CN104849454A - 一种基于金纳米笼/氨基化石墨烯构建禽类疱疹病毒抗原免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
<b/>本发明涉及一种基于金纳米笼/氨基化石墨烯构建禽类疱疹病毒抗原免疫传感器的制备方法及应用，属于新型功能材料、生物传感检测技术领域。具体是基于金纳米笼和氨基化石墨烯复合材料制备出夹心型电化学免疫传感器。氨基化石墨烯具有较高的比表面积、金纳米笼具有优良的催化性能，该复合材料生物相容性好，催化效率高，可显著提高免疫传感器的灵敏度和稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于金纳米笼/氨基化石墨烯构建禽类疱疹病毒抗原免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用具有较大比表面积和较好催化效果的金纳米笼/氨基化石墨烯复合材料，制备一种检测禽类疱疹病毒抗原的电化学免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
背景技术
目前石墨烯由于其独特的结构和优异的电学、力学以及光学等性能，在物理、化学、材料乃至生物领域备受关注。石墨烯具有良好的生物相容性和较大的比表面积可用作生物传感器、支架材料、药物载体等，已成为纳米生物学领域的研究热点；对其进行氨基功能化，不仅可以提高其水溶性，而且可以负载更多的贵金属材料，用其作为金纳米笼的载体。金纳米笼具有较好的催化性能，将金纳米笼和氨基功能化的石墨烯复合，来作为禽类疱疹病毒抗原检测抗体的标记物，达到检测禽类疱疹病毒抗原的目的，该方法具有成本低、操作简单、特异性强、检测快速等特点。
发明内容
本发明的目的之一是基于金纳米笼/氨基化石墨烯禽类疱疹病毒抗原免疫传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将该电化学免疫传感器应用于禽类疱疹病毒抗原的检测。
本发明的技术方案
1．一种基于金纳米笼/氨基化石墨烯构建禽类疱疹病毒抗原免疫传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的三氧化二铝抛光粉对玻碳电极抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV；
（2）以2 mL质量分数为1%的HAuCl4为底液，在电压为-0.2V下扫描30s，得到电沉积金纳米粒子的电极；
（3）滴加6 μL、5~10 μg/mL的禽类疱疹病毒抗原捕获抗体Ab1，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（4）继续滴加3 μL、质量分数为0.2~1%的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（5）继续滴加6 μL的一系列不同浓度的禽类疱疹病毒抗原溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（6）继续滴加4~6 μL检测抗体孵化物—金纳米笼/氨基化石墨烯-Ab2溶液至电极表面，置于4℃冰箱中孵化1 h，清洗后，晾干，制得一种基于金纳米笼/氨基化石墨烯构建禽类疱疹病毒抗原免疫传感器。
2．检测抗体孵化物—金纳米笼/氨基化石墨烯-Ab2溶液的制备
（1）银纳米立方体的制备
将5 mL的无水乙二醇置于烧瓶中，160℃下加热1 h，在搅拌下，将1~5 mL、0.25 mol/L AgNO3的乙二醇溶液和3 mL、0.19 mol/L聚乙烯吡咯烷酮的乙二醇溶液同时加入到烧瓶中，继续反应40 min，冷却至室温，用乙醇和超纯水洗涤后重新分散到超纯水中，得到银纳米立方体的溶液；
（2）金纳米笼的制备
取50~200 μL银纳米立方体溶液加入到5 mL的超纯水中，100℃下回流10 min，搅拌下将0.05~2 mL、1 m mol/L的HAuCl4水溶液逐滴加入，继续反应20 min，直到溶液的颜色稳定，冷却到室温，加入饱和NaCl来除去AgCl固体，以10000 rpm转速离心分离15 min，用水洗涤数次后，将其重新分散到超纯水中，得到金纳米笼的溶液；
（3）检测抗体标记物—金纳米笼/氨基化石墨烯的制备
分别将15~25 mg的氨基化石墨烯分散到10~40 mL的金纳米笼的溶液中，室温下震荡12 h；混合物经洗涤、离心分离、35℃下真空干燥，制得金纳米笼/氨基化石墨烯；
（4）检测抗体孵化物—金纳米笼/氨基化石墨烯-Ab2溶液的制备
将1~3 mg的金纳米笼/氨基化石墨烯分散于1 mL超纯水中，加入1 mL、8~12 μg/mL的检测抗体溶液，在4℃下振荡孵化12 h，离心分离，将下层沉淀加入至1 mL、1/15 mol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中，制得检测抗体孵化物—金纳米笼/氨基化石墨烯-Ab2溶液，4℃下保存备用。
3．禽类疱疹病毒抗原的检测方法
（1）使用电化学工作站用三电极体系进行测定，将权利要求1所制备的免疫传感器作为工作电极，饱和甘汞电极为对电极，铂丝电极为辅助电极，在pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中，采用时间-电流的方法进行扫描，输入电压为-0.4 V，运行时间400 s，记录电流变化；
（2）在10 mL，pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中对0.001~50 ng/mL的禽类疱疹病毒抗原标准溶液进行测试记录电流变化，根据所得电流差值与禽类疱疹病毒抗原的浓度成线性关系，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替禽类疱疹病毒抗原标准溶液进行检测。
本发明的有益成果
（1）电镀的金纳米粒子具有较好的导电性，以及良好的生物相容性和稳定性，另外，其能够结合大量的捕获抗体，提高了捕获抗体在其表面的负载量，增加了传感器灵敏度和稳定性。
（2）金纳米笼具有高的比表面积和良好的催化活性，将其和氨基化的石墨烯复合，能够使得金纳米笼均匀的分散在氨基化的石墨烯表面，氨基化的石墨烯较大的比表面积能够提高了金纳米笼在其表面的负载量，进而增加了和金纳米笼结合检测抗体的量。
（3）本发明制备的电化学免疫传感器用于禽类疱疹病毒抗原的检测，响应时间短，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测。
具体实施方式
实施例1禽类疱疹病毒抗原免疫传感器的制备
（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的三氧化二铝抛光粉对玻碳电极抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV；
（2）以2 mL质量分数为1%的HAuCl4为底液，在电压为-0.2V下扫描30s，得到电沉积金纳米粒子的电极；
（3）滴加6 μL、5 μg/mL的禽类疱疹病毒抗原捕获抗体Ab1，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（4）继续滴加3 μL、质量分数为0.2%的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（5）继续滴加6 μL的一系列不同浓度的禽类疱疹病毒抗原溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（6）继续滴加4 μL检测抗体孵化物—金纳米笼/氨基化石墨烯-Ab2溶液至电极表面，置于4℃冰箱中孵化1 h，清洗后，晾干，制得一种基于金纳米笼/氨基化石墨烯构建禽类疱疹病毒抗原免疫传感器。
实施例2禽类疱疹病毒抗原免疫传感器的制备
（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的三氧化二铝抛光粉对玻碳电极抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV；
（2）以2 mL质量分数为1%的HAuCl4为底液，在电压为-0.2V下扫描30s，得到电沉积金纳米粒子的电极；
（3）滴加6 μL、7 μg/mL的禽类疱疹病毒抗原捕获抗体Ab1，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（4）继续滴加3 μL、质量分数为0.5%的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（5）继续滴加6 μL的一系列不同浓度的禽类疱疹病毒抗原溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（6）继续滴加5 μL检测抗体孵化物—金纳米笼/氨基化石墨烯-Ab2溶液至电极表面，置于4℃冰箱中孵化1 h，清洗后，晾干，制得一种基于金纳米笼/氨基化石墨烯构建禽类疱疹病毒抗原免疫传感器。
实施例3 禽类疱疹病毒抗原免疫传感器的制备
（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的三氧化二铝抛光粉对玻碳电极抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV；
（2）以2 mL质量分数为1%的HAuCl4为底液，在电压为-0.2V下扫描30s，得到电沉积金纳米粒子的电极；
（3）滴加6 μL、10 μg/mL的禽类疱疹病毒抗原捕获抗体Ab1，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（4）继续滴加3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（5）继续滴加6 μL的一系列不同浓度的禽类疱疹病毒抗原溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（6）继续滴加6 μL检测抗体孵化物—金纳米笼/氨基化石墨烯-Ab2溶液至电极表面，置于4℃冰箱中孵化1 h，清洗后，晾干，制得一种基于金纳米笼/氨基化石墨烯构建禽类疱疹病毒抗原免疫传感器。
实施例4 检测抗体孵化物—金纳米笼/氨基化石墨烯-Ab2溶液的制备
（1）银纳米立方体的制备
将5 mL的无水乙二醇置于烧瓶中，160℃下加热1 h，在搅拌下，将1 mL、0.25 mol/L AgNO3的乙二醇溶液和3 mL、0.19 mol/L聚乙烯吡咯烷酮的乙二醇溶液同时加入到烧瓶中，继续反应40 min，冷却至室温，用乙醇和超纯水洗涤后重新分散到超纯水中，得到银纳米立方体的溶液；
（2）金纳米笼的制备
取50 μL银纳米立方体溶液加入到5 mL的超纯水中，100℃下回流10 min，搅拌下将0.05 mL、1 mmol/L的HAuCl4水溶液逐滴加入，继续反应20 min，直到溶液的颜色稳定，冷却到室温，加入饱和NaCl来除去AgCl固体，以10000 rpm转速离心分离15 min，用水洗涤数次后，将其重新分散到超纯水中，得到金纳米笼的溶液；
（3）检测抗体标记物—金纳米笼/氨基化石墨烯的制备
分别将15 mg的氨基化石墨烯分散到10 mL的金纳米笼的溶液中，室温下震荡12 h；混合物经洗涤、离心分离、35℃下真空干燥，制得金纳米笼/氨基化石墨烯；
（4）检测抗体孵化物—金纳米笼/氨基化石墨烯-Ab2溶液的制备
将1 mg的金纳米笼/氨基化石墨烯分散于1 mL超纯水中，加入1 mL、8 μg/mL的检测抗体溶液，在4℃下振荡孵化12 h，离心分离，将下层沉淀加入至1 mL、1/15 mol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中，制得检测抗体孵化物—金纳米笼/氨基化石墨烯-Ab2溶液，4℃下保存备用。
实施例5 检测抗体孵化物—金纳米笼/氨基化石墨烯-Ab2溶液的制备
（1）银纳米立方体的制备
将5 mL的无水乙二醇置于烧瓶中，160℃下加热1 h，在搅拌下，将3 mL、0.25 mol/L AgNO3的乙二醇溶液和3 mL、0.19 mol/L聚乙烯吡咯烷酮的乙二醇溶液同时加入到烧瓶中，继续反应40 min，冷却至室温，用乙醇和超纯水洗涤后重新分散到超纯水中，得到银纳米立方体的溶液；
（2）金纳米笼的制备
取100 μL银纳米立方体溶液加入到5 mL的超纯水中，100℃下回流10 min，搅拌下将1 mL、1 mmol/L的HAuCl4水溶液逐滴加入，继续反应20 min，直到溶液的颜色稳定，冷却到室温，加入饱和NaCl来除去AgCl固体，以10000 rpm转速离心分离15 min，用水洗涤数次后，将其重新分散到超纯水中，得到金纳米笼的溶液；
（3）检测抗体标记物—金纳米笼/氨基化石墨烯的制备
分别将20 mg的氨基化石墨烯分散到30 mL的金纳米笼的溶液中，室温下震荡12 h；混合物经洗涤、离心分离、35℃下真空干燥，制得金纳米笼/氨基化石墨烯；
（4）检测抗体孵化物—金纳米笼/氨基化石墨烯-Ab2溶液的制备
将2 mg的金纳米笼/氨基化石墨烯分散于1 mL超纯水中，加入1 mL、10 μg/mL的检测抗体溶液，在4℃下振荡孵化12 h，离心分离，将下层沉淀加入至1 mL、1/15 mol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中，制得检测抗体孵化物—金纳米笼/氨基化石墨烯-Ab2溶液，4℃下保存备用。
实施例6 检测抗体孵化物—金纳米笼/氨基化石墨烯-Ab2溶液的制备
（1）银纳米立方体的制备
将5 mL的无水乙二醇置于烧瓶中，160℃下加热1 h，在搅拌下，将5 mL、0.25 mol/L AgNO3的乙二醇溶液和3 mL、0.19 mol/L聚乙烯吡咯烷酮的乙二醇溶液同时加入到烧瓶中，继续反应40 min，冷却至室温，用乙醇和超纯水洗涤后重新分散到超纯水中，得到银纳米立方体的溶液；
（2）金纳米笼的制备
取200 μL银纳米立方体溶液加入到5 mL的超纯水中，100℃下回流10 min，搅拌下将2 mL、1 m mol/L的HAuCl4水溶液逐滴加入，继续反应20 min，直到溶液的颜色稳定，冷却到室温，加入饱和NaCl来除去AgCl固体，以10000 rpm转速离心分离15 min，用水洗涤数次后，将其重新分散到超纯水中，得到金纳米笼的溶液；
（3）检测抗体标记物—金纳米笼/氨基化石墨烯的制备
分别将25 mg的氨基化石墨烯分散到40 mL的金纳米笼的溶液中，室温下震荡12 h；混合物经洗涤、离心分离、35℃下真空干燥，制得金纳米笼/氨基化石墨烯；
（4）检测抗体孵化物—金纳米笼/氨基化石墨烯-Ab2溶液的制备
将3 mg的金纳米笼/氨基化石墨烯分散于1 mL超纯水中，加入1 mL、12 μg/mL的检测抗体溶液，在4℃下振荡孵化12 h，离心分离，将下层沉淀加入至1 mL、1/15 mol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中，制得检测抗体孵化物—金纳米笼/氨基化石墨烯-Ab2溶液，4℃下保存备用。
实施例7 禽类疱疹病毒抗原的检测
（1）使用电化学工作站用三电极体系进行测定，将权利要求1所制备的免疫传感器作为工作电极，饱和甘汞电极为对电极，铂丝电极为辅助电极，在pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中，采用时间-电流的方法进行扫描，输入电压为-0.4 V，运行时间400 s，记录电流变化；
（2）在10 mL，pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中对0.001~50 ng/mL的禽类疱疹病毒抗原标准溶液进行测试记录电流变化，根据所得电流差值与禽类疱疹病毒抗原的浓度成线性关系，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替禽类疱疹病毒抗原标准溶液进行检测，测得线性范围为0.001~50 ng/mL，检测限为0.31 pg/mL。
Claims (3)
1.一种基于金纳米笼/氨基化石墨烯构建禽类疱疹病毒抗原免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）依次用1.0、0.3、0.05 μm的三氧化二铝抛光粉对玻碳电极抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV；
（2）以2 mL质量分数为1%的HAuCl4为底液，在电压为-0.2V下扫描30s，得到电沉积金纳米粒子的电极；
（3）滴加6 μL、5~10 μg/mL的禽类疱疹病毒抗原捕获抗体Ab1，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（4）继续滴加3 μL、质量分数为0.2~1%的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（5）继续滴加6 μL的一系列不同浓度的禽类疱疹病毒抗原溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（6）继续滴加4~6 μL检测抗体孵化物—金纳米笼/氨基化石墨烯-Ab2溶液至电极表面，置于4℃冰箱中孵化1 h，清洗后，晾干，制得一种基于金纳米笼/氨基化石墨烯构建禽类疱疹病毒抗原免疫传感器。
2.如权利要求1所述的一种基于金纳米笼/氨基化石墨烯构建禽类疱疹病毒抗原免疫传感器的制备方法，所述检测抗体孵化物—金纳米笼/氨基化石墨烯-Ab2溶液的制备，其特征在于，包括以下步骤：
（1）银纳米立方体的制备
将5 mL的无水乙二醇置于烧瓶中，160℃下加热1 h，在搅拌下，将1~5 mL、0.25 mol/L AgNO3的乙二醇溶液和3 mL、0.19 mol/L聚乙烯吡咯烷酮的乙二醇溶液同时加入到烧瓶中，继续反应40 min，冷却至室温，用乙醇和超纯水洗涤后重新分散到超纯水中，得到银纳米立方体的溶液；
（2）金纳米笼的制备
取50~200 μL银纳米立方体溶液加入到5 mL的超纯水中，100℃下回流10 min，搅拌下将0.05~2 mL、1 m mol/L的HAuCl4水溶液逐滴加入，继续反应20 min，直到溶液的颜色稳定，冷却到室温，加入饱和NaCl来除去AgCl固体，以10000 rpm转速离心分离15 min，用水洗涤数次后，将其重新分散到超纯水中，得到金纳米笼的溶液；
（3）检测抗体标记物—金纳米笼/氨基化石墨烯的制备
分别将15~25 mg的氨基化石墨烯分散到10~40 mL的金纳米笼的溶液中，室温下震荡12 h；混合物经洗涤、离心分离、35℃下真空干燥，制得金纳米笼/氨基化石墨烯；
（4）检测抗体孵化物—金纳米笼/氨基化石墨烯-Ab2溶液的制备
将1~3 mg的金纳米笼/氨基化石墨烯分散于1 mL超纯水中，加入1 mL、8~12 μg/mL的检测抗体溶液，在4℃下振荡孵化12 h，离心分离，将下层沉淀加入至1 mL、1/15 mol/L的pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中，制得检测抗体孵化物—金纳米笼/氨基化石墨烯-Ab2溶液，4℃下保存备用。
3.如权利要求1所述的制备方法制备的免疫传感器用于禽类疱疹病毒抗原的检测方法，其特征在于，包括以下分析步骤：
（1）使用电化学工作站用三电极体系进行测定，将权利要求1所制备的免疫传感器作为工作电极，饱和甘汞电极为对电极，铂丝电极为辅助电极，在pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中，采用时间-电流的方法进行扫描，输入电压为-0.4 V，运行时间400 s，记录电流变化；
（2）在10 mL，pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中对0.001~50 ng/mL的禽类疱疹病毒抗原标准溶液进行测试记录电流变化，根据所得电流差值与禽类疱疹病毒抗原的浓度成线性关系，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替禽类疱疹病毒抗原标准溶液进行检测。
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