CN107064254A - 一种检测微囊藻毒素的电化学方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于纳米材料及Au@Pt标记抗体的信号放大技术检测微囊藻毒素MC‑LR的电化学方法,属于分析化学或水环境监测技术领域。将MoS2/AuNCs纳米复合材料通过Au‑S键固定到金电极表面,之后利用吸附作用将MC‑LR抗体修饰到纳米复合材料表面。MC‑LR抗体与抗原特异性结合,再结合Au@Pt核壳材料标记的抗体,通过催化H2O2实现电化学响应信号的放大。根据放大的电化学信号实现水样中MC‑LR的痕量测定,该法具有高灵敏度、高专一性、简单、快速等特点。本发明所提供的检测方法还可用于水中其他种类藻毒素分子以及小分子的检测,为水中污染物提供了一条快速、方便的检测途径。
Description
技术领域
本发明属于分析化学或水环境监测技术领域,具体涉及一种基于纳米材料信号放大技术检测水样中微囊藻毒素的电化学方法。
背景技术
微囊藻毒素(Microcystins,简称MCs)是一种能够造成动物中毒和影响人类健康的淡水蓝细菌肝毒素,有强烈的致肝癌作用,其中最常见和毒性最高的是微囊藻毒素-(亮氨酸-精氨酸)(Microcystin-(leucine-arginine),MC-LR)。随着水体富营养化的日益加剧,由蓝藻水华爆发引起的微囊藻毒素污染已经成为一个全球关注的环境问题和卫生问题。水体MC-LR的含量已被多个国家和组织作为衡量水质标准的一个重要指标,世界卫生组织(WHO)于1998年首次公开表示需要监测水中的蓝绿藻毒素,并随后推荐饮用水中的微囊藻毒素标准为1.0ug/L。因此,灵敏、准确、快速测定天然水体中微囊藻毒素的含量,对于了解和探索蓝藻水化在自然水体中的爆发和发展规律,为制定有效的防治措施并进行污染水体的监测、保护和治理具有极其重要的意义。
目前,微囊藻毒素MC-LR的检测方法主要有化学分析法、生物毒理学法和免疫检测法等。其中,化学分析法主要是传统的仪器分析方法,如高效液相色谱、色谱-质谱联用、薄层色谱和毛细管电泳等。化学分析法虽然具有较好的灵敏度和准确性,但需要价格昂贵的仪器设备,分析过程往往非常复杂,费力且耗时。生物毒理学法采取对小鼠进行灌喂或腹腔注射来鉴定藻毒素的毒性。其优点是简便直观,能较为粗略地判断提取物是否有毒性,但灵敏度和专一性不高,无法准确定量,且小鼠的维持费用高,工作量大。免疫检测法利用毒素诱发免疫反应产生抗体,基于抗体对抗原的特异性识别来对各种毒素进行检测,主要包括酶联免疫分析法和蛋白磷酸酶抑制分析法等。免疫检测法简单易行、分析速度快、灵敏度较高,但不能对毒素起到良好的鉴别作用,有时会出现假阳性反应。
电化学分析方法由于其具有操作简单、响应快速,且灵敏度高、环境友好、易实现在线监测等优点,近年来受到广泛的关注与应用。因此,我们设想将高灵敏的电化学分析方法与具有高特异性的免疫分析技术相结合,构筑微囊藻毒素MC-LR的电化学免疫传感器,进而构建用于实现高灵敏、高选择性检测微囊藻毒素MC-LR的新型电化学检测方法。本发明利用MoS2/AuNCs纳米复合材料及Au@Pt标记抗体作为信号放大技术,利用抗原抗体的特异性结合和电化学方法,实现对微囊藻毒素MC-LR的痕量检测,建立了高灵敏度、快速、低成本的微囊藻毒素MC-LR检测手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测微囊藻毒素MC-LR的电化学方法,该方法通过MoS2/AuNCs纳米复合材料和Au@Pt标记抗体构建电化学免疫传感器,用于水体中微囊藻毒素MC-LR的高灵敏、快速检测。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
1. 一种检测微囊藻毒素MC-LR的电化学方法,包括如下步聚:
首先,制备二维片状MoS2和金纳米簇AuNCs,通过Au-S键将MoS2/AuNCs纳米复合材料修饰到金电极表面;其次,利用吸附作用将微囊藻毒素抗体修饰到电极表面,抗体与抗原发生特异性结合;再次,制备Au@Pt核壳纳米材料及其标记的抗体,在目标物MC-LR存在下,Au@Pt标记抗体催化底液中的H2O2和HQ,实现电化学响应信号的放大。根据电化学信号的增强实现对标准溶液或样品溶液中MC-LR浓度的定量测定。
2. 一种检测微囊藻毒素MC-LR的电化学方法,其特征在于,电化学免疫传感器的制备包括如下步聚:
(1)二维片状二硫化钼(MoS2)纳米材料的制备:
采用水热法制备MoS2,称取90 mg钼酸钠和180 mg硫代乙酰胺加入60 mL蒸馏水中,加入0.5 mL 1 M NaOH调节溶液呈碱性,转移到100 mL的反应釜中,在220℃下反应48 h,冷却至室温,用去离子水和乙醇洗涤,离心后收集沉淀物,在80℃下真空干燥12 h,得到MoS2纳米材料,储存备用;
(2)金纳米簇(AuNCs)的制备:
采用牛血清白蛋白介导法合成AuNCs,玻璃仪器需先在王水浸泡,洗净干燥,37℃下将10 mL 5 mM HAuCl4与5 mL 50 mg/mL牛血清白蛋白(BSA)混合搅拌5分钟,BSA与氯金酸离子相互作用,将氯金酸离子包覆于蛋白内部,加入0.5 mL 1 M NaOH调节溶液呈碱性,增强BSA的还原性,37℃下搅拌反应12 h还原氯金酸,制得红色荧光AuNCs溶液,储存备用;
(3)金-铂核壳(Au@Pt)纳米材料的制备:
采用种子生长法制备Au@Pt核壳纳米材料,首先采用柠檬酸钠还原法制备金纳米粒子(AuNPs)种子溶液(19 nm),之后取一定量的AuNPs种子溶液与10 mL 1 mM H2PtCl6溶液在圆底烧瓶(100 mL)中搅匀,80℃下恒温油浴,缓慢滴加(10滴/min)5 mL 10 mM抗坏血酸溶液,恒温回流反应 30 min,得到Au@Pt核壳纳米材料;
(4)Au@Pt标记微囊藻毒素抗体(anti-MC-LR)的制备:
将步聚(3)制得的Au@Pt核壳纳米材料与1 mL 100ug/L的微囊藻毒素抗体(anti-MC-LR)混合,25℃下恒温反应24 h,离心,用0.02 M pH 7.5 PBS洗涤,透析12 h,得到Au@Pt标记的抗体(Au@Pt-anti-MC-LR);
(5)电化学免疫传感器的制备:
将工作电极金电极在piranha溶液中浸泡1 h,超纯水清洗。然后分别用0.3um和0.05um的Al2O3抛光粉打磨,超声清洗。在0.5 M H2SO4溶液中,以50 mV/s的扫速在-0.2~1.6 V之间进行循环伏安扫描30圈,活化电极,N2气吹干备用。在电极表面分别固定步聚(1)和步聚(2)制得的MoS2和AuNCs,得到MoS2/AuNCs纳米复合材料修饰的金电极。电极表面固定MC-LR抗体后,抗体与MC-LR抗原特异性结合,抗原再与步聚(4)制得的二抗(Au@Pt-anti-MC-LR)结合,构建微囊藻毒素电化学免疫传感器。该传感器通过催化底液中的过氧化氢(H2O2)和氢醌(HQ),实现电化学响应信号的放大,完成对MC-LR的间接检测。
3. 微囊藻毒素MC-LR的电化学检测方法:
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,修饰的金电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为对电极,在0.1 M pH 7.5的PBS缓冲溶液(包含0.1 M KCl)中进行测试;
(2)采用微分脉冲伏安法(DPV)对微囊藻毒素进行检测,扫描电位范围为-0.4~0.1 V,扫描速率为0.1 V/s,扫描完成后记录峰电流的大小,并保存数据;
(3)根据所得DPV峰电流的大小与MC-LR浓度的关系,绘制工作曲线;
(4)采用标准加入法,在水样溶液中加入不同浓度的MC-LR标准溶液,按照工作曲线的绘制方法对不同浓度的MC-LR进行检测。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明采用MoS2/AuNCs纳米复合材料修饰电极,利用MoS2/AuNCs复合材料优异的导电性、大的比表面积和良好的生物相容性,进一步通过设计与利用Au@Pt标记抗体的电化学信号放大作用,实现了对MC-LR的高灵敏、特异性分析;
(2)本发明利用MC-LR抗原与抗体的特异性结合能力,大大提高了选择性,使得该电化学检测方法在具有相似结构干扰物质存在下能够选择性的识别出待测物质MC-LR;
(3)与传统检测MC-LR的方法相比,本发明所建立的方法利用了高灵敏的电化学分析技术与高特异性抗原-抗体识别能力的结合,实现了水样中痕量MC-LR的超灵敏、高特异性的检测,且所用仪器设备价廉,方法简单易行,可以快速得到结果。
附图说明
图1为基于MoS2/AuNCs纳米复合材料及Au@Pt标记抗体信号放大技术构建微囊藻毒素电化学免疫传感器的原理示意图;
图2为检测MC-LR的标准曲线图,横坐标为MC-LR的浓度(单位是ug/L),纵坐标为DPV峰电流(单位是uA)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作详细说明,但不构成对发明的进一步限制。
如图1所示,一种检测微囊藻毒素的电化学免疫传感器,以金电极为工作电极,依次修饰或固定MoS2纳米材料、AuNCs纳米材料、MC-LR抗体、BSA封闭、MC-LR抗原和Au@Pt标记抗体,构建的MC-LR电化学免疫传感器在H2O2和HQ底液中实现电化学响应信号的放大,根据电化学信号的增强实现对标准溶液或样品溶液中MC-LR浓度的间接测定。
实施例1
片状MoS2纳米材料的制备:
采用水热法制备MoS2,称取90 mg钼酸钠和180 mg硫代乙酰胺置于60 mL蒸馏水中,加入0.5 mL 1 M NaOH调节溶液呈碱性,转移到100 mL的反应釜中,在220℃下水热反应48 h,冷却至室温,用去离子水和乙醇多次洗涤,离心收集沉淀物,在80℃下真空干燥12 h,得到MoS2纳米材料,储存备用。
实施例2
AuNCs的制备:
采用牛血清白蛋白介导法合成AuNCs,合成过程温和无毒,且产物量子产率有较大提高。合成所需玻璃仪器先在王水中浸泡,用去离子水洗净,干燥备用。37℃下将10 mL 5 mMHAuCl4与5 mL 50 mg/mL牛血清白蛋白(BSA)混合,搅拌5分钟,BSA与氯金酸离子相互作用,将氯金酸离子包覆于蛋白内部,之后加入0.5 mL 1 M NaOH调节溶液呈碱性,增强BSA中的氨基酸残基的还原能力。37℃下搅拌反应12 h,还原氯金酸,制得红色荧光AuNCs溶液,储存备用。
实例3
Au@Pt核壳纳米材料的制备:
采用种子生长法制备Au@Pt核壳纳米材料。首先,采用柠檬酸钠还原法制备粒径为19nm的金纳米粒子(AuNPs)种子溶液。之后,取一定量的AuNPs种子溶液与10 mL 1 mM H2PtCl6溶液在100 mL圆底烧瓶中搅匀。80℃下恒温油浴,缓慢滴加(10滴/min)5 mL 10 mM抗坏血酸溶液,80℃下恒温回流 30 min,得到Au@Pt核壳纳米材料。
实施例4
Au@Pt标记抗体的制备:
将实施例3制得的Au@Pt核壳纳米材料与1 mL 100 ug/L的微囊藻毒素抗体(anti-MC-LR)混合,25℃下恒温反应24 h,离心分离,用0.02 M pH 7.5 PBS洗涤,透析12 h,得到Au@Pt标记的抗体(Au@Pt-anti-MC-LR)。
实施例5
电化学免疫传感器的制备:
首先,将工作电极金电极在piranha溶液中浸泡1 h,超纯水清洗。然后分别用0.3 um和0.05 um的Al2O3抛光粉打磨,超声清洗。在0.5 M H2SO4溶液中,以50 mV/s的扫速-0.2~1.6V之间进行循环伏安扫描30圈,活化电极,用N2气吹干备用。在电极表面分别固定实施例1和实施例2制得的MoS2和AuNCs纳米材料,得到MoS2/AuNCs纳米复合材料修饰的金电极。富含S的MoS2与粒径较小的AuNCs通过Au-S修饰到金电极表面,增强了电极的导电性及与抗体结合的位点。通过AuNCs对抗体的吸附作用,将MC-LR抗体修饰到纳米材料的表面,并以BSA为封闭剂防止非特异性吸附。电极表面固定的抗体与MC-LR抗原发生特异性结合。抗原再与实施例4制得Au@Pt标记抗体结合,构建微囊藻毒素电化学免疫传感器。在目标物MC-LR存在下,Au@Pt标记抗体催化底液中的H2O2和HQ,实现电化学响应信号的放大,完成对MC-LR的间接检测。
实施例6
微囊藻毒素MC-LR的检测:
使用电化学工作站以三电极体系进行测试,修饰的金电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为对电极。在0.1 M pH 7.5的PBS溶液(包含0.1 M KCl)中用微分脉冲伏安法(DPV)对微囊藻毒素MC-LR进行检测。设置扫描电位范围为-0.4~0.1 V,扫描速率为0.1 V/s,扫描完成后记录峰电流的大小,并保存数据。根据所得DPV峰电流的大小与MC-LR浓度的关系,绘制标准曲线如图2所示。峰电流与MC-LR浓度在1ug/L ~ 1000ug/L范围内呈现良好的线性关系,相关系数R为0.9970,线性方程为I (uA) = 2.49lgc (uM) + 7.76,检出限为0.3 ng/L。本发明提出的电化学免疫传感器相比较其他检测方法,具有更宽的线性范围和更低的检出限。采用一种基于纳米材料及Au@Pt标记抗体的信号放大技术构建电化学免疫传感器实现微囊藻毒素的检测。
实施例7
样品测定:
用待测样品溶液代替微囊藻毒素标准溶液,采用标准加入法,按照标准曲线方法对样品溶液中的微囊藻毒素MC-LR进行测定。测定结果表明,检测结果与加入的MC-LR标准溶液浓度一致,具有满意的回收率和相对标准偏差,本发明制备的电化学免疫传感器能用于实际样品中MC-LR的测定。
上面结合附图对本发明实施例进行了说明,但本发明不限于上述实施例,还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化,凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,只要符合本发明的发明目的,只要不背离本发明基于纳米复合材料及核壳纳米材料标记抗体的信号放大技术构建微囊藻毒素电化学免疫传感器的原理和制备方法,都属于本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种检测微囊藻毒素的电化学方法,其特征在于,该方法包括以下步聚:
(1)制备二维片状二硫化钼(MoS2)纳米材料;
(2)制备金纳米簇(AuNCs);
(3)制备Au@ Pt核-壳纳米材料及其标记的微囊藻毒素抗体(anti-MC-LR);
(4)在金电极表面修饰MoS2/AuNCs纳米复合材料;
(5)在电极表面修饰微囊藻毒素抗体(anti-MC-LR);
(6)电极表面的微囊藻毒素抗体与抗原结合,再与Au@Pt标记的抗体结合,通过放大的电化学信号实现对微囊藻毒素的测定。
2.根据权利要求1所述的一种检测微囊藻毒素的电化学方法,其特征在于,采用MoS2/AuNCs纳米复合材料。
3.根据权利要求1所述的一种检测微囊藻毒素的电化学方法,其特征在于,采用Au@Pt核-壳纳米材料标记微囊藻毒素抗体。
4. 根据权利要求1所述的一种检测微囊藻毒素的电化学方法,其特征在于,采用直径为3 mm的金电极作为工作电极。
5. 根据权利要求1所述的一种检测微囊藻毒素的电化学方法,其特征在于,所述电化学检测方法为微分脉冲伏安法,测试液为含有4 mM对苯二酚和5 mM H2O2的0.1 M pH 7.5PBS缓冲液。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20170818 |
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