稀释cTnT抗原(购于海肽生物上海有限公司)，按照稀释比例不高于1:9的比例逐级将抗原稀释，再用样本稀释液稀释10倍，配制系列梯度的混合参考品，cTnT终浓度分别为：0.1、0.5、2、5、20、100、300、1000、5000、10000ng/mL，以人基质阴性血清作为0ng/mL。
2、系列浓度参考品的测试：
取25μL步骤1中获得的各浓度参考品，添加至上述实施例1中组装好的电化学发光微流控检测芯片上，反应15min，然后再加入35μL共反应剂冲洗掉抗原，无需等待时间，直接通过用POCT电化学发光检测系统中仪器测试，读取T/C信号值，每个参考品浓度检测三次，取信号均值。
3、标准曲线的拟合
横坐标表示测试系列参考品的浓度，纵坐标表示T/C信号值，用四参数拟合标准曲线。实施例1制备的电化学发光微流控检测芯片检测cTnT标准曲线原始数据均值见表1，标准曲线见图8。
表1：实施例1制备的电化学发光微流控检测芯片检测cTnT标准曲线原始数据
Figure BDA0003338615390000211
由图8和表1可知，实施例1制备的电化学发光微流控检测芯片检测心肌肌钙蛋白T的标准曲线在0.5-10000ng/L浓度范围内，用Logistic四参数拟合的标准曲线的R2＝0.99987，而专利文献4：CN110773246A中公开的微流控芯片，其标准曲线在5-10000ng/L浓度范围内，用Logistic四参数拟合的标准曲线的R2＝0.99978(参见专利文献4：CN110773246A的应用例1)，可见本发明的电化学发光微流控检测芯片更优。
二、性能测试
1、精密度：
各重复10次测试100ng/L和1000ng/L两个水平的参考品，计算变异系数CV应不大于10％。精密度测试结果见表2。
表2：实施例1制备的电化学发光微流控检测芯片精密度测试结果
测试次数 100(ng/L) 1000(ng/L)
1 103.92 1117.85
2 97.31 1007.03
3 108.85 1026.82
4 102.33 999.81
5 93.86 1021
6 108.94 901.81
7 99.92 1099.75
8 101.97 929.63
9 99.12 989.68
10 96.98 978.81
平均 101.32 1007.219
STD 4.948 66.396
CV 4.90％ 6.60％
由表2可知，实施例1制备的电化学发光微流控检测芯片检测心肌肌钙蛋白T的检测结果为：100ng/L浓度的CV＝4.90％，1000ng/L浓度的CV＝6.60％；而专利文献4：CN110773246A中公开的微流控芯片的检测结果为：100ng/L浓度的CV＝7.4％，1000ng/L浓度的CV＝7.4％(参见专利文献4：CN110773246A的应用例1)，从精密度来看实施例1制备的电化学发光微流控检测芯片更优。
2、线性范围：
检测系列浓度参考品，每个参考品浓度检测三次，计算平均值，以参考品浓度为横坐标，测试均值结果为纵坐标，进行直线拟合，并计算相关稀释R。具体结果参见下表3。
表3：实施例1制备的电化学发光微流控检测芯片线性范围测试结果
Figure BDA0003338615390000231
由图9和表3可知，实施例1制备的电化学发光微流控检测芯片检测心肌肌钙蛋白T的检测结果为：在0.5-10000ng/L浓度范围内，相关系数R＝1，相关性良好，且在20-10000ng/L浓度范围内，绝对偏差≤±10％；而专利文献4：CN110773246A中公开的微流控芯片的检测结果为：在5-10000ng/L浓度范围内，相关系数R＝1，但是在100-10000ng/L浓度范围内，绝对偏差≤±10％(参见专利文献4：CN110773246A的应用例1)，因此从线性范围来看，实施例1制备的电化学发光微流控检测芯片更优。
三、样本测试
本发明实施例1制备的电化学发光微流控检测芯片与罗氏型全自动电化学发光免疫分析系统在测试心肌肌钙蛋白T上的对比情况如下：
测试从上海市东方医院收集的并用罗氏肌钙蛋白T试剂盒(上海东方医院南院采购)测试结果的血浆样本25例，同源全血样本20例，同源血清22例，测试结果见表4，血浆相关性见图10，R2＝0.997、全血相关性见图11，R2＝0.9973；血清样本22例，相关性见图12，R2＝0.9992。
表4：血浆/全血/血清测试原始数据比较
Figure BDA0003338615390000241
表5：测试10倍稀释与原倍样本测试结果比较
Figure BDA0003338615390000251
由三种样本类型的检测结果可见，本发明实施例1制备的电化学发光微流控检测芯片检测临床血浆、全血和血清样本与罗氏测试结果相关性良好。另选取罗氏测试可报告范围下限附近的有值样本(0.005ng/mL附近)的血浆样本6例，用经实施例测试为阴性的血浆样本对上述6例样本10倍稀释，然后用实施例和罗氏试剂同时进行测试(见表5)，实验结果显示，10倍稀释后的样本，用罗氏电化学发光测试，报告结果是超出检测范围，而用实施例1制备的电化学发光微流控检测芯片测试，结果与原倍测试的相关系数为R2＝0.8034，斜率＝0.0874，相关性良好(参见图13)。说明实施例1制备的电化学发光微流控检测芯片灵敏度更优。
实施例2：检测降钙素原的试剂盒的制备
一、制备电化学发光材料探针标记的捕获抗体
1、RuSi-NH2的合成
具体步骤同实施例1中“一、制备电化学发光材料探针标记的捕获抗体”的步骤1：“RuSi-NH2的合成”。
2、RuSi-NH2探针标记的捕获抗体的制备
2.1、分别配制400mM/L的EDC和100mM/L的NHS溶液；
2.2、采用PBS将PCT标记抗体(作为捕获抗体)(购于广州市格瑞林生物科技有限公司，鼠源单抗)稀释至1mg/mL；
2.3、取15μL步骤2.2中稀释的1mg/mL的PCT标记抗体，分别加入步骤2.1中配置的200μL 400mM/L的EDC和100mM/L的NHS溶液，充分混匀，37℃条件下充分搅拌2h；
步骤2.4-步骤2.7：同实施例1中“一、制备电化学发光材料探针标记的捕获抗体”的步骤2：“RuSi-NH2探针标记的捕获抗体的制备”的步骤2.4-步骤2.7进行，获得RuSi-NH2探针标记的捕获抗体的制备。
二、共反应剂的制备：
同实施例1中的“二、共反应剂的制备”制备共反应剂。
三、制备电化学发光微流控检测芯片
在本实施例中，电化学发光微流控检测芯片制备方法基本如实施例1中的“三、制备电化学发光微流控检测芯片”中所述的，其中，本实施例中，在T工作电极上点涂的为PCT包被抗体(购于广州市格瑞林生物科技有限公司，鼠抗人多抗)，作为检测抗体。
四、样本稀释液的制备
制备样本稀释液，其为包含质量百分比0.2％的曲拉通-100(Triton X-100)、质量百分比为1％的BSA以及质量百分比为3％的NaCl的PB溶液(0.05M,pH＝7.4)。
对比例
参照专利文献4：CN110773246A中公开的微流控芯片的制备方法制备用于检测PCT抗原的微流控芯片，作为后续应用例2中的对比例。
应用例2
一、标准曲线的制备
1、系列浓度参考品的制备：
用人基质阴性血清稀释PCT抗原(Hytest公司)，按照稀释比例不高于1:9的比例逐级将抗原稀释，再用样本稀释液稀释10倍，配制系列梯度的混合参考品，PCT终浓度分别为：0.01、0.05、0.5、2、5、25、75、100ng/mL，以人基质阴性血清作为0ng/mL。
2、系列浓度参考品的测试：
取20μL浓度参考品，到上述实施例2组装好的电化学发光微流控检测芯片上，反应10min，然后再加入40μL共反应剂冲洗掉抗原，无需等待时间，直接通过用POCT电化学发光读数仪测试，读取T/C信号值，每个参考品浓度检测三次，取信号均值。
3、标准曲线的拟合
横坐标表示测试系列参考品的浓度，纵坐标表示T/C信号值，用四参数拟合标准曲线。实施例2制备的电化学发光微流控检测芯片检测PCT的标准曲线原始数据均值见表6，标准曲线见图14。
表6：实施例2制备的电化学发光微流控检测芯片检测PCT的标准曲线原始数据
Figure BDA0003338615390000271
对比例的标准曲线原始数据及相关曲线如下表7：
表7：对比例标准曲线原始数据
Figure BDA0003338615390000281
由图14和图15对比可知，实施例2制备的电化学发光微流控检测芯片检测PCT的标准曲线在0.01-100ng/mL浓度范围内，用Logistic四参数拟合的标准曲线的R2＝0.99975，而在对比例中，0.05-10000ng/L浓度范围内，用Logistic四参数拟合的标准曲线的R2＝0.99958，实施例2的电化学发光微流控检测芯片更优。
二、性能测试
1、精密度：
各重复10次测试0.5ng/mL和10ng/mL两个水平的参考品，计算变异系数CV应不大于10％。精密度测试结果见表8。
表8：实施例2制备的电化学发光微流控检测芯片精密度测试结果
测试次数 0.5(ng/mL) 10(ng/mL)
1 0.52 10.29
2 0.55 10.21
3 0.48 10.05
4 0.53 10.64
5 0.56 9.98
6 0.51 10.12
7 0.46 11.11
8 0.53 10.11
9 0.55 9.87
10 0.45 10.73
平均 0.514 10.311
STD 0.0386437 0.3918461
CV 7.54％ 3.82％
对比例精密度测试原始数据及CV如下表9所示：
表9：对比例精密度测试结果
测试次数 0.5(ng/mL) 10(ng/mL)
1 0.53 10.11
2 0.55 9.87
3 0.45 10.73
4 0.52 10.11
5 0.55 10.17
6 0.53 10.04
7 0.5 10.75
8 0.44 9.93
9 0.49 9.98
10 0.54 11.21
平均 0.51 10.29
STD 0.0394405 0.4466418
CV 7.71％ 4.37％
由表8和表9对比可知，实施例PCT的检测结果为：0.5ng/mL浓度的CV＝7.54％，10ng/mL浓度的CV＝3.82％；而对比例的检测结果为：0.5ng/mL浓度的CV＝7.71％，10ng/mL浓度的CV＝4.37％，从精密度来看实施例2略优于对比例。
2、线性范围：
检测系列浓度参考品，每个参考品浓度检测三次，计算平均值，以参考品浓度为横坐标，测试均值结果为纵坐标，进行直线拟合，并计算相关稀释R。结果参见下表10。
表10：实施例2制备的电化学发光微流控检测芯片线性范围测试结果
Figure BDA0003338615390000301
对比例线性范围测试原始数据及相关曲线如下表11所示：
表11：对比例线性范围测试结果
Figure BDA0003338615390000302
由图16和图17对比可知，实施例2制备的电化学发光微流控检测芯片PCT的检测结果为：在0.01-100ng/mL浓度范围内，相关系数R＝1，相关性良好；对比例的检测结果为：在0.05-100ng/mL浓度范围内，相关系数R＝0.9999因此从线性范围来看，实施例2制备的电化学发光微流控检测芯片更优。
综上，本发明提供了一种小型便携式的POCT电化学发光微流控检测芯片，可以用于例如高敏心肌肌钙蛋白(hs-cTn)的检测。该微流控检测芯片将电化学发光技术与微流控免疫芯片技术相结合，可以使用包括小型电化学工作站和微型PMT的检测装置进行检测，以与现有POCT微流控检测仪器相结合使用。本发明提供的电化学发光微流控检测芯片同时在微流控芯片中利用金纳米粒子修饰丝网印刷的工作电极，将标记物在反应体系内再循环利用，使发光时间更长、强度更高，易于精确控制，保证电化学发光分析的测定结果更精确、更稳定。从而达到提高检测例如高敏心肌肌钙蛋白灵敏度的目的。
与目前市场上主流罗氏的大型电化学发光检测系统相比，本发明提供的电化学发光微流控检测芯片检测时间短，不需要复杂的清洗流程和检测流程，而且仪器体积小、重量轻，便于携带，不仅适用于大型医院和检验科，也适用于在急诊、ICU、胸痛中心等科室的使用。

Claims (12)

1.一种电化学发光微流控检测芯片，其特征在于，所述电化学发光微流控检测芯片包含叠置的芯片上盖、单面胶电极层、双面胶流道层和芯片下盖；其中，
所述芯片上盖包含加样区；
所述芯片下盖设有凹槽及开口槽；
所述单面胶电极层包含单面胶层加样区，所述单面胶电极层在与所述芯片上盖接触的一侧表面设置有胶层，所述单面胶电极层在与所述双面胶流道层接触的一侧表面设置有多个电极，所述电极包括工作部分及导出部分；
所述双面胶流道层包含样本流动通道及开槽，所述开槽位于所述样本流动通道的末端处；所述样本流动通道包括加样孔区、流道检测区和废液槽区，其中，所述加样孔区与所述芯片上盖的加样区及所述单面胶电极层的单面胶层加样区相对应；所述流道检测区与所述单面胶电极层的多个电极的工作部分相对应；所述废液槽区与所述芯片下盖的凹槽至少部分重叠；所述开槽与所述芯片下盖的开口槽相对应，并与所述单面胶电极层的多个电极的导出部分相对应。
2.根据权利要求1所述的电化学发光微流控检测芯片，其特征在于，所述单面胶电极层的基底材质为聚氯乙烯；
优选地，所述单面胶电极层的基底材质为黑色的聚氯乙烯。
3.根据权利要求1或2所述的电化学发光微流控检测芯片，其特征在于，所述单面胶电极层与所述芯片上盖接触的一侧表面设置的胶层的材料为聚对苯二甲酸乙二醇酯胶或聚甲基丙烯酸甲酯胶。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的电化学发光微流控检测芯片，其特征在于，所述电极包括工作电极、参比电极和对电极；
优选地，所述工作电极和所述对电极为碳电极，所述参比电极为银/氯化银电极。
5.根据权利要求4所述的电化学发光微流控检测芯片，其特征在于，所述工作电极包括第一工作电极和第二工作电极，所述第一工作电极的工作部分包被有检测抗体，所述第二工作电极的工作部分包被有质控抗体；
优选地，所述工作电极的工作部分经纳米金修饰后包被抗体。
6.根据权利要求5所述的电化学发光微流控检测芯片，其特征在于，所述检测抗体特异性识别并结合待测蛋白，所述质控抗体为抗免疫球蛋白抗体。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的电化学发光微流控检测芯片，其特征在于，所述芯片下盖点样有电化学发光材料探针标记的捕获抗体，点样所述捕获抗体的位置对应于所述双面胶流道层的样本流动通道中流道检测区靠近加样孔区的一端。
8.根据权利要求7所述的电化学发光微流控检测芯片，其特征在于，所述捕获抗体特异性识别并结合待测蛋白；
优选地，所述检测抗体与所述捕获抗体特异性识别并结合待测蛋白的不同表位。
9.根据权利要求7或8所述的电化学发光微流控检测芯片，其特征在于，所述电化学发光材料探针选自鲁米诺类探针、钌联吡啶类探针、量子点类探针或金纳米簇探针中的任一种。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的电化学发光微流控检测芯片，其特征在于，所述电化学发光材料探针修饰在二氧化硅材料上，进而与捕获抗体结合。
11.一种蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内包括一个或多个如权利要求1-10任一项所述的电化学发光微流控检测芯片。
12.根据权利要求11所述的蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括共反应剂和样本稀释液；
优选地，所述样本稀释液中包含质量百分比0.1％-0.5％的曲拉通-100。
CN202111301615.4A 2021-11-04 2021-11-04 一种电化学发光微流控检测芯片及用于蛋白检测的试剂盒 Active CN114011480B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111301615.4A CN114011480B (zh) 2021-11-04 2021-11-04 一种电化学发光微流控检测芯片及用于蛋白检测的试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111301615.4A CN114011480B (zh) 2021-11-04 2021-11-04 一种电化学发光微流控检测芯片及用于蛋白检测的试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114011480A true CN114011480A (zh) 2022-02-08
CN114011480B CN114011480B (zh) 2023-04-07

Family

ID=80060930

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111301615.4A Active CN114011480B (zh) 2021-11-04 2021-11-04 一种电化学发光微流控检测芯片及用于蛋白检测的试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114011480B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116297762A (zh) * 2023-03-07 2023-06-23 复旦大学 一种基于微流控平台的光电联合病原体检测装置及方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103278469A (zh) * 2013-05-24 2013-09-04 宁波美康生物科技股份有限公司 一种总蛋白检测试剂
CN103278648A (zh) * 2013-05-24 2013-09-04 宁波美康生物科技股份有限公司 一种白蛋白检测试剂
CN105435867A (zh) * 2015-10-26 2016-03-30 深圳华迈兴微医疗科技有限公司 检测全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化学发光微流控芯片
CN105435868A (zh) * 2015-10-26 2016-03-30 深圳华迈兴微医疗科技有限公司 定量检测全血中肌钙蛋白i的磁微粒化学发光微流控芯片
CN106996929A (zh) * 2017-03-10 2017-08-01 广州军区广州总医院 集成化的电化学发光纸质微流控芯片及其制备方法与应用
CN108414773A (zh) * 2018-07-12 2018-08-17 上海速创诊断产品有限公司 一种微流控检测芯片及其制备方法、固定装置和离心式检测装置
CN209086198U (zh) * 2018-11-06 2019-07-09 湖南海源医疗科技股份有限公司 一种血糖、尿酸双功能电化学试条

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103278469A (zh) * 2013-05-24 2013-09-04 宁波美康生物科技股份有限公司 一种总蛋白检测试剂
CN103278648A (zh) * 2013-05-24 2013-09-04 宁波美康生物科技股份有限公司 一种白蛋白检测试剂
CN105435867A (zh) * 2015-10-26 2016-03-30 深圳华迈兴微医疗科技有限公司 检测全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化学发光微流控芯片
CN105435868A (zh) * 2015-10-26 2016-03-30 深圳华迈兴微医疗科技有限公司 定量检测全血中肌钙蛋白i的磁微粒化学发光微流控芯片
CN106996929A (zh) * 2017-03-10 2017-08-01 广州军区广州总医院 集成化的电化学发光纸质微流控芯片及其制备方法与应用
CN108414773A (zh) * 2018-07-12 2018-08-17 上海速创诊断产品有限公司 一种微流控检测芯片及其制备方法、固定装置和离心式检测装置
CN209086198U (zh) * 2018-11-06 2019-07-09 湖南海源医疗科技股份有限公司 一种血糖、尿酸双功能电化学试条

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116297762A (zh) * 2023-03-07 2023-06-23 复旦大学 一种基于微流控平台的光电联合病原体检测装置及方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114011480B (zh) 2023-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Munge et al. Multiplex immunosensor arrays for electrochemical detection of cancer biomarker proteins
Jones et al. Multiplexed immunosensors and immunoarrays
Warsinke Point-of-care testing of proteins
EP2986987B1 (en) Electrochemical lateral flow bioassay and biosensor
Liu et al. Paper‐based electrochemical biosensors: from test strips to paper‐based microfluidics
Chikkaveeraiah et al. Electrochemical immunosensors for detection of cancer protein biomarkers
KR0143993B1 (ko) 전기화학 발광성 분석
Wang et al. Electrochemical enzyme immunoassays on microchip platforms
AU2014248759B2 (en) Improved assay methods
Mani et al. Magnetic particles in ultrasensitive biomarker protein measurements for cancer detection and monitoring
EP0286084A2 (en) A device for the rapid qualitative or quantitative assay of entities having a biological activity
CN1975424A (zh) 一种直接的免疫传感器和测定方法
Chen et al. A simple and versatile paper-based electrochemiluminescence biosensing platform for hepatitis B virus surface antigen detection
EP2776833A1 (en) Co-binder assisted assay methods
JPH05264552A (ja) 特異結合分析方法および装置
CN113884481B (zh) 一种干式双极电化学发光芯片及其在免疫检测中的应用
JP4972295B2 (ja) 免疫分析方法及びバイオチップ
RU2568979C2 (ru) Интегрированные углеродные электродные чипы для электрического возбуждения хелатов лантанидов и способы анализа с их использованием
Cheng et al. Integrated electrochemical lateral flow immunoassays (eLFIAs): recent advances
CN114011480B (zh) 一种电化学发光微流控检测芯片及用于蛋白检测的试剂盒
Song et al. Enhancing affinity‐based electroanalytical biosensors by integrated AC electrokinetic enrichment—A mini review
CN109100400B (zh) 用于检测刀豆蛋白a的传感器及其制备方法和应用
JP2009002939A (ja) アンペロメトリック型バイオセンサ
Yasukawa et al. A dual electrochemical sensor based on a test-strip assay for the quantitative determination of albumin and creatinine
EP4318694A2 (en) Membraneless fuel cell

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant