CN103604926A - 一种免疫层析试纸条检测微囊藻毒素-lr的方法 - Google Patents

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Abstract

一种免疫层析试纸条检测微囊藻毒素-LR的方法，免疫分析化学技术领域。通过一步制备法制得具有中空结构的Au NCs，将其标记到Anti MC-LR上制得金纳米笼-微囊藻毒素抗体结合物，将BSA偶联的微囊藻毒素-LR、IgG分别喷涂于硝酸纤维素膜上作检测线以及控制线制得免疫层析片条；利用竞争免疫层析法，通过读取检测线上滞留的金纳米笼-微囊藻毒素抗体结合物的灰度值，对试样中微囊藻毒素-LR进行定量分析。不但克服了试纸条技术中金溶胶不易保存的缺点，而且操作简单，抗体的修饰需要的时间较短。

Description

一种免疫层析试纸条检测微囊藻毒素-LR的方法
  
技术领域
  本发明属免疫分析化学技术领域。 
背景技术
人类的生活和产业活动向湖泊等水体的排污日益增多，导致水体富营养化，藻类异常增殖，释放次级代谢物藻毒素，特别是微囊藻毒素，从而严重危害自然生态环境。对水体进行环境保护迫切需要开发简便高效的微囊藻毒素检测方法。 
免疫层析技术作为一种新技术最早可追溯到上世纪五十年代。1957年Kohn报道了一种新的免疫电泳技术即免疫层析技术的最初形式，并在1958年尝试用此技术分离一种已知蛋白质跟一种未知蛋白质，得到了优于琼脂扩散电泳的分离方法。该技术的基本原理是以条状的微孔膜(多为硝酸纤维素膜)为固相载体，通过毛细作用使待检样品溶液在纤维层析条上移动，同时使样品中的待检物与层析材料上针对待检物的受体(如抗体或抗原)发生高特异性、高亲和性的免疫反应，在层析反应的过程中免疫复合物被滞留或富集在层析材料上包被有捕获剂的检测区域，通过酶反应显色或直接运用可目测的标记物（如胶体金、乳胶颗粒等）而对待检测物中受体进行定性或定量的检测。 
金纳米结构材料由于其独特的光学和光热性质，在生命科学的各个领域有着巨大的应用潜力。近几年来，对于金纳米结构材料的研究取得了长足的进步。生物医学领域应用较为广泛的金纳米结构材料包括金纳米球、金纳米棒、core-shell结构的SiO2-Au和金纳米笼等。目前，免疫层析技术中常用的着色标记物金纳米颗粒溶胶存在不易保存的缺点。 
申请号为200910035793.X的中国专利文件公布了“一种基于金纳米棒端面自组装检测微囊藻毒素-LR的方法”，其技术方案是以金纳米棒的端面与微囊藻毒素包被原及抗微囊藻毒素抗体分别偶联形成金纳米棒的探针，利用合成的金纳米棒探针与微囊藻毒素-LR进行免疫反应从而由于金纳米棒端面的抗原抗体反应形成纳米链，通过纳米链的粒径的变化检测微囊藻毒素-LR。申请号为201010284685.9的中国专利文件公布了“用拉曼光谱在金纳米棒端面自组装介导下检测微囊藻毒素的方法”，其技术方案是以金纳米棒的端面与微囊藻毒素的包被原及抗微囊藻毒素的抗体分别偶联形成金纳米棒的探针，利用合成的金纳米棒探针进行免疫反应从而由于金纳米棒端面的抗原抗体反应形成纳米链，组装形成的纳米链长度的不同使拉曼信号强度不同，通过拉曼信号的变化检测MC-LR含量。上述已公开技术方案的不足之处是操作还不够简单，抗体的修饰所需要的时间较长。 
金纳米笼(Au NCs)材料拥有巨大比表面积以及良好的生物相容性，且在水溶液中分布稳定自身有一定的颜色显现，但金纳米笼在免疫层析试纸条上的应用迄今未见报道。 
发明内容
本发明的目的是克服目前常用着色标记物金纳米颗粒溶胶不易保存的缺点，提供一种免疫层析试纸条检测微囊藻毒素-LR的方法，其操作简单，抗体的修饰需要的时间较短。 
本发明采用金纳米笼（Au NCs）替代金纳米颗粒溶胶标记微囊藻毒素-LR单克隆抗体(Anti MC-LR)制得免疫标记物，将其喷涂到免疫层析试纸条的结合垫上，通过竞争免疫法可实现对微囊藻毒素-LR的定量检测。 
本发明方法按如下步骤： 
1、通过一步制备法制得具有中空结构的Au NCs，将其标记到Anti MC-LR上制得金纳米笼-微囊藻毒素抗体结合物，标记过程为：将总量为8～12 μL的 Anti MC-LR加入浓缩后pH =9的0.25 mL Au NCs溶液中，于20～26℃反应2 ～2.5 h，将含2.5克BSA（牛血清白蛋白）的水溶液加入上述混合液中反应0.4~0.6h、以封闭Au NCs的多余结合位点，低于10°℃高速离心不少于10 min，弃上清液，用PBS缓冲液分散清洗，最后分散在0.9～1.1mL洗脱液中得到Au NCs – Anti MC-LR溶液，于4 °C保存备用；
2、将BSA偶联的微囊藻毒素-LR、IgG（羊抗鼠免疫球蛋白）分别喷涂于硝酸纤维素膜上作检测线（T线）以及控制线（C线）制得免疫层析片条；
3、利用竞争免疫层析法，通过读取检测线上滞留的金纳米笼-微囊藻毒素抗体结合物的灰度值，对试样中微囊藻毒素-LR进行定量分析。
上述步骤1所说一步制备法为现有技术，例如可见：Zhang Y, Sun Y J, Li Z, et al. Au nanocages for highly sensitive and selective detection of H2O2[J]. J. Electroanal. Chem., 2011, 656(1-2): 23-28。 
优选地，上述步骤1所说用PBS缓冲液分散清洗为：用0.01 mol/L PBS分散清洗两至三次。 
优选地，上述步骤1所说洗脱液中：Na3PO4·12H2O 的浓度为20 mmol/L ，BSA 的重量百分浓度为5%, Tween -20的重量百分浓度为0.25%，蔗糖的重量百分浓度为10%。 
优选地，制备免疫层析片条时，将条状样品垫浸泡于样品垫处理液中28～32min后于37 ℃～38 ℃ 烘干备用， 样品垫处理液中Triton X-100的重量百分浓度为0.25%，Tris–HCl的浓度为0.05 mol/L，NaCl的浓度为0.15 mmol/L。 
优选地，检测线与控制线之间的距离为3.0 mm～3.2 mm。 
优选地，以PBS+Tween-20+BSA为测试底液。 
优选地，T线喷涂两次。 
优选地，每次测试时滴加的金纳米笼标记单克隆抗体量为2 μL。 
优选地，使用硝酸纤维素膜HF135。 
本发明利用金纳米笼巨大的比表面积以及良好的生物相容性，对微囊藻毒素-LR单克隆抗体进行标记，然后利用竞争法免疫层析试纸条对微囊藻毒素-LR进行定性定量检验分析。在试纸条上，可通过颜色聚集进行直观的定性分析；借助试纸条图像分析仪可对其进行定量分析。 
以下是工艺条件的优化试验： 
1、测试底液对检测结果影响
根据相似相溶原理，不同溶剂对展开效果有不同的影响。选取PBS、PBS+BSA、PBS+Tween-20、PBS+Tween-20+BSA、蒸馏水五种不同的溶剂体系进行试验，结果见图1。由图1可以看出PBS+Tween-20+BSA对检测效果最好，所以选取PBS+Tween-20+BSA为测试底液。 
2 、检测线喷涂次数对检测结果的影响 
检测线喷涂的是0.2 mg/m L的BSA偶联微囊藻毒素-LR溶液，因为喷涂次数的不同，吸附在硝酸纤维素膜上的BSA-MC-LR总量有很大的影响，进而对目标物竞争性吸附有很大的影响。因此，选取同一批次制作的，且在检测线喷涂不同次数的片条对同一浓度的标准浓度微囊藻毒素-LR溶液进行了试验，结果见图2。由图2可以看出，喷涂次数在2次以上时对检测结果的影响基本一致，所以考虑到试验成本，选取T线喷涂两次最佳。
3 、金纳米笼标记单克隆抗体用量的影响 
考察了金纳米笼标记单克隆抗体(Au NCs-Anti MC-LR conjugates)在片条的金胶结合垫上的滴加量对检测结果的影响，选取同一批次制作的且在T线喷涂2次的片条，滴加不同金标量对同一浓度标准溶液进行检测。结果见图3。由图3可知，在金纳米笼标记单克隆抗体量为2 μL以上时，检测灰度值达到最大，所以优选每次测试时滴加的金纳米笼标记单克隆抗体量为2 μL。
4、 硝酸纤维素膜的选择 
硝酸纤维素膜对溶剂的展开有很大的影响，选取了两种不同硝酸纤维素膜HF135和HF180制作片条，在相同试验条件下对同一浓度的标准溶液进行了对比检测试验，结果见表1。由表1可知使用HF135的硝酸纤维素膜的片条检测效果优于使用HF180的硝酸纤维素膜的片条。
  
表1 两种不同的硝酸纤维素膜检测结果对比
项目 HF135 HF180
检测线灰度值 535.63 221.05
控制线灰度值 132.71 196.43
本发明方法的积极效果：不但克服了试纸条技术中金溶胶不易保存的缺点，而且操作简单，抗体的修饰需要的时间较短。
附图说明
图1为不同的展开底液对检测结果的影响，纵坐标为峰面积，横坐标为底液名称。 
图2为检测线喷涂次数对检测结果的影响，纵坐标为峰面积，横坐标为检测线喷涂次数。 
图3金纳米笼-微囊藻毒素抗体结合物的用量对检测结果的影响，纵坐标为峰面积，横坐标为金纳米笼-微囊藻毒素抗体结合物的体积。 
图4为实施例的层析片条组装示意图。 
图5为实施例金纳米笼的透射电镜图。 
图6为实施例不同浓度的MC-LR的测试图片，5为检测线，6为控制线。 
图7为实施例免疫层析片条的校准曲线，纵坐标为峰面积，横坐标为微囊藻毒素浓度的对数值。 
具体实施方式
见图4～图7的实施例。 
1、 金纳米笼Au NCs的制备 
本实施例所涉及的金纳米笼按下述方法制备：在小锥形瓶内加入3mL 0.75 mmol/L HAuCl4溶液，然后加入3 mL 0.03 mol/L HMT溶液，振摇均匀。当溶液由亮黄色逐渐变浅至澄清时，加入3 mL 0.30 mol/L PVP和100μL 0.01mol/L AgNO3溶液。轻轻振摇后，快速加入50 μL 0.08 mol/L的抗坏血酸溶液。快速搅拌10s确保溶液混合均匀。将小瓶于室温条件下置于黑暗处12h，然后离心分离产物，并用水及乙醇清洗三到五次。所得产物避光4°C保存。实施例金纳米笼的透射电镜图见图5。
2 、金纳米笼标记单克隆抗体结合物的制备及纯化 
将所合成的金纳米笼用于标记单克隆抗体制得结合物（Au NCs- Anti MC-LR）。分五次将10 μL Anti MC-LR滴加到0.25 mL 经五倍浓缩过的Au NCs溶液（pH 9）中，每次间隔三分钟，滴加完成后，室温振摇2 h。然后将25 μL BSA (10 %)滴加进混合溶液中继续振摇0.5 h封闭Au NCs的多余的结合位点。随后以13000 r/min转速，低温离心 10 min，弃去上清液，用0.01 mol/L PBS分散清洗两次，最后分散在1mL洗脱液（20 mmol/L Na3PO4·12H2O, 5% BSA, 0.25% Tween 20,和 10%蔗糖）中。获得的Au NCs – Anti MC-LR溶液4 °C保存备用。
3 、免疫层析试纸条的制备 
样品垫GF-08裁剪成16 mm× 30 cm长条，浸泡于预先配制好的样品垫处理液中，30min后烘干备用（样品垫处理液为：500mL中含Triton X-100 1.25克，Tris–HCl 0.025 mol，NaCl 0.075 mmol）。将玻璃纤维的金胶结合垫裁剪成0.8~1.0cm×30cm长条，同时将吸收垫裁剪成1.7cm×30cm长条备用。
选取不同的硝酸纤维素膜Millipore 135或Millipore 180在喷条机Biodot XYZ3060上进行喷片操作。将羊抗鼠IgG稀释成2mg/mL后用喷片机喷涂在距硝酸纤维素膜边缘1cm处做为控制线（C线），然后将BSA偶联的微囊藻毒素-LR稀释成0.2 mg/mL喷涂在距硝酸纤维素膜另一边1cm处作为检测线（T线），喷涂不同次数时,每次都要在37℃烘干后再喷涂。最后喷涂完成后37℃烘干2h。去掉PVC底板上的贴纸，将喷涂好的硝酸纤维素膜C线向上贴于底板中间位置，然后将金胶结合垫至少有2mm压在硝酸纤维素膜T线一边并贴在底板上，将烘干的样品垫一边紧靠底板边缘，一边压在金胶垫上贴在底板上，将吸收垫一边紧靠底板另一边有2到3mm压在硝酸纤维素膜C线一边贴在底板上。将贴好的片条放入压片机中压30min, 即可用切片机将整个片条切成2mm或3mm宽的小片条使用。图4为片条组装示意图，其中1为样品垫，2为硝酸纤维素膜，3为PVC底板，4为吸收垫，5为检测线（T线），6为控制线（C线），7为金胶结合垫。 
4、样品的测定 
图6为实施例不同浓度的MC-LR的测试图片，5为检测线，6为控制线。
测试之前将2 μL Au NCs-Anti MC-LR滴在金胶结合垫上并干燥5min。将囊藻毒素-LR用PBS缓冲溶液（0.01 mol/L PBS 和 0.05 % Tween-20以及1% BSA）配制成不同浓度的标准溶液，各取80μL，将片条放入溶液中展开15min。溶液中的微囊藻毒素-LR流动到金胶结合垫上带动着金纳米笼标记的微囊藻毒素-LR单克隆抗体（Au NCs-Anti MC-LR）一起流动到T线上，此时T线上固定的BSA偶联的微囊藻毒素-LR与溶液中的MC-LR竞争结合Au NCs-Anti MC-LR，一部分Au NCs-Anti MC-LR会被捕获在T线上。Au NCs-Anti MC-LR结合溶液中抗原（MC-LR）形成Au NCs-Anti MC-LR-MC-LR免疫复合物继续流动，到固定有羊抗鼠IgG的C线上被捕获。此时，再加入30μL PBS冲洗片条。在片条上直观的看到T线或C线上有带颜色的物质被捕获。将片条放入读条机中，即可用读取片条上T/C线的灰度值。测试溶液中微囊藻毒素-LR的含量越高，竞争结合Au NCs-Anti MC-LR的可能性越大，则T线上结合Au NCs-Anti MC-LR的可能性就越低，颜色越浅。与此相反，固定有羊抗鼠IgG的C线捕获免疫复合物（Au NCs-Anti MC-LR）的可能性越大，颜色越深。根据不同标准浓度的溶液对应着不同灰度值，即可获得检测微囊藻毒素-LR的标准校正曲线，即图7所示免疫层析片条在最优条件下所获得的校准曲线，进而实现对未知水样中的微囊藻毒素-LR进行定量分析。 

Claims (9)

1.一种免疫层析试纸条检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于按如下步骤：
（1）、通过一步制备法制得具有中空结构的Au NCs，将其标记到Anti MC-LR上制得金纳米笼-微囊藻毒素抗体结合物，标记过程为：将总量为8～12 μL的 Anti MC-LR加入浓缩后pH =9的0.25 mL Au NCs溶液中，于20～26℃反应2 ～2.5 h，将含2.5克BSA（牛血清白蛋白）的水溶液加入上述混合液中反应0.4~0.6h、以封闭Au NCs的多余结合位点，低于10°℃高速离心不少于10 min，弃上清液，用PBS缓冲液分散清洗，最后分散在0.9～1.1mL洗脱液中得到Au NCs – Anti MC-LR溶液，于4 °C保存备用；
（2）、将BSA偶联的微囊藻毒素-LR、IgG分别喷涂于硝酸纤维素膜上作检测线以及控制线制得免疫层析片条；
（3）、利用竞争免疫层析法，通过读取检测线上滞留的金纳米笼-微囊藻毒素抗体结合物的灰度值，对试样中微囊藻毒素-LR进行定量分析。
2.如权利要求1所说的免疫层析试纸条检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于步骤1所说用PBS缓冲液分散清洗为：用0.01 mol/L PBS分散清洗两至三次。
3.如权利要求1所说的免疫层析试纸条检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于步骤1所说洗脱液中：Na3PO4·12H2O 的浓度为20 mmol/L ，BSA 的重量百分浓度为5%, Tween -20的重量百分浓度为0.25%，蔗糖的重量百分浓度为10%。
4.如权利要求1所说的免疫层析试纸条检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于：制备免疫层析片条时，将条状样品垫浸泡于样品垫处理液中28～32min后于37 ℃～38 ℃ 烘干备用， 样品垫处理液中Triton X-100的重量百分浓度为0.25%，Tris–HCl的浓度为0.05 mol/L，NaCl的浓度为0.15 mmol/L。
5.如权利要求1所说的免疫层析试纸条检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于：检测线与控制线之间的距离为3.0 mm～3.2 mm。
6.如权利要求1所说的免疫层析试纸条检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于：以PBS+Tween-20+BSA为测试底液。
7.如权利要求1所说的免疫层析试纸条检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于T线喷涂两次。
8.如权利要求1所说的免疫层析试纸条检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于：每次测试时滴加的金纳米笼标记单克隆抗体量为2 μL。
9.如权利要求1所说的免疫层析试纸条检测微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于使用硝酸纤维素膜HF135。
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