CN105044341A - 一种电沉积金及金复合物的胃癌标志物ca724生物传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种电沉积金及金复合物的胃癌标志物ca724生物传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种电沉积金及其金复合物的胃癌标志物CA724的生物传感器制备方法及应用，属于新型功能材料、生物传感检测技术领域。电沉积金纳米粒子和金复合物对双氧水具有双催化的性能。利用沉积在电极表面的金纳米粒子大的比表面积和好的催化作用用于负载一抗，将金纳米粒子固载在聚多巴胺/四氧化三铁的表面作为检测抗体标记物，实现了对胃癌标志物CA724的超灵敏检测，对肿瘤标志物的早期诊断及愈后判断具有重要的意义。

Description

一种电沉积金及金复合物的胃癌标志物CA724生物传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及本发明涉及一种电沉积金及金复合物的胃癌标志物CA724生物传感器的制备方法及应用。制备一种电沉积金及金复合物的胃癌标志物CA724生物传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
背景技术
CA72-4是目前诊断胃癌的最佳肿瘤标志物之一，对胃癌具有较高的特异性，其敏感性可达28-80%。CA72-4水平与胃癌的分期有明显的相关性，一般在胃癌的Ⅲ-Ⅳ期增高，对伴有转移的胃癌病人，CA72-4的阳性率更远远高于非转移者。CA72-4水平在术后可迅速下降至正常。在70%的复发病例中，CA72-4浓度首先升高。与其它标志物相比，CA72-4最主要的优势是其对良性病变的鉴别诊断有极高的特异性，在众多的良性胃病患者中，其检出率仅0.7％。本发明涉及本发明涉及一种电沉积金及金复合物的胃癌标志物CA724生物传感器的制备方法及应用。
发明内容
本发明的目的之一是一种电沉积金及金复合物的胃癌标志物CA724生物传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将该生物传感器成功应用于胃癌标志物CA724的检测。
本发明的技术方案
1．一种电沉积金及金复合物的胃癌标志物CA724生物传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05 µm的三氧化二铝抛光粉对玻碳电极抛光处理，用超纯水清洗干净；
（2）将玻碳电极放在0.02 mmol/L的10 mL的HAuCl4的电化学沉积液中，沉积过程中利用计时电流方法，在-0.6 V的条件下沉积100 s后用超纯水清洗，干燥后在电极表面沉积了Au NPs；
（3）将6 µL、5~15 µg/mL的胃癌标志物CA724捕获抗体Ab1滴至沉积了Au NPs的电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（4）滴加3 µL、质量分数为5~15 mg/mL的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（5）滴加6 µL浓度为0.0001~6 ng/mL的胃癌标志物CA724标准溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（6）将4~6 µL检测抗体标记物孵化溶液Au-聚多巴胺/四氧化三铁-Ab2溶液滴至电极表面，置于4℃冰箱中孵化1 h，清洗后，晾干，制得一种Au-聚多巴胺/四氧化三铁胃癌标志物CA724的生物传感器。
2. 检测抗体标记物孵化溶液Au-聚多巴胺/四氧化三铁-Ab2溶液的制备
（1）四氧化三铁的制备
将0.54 g的FeCl3和0.15~0.25 g柠檬酸钠加入装有20 mL乙二醇的锥形瓶中，并且在室温下均匀振荡1 h。将1.1~1.3 g 醋酸钠加入到混合物中继续振荡0.5 h;将上述混合物放入高温反应釜内在200 ◦C的条件下反应12 h，超纯水洗涤、60 ◦C条件下干燥后制得四氧化三铁；
（2）聚多巴胺/四氧化三铁的制备
将制备的35~45 mg的四氧化三铁，溶解于20mL、含1~3 mg/mL多巴胺的pH=8.5 Tris-HCl溶液中，在室温下振荡8 h，利用磁分离技术进行分离，超纯水洗涤，60 ◦C干燥后制得聚多巴胺/四氧化三铁；
（3）检测抗体标记物Au-聚多巴胺/四氧化三铁的制备
将2.0~3.0mg的聚多巴胺/四氧化三铁加入2.5 mL、0.07 mmol/L HAuCl4溶液中，均匀搅拌，向上述溶液中加入1 mL的0.005 mol/L的柠檬酸钠后在室温下均匀搅拌2 h，用磁分离技术进行分离，超纯水洗涤，60 ◦C条件下干燥制得Au-聚多巴胺/四氧化三铁；
（4）检测抗体标记物孵化溶液Au-聚多巴胺/四氧化三铁-Ab2
将1.5~2.5 mg的Au-聚多巴胺/四氧化三铁加入1 mL、pH为7.4的PBS中均匀搅拌，继续加入1.0 mL、5~10 μg/mL的抗体Ab2，混合；将混合溶液置于4 ◦C下反应12 h，将检测抗体Ab2负载于Au-聚多巴胺/四氧化三铁表面，利用磁分离方法进行分离，制得Au-聚多巴胺/四氧化三铁-Ab2，分散于2 mL、pH为7.4的PBS溶液中，置于4 ◦C的冰箱里备用。
3．胃癌标志物CA724的测定
（1）采用电化学工作站的三电极体系进行测定，将权利要求1所制备的免疫传感器作为工作电极，饱和甘汞电极为对电极，铂丝电极为辅助电极，在pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，采用时间-电流的方法进行扫描，输入电压为-0.4 V，运行时间400 s；
（2）在10 mL、pH=7.4的PBS溶液中，对0.0001~6 ng/mL的胃癌标志物CA724标准溶液进行测试，记录电流变化，根据所得电流差值与胃癌标志物CA724的浓度成线性关系，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替胃癌标志物CA724标准溶液进行检测。
本发明的有益成果
（1）电极表面电沉积的金纳米粒子具有较大的比表面积、良好的导电性以及良好的生物相容性和稳定性，而且能够结合大量的捕获抗体，增加了传感器的灵敏度和稳定性。
（2）Au基催化剂对双氧水具有较好的催化性能，被广泛应用于传感器领域，Au纳米粒子和四氧化三铁以及聚多巴胺材料的结合能够提高材料的负载能力和催化效果。
（3）电沉积金纳米粒子和Au基催化剂修饰的传感器对双氧水具有双催化的作用，从而增加了传感器的灵敏度。
（4）本发明制备的电化学免疫传感器用于胃癌肿瘤标志物的检测，响应时间短，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测。测得线性范围为0.10pg/mL ~ 6ng/mL，检测限为0.024 pg/mL。
具体实施方式
实施例 1 一种电沉积金及金复合物的胃癌标志物CA724生物传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05 µm的三氧化二铝抛光粉对玻碳电极抛光处理，用超纯水清洗干净；
（2）将玻碳电极放在0.02 mmol/L的10 mL的HAuCl4的电化学沉积液中，沉积过程中利用计时电流方法，在-0.6 V的条件下沉积100 s后用超纯水清洗，干燥后在电极表面沉积了Au NPs；
（3）将6 µL、5 µg/mL的胃癌标志物CA724捕获抗体Ab1滴至沉积了Au NPs的电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（4）滴加3 µL、质量分数为5mg/mL的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（5）滴加6 µL浓度为0.0001~6 ng/mL的胃癌标志物CA724标准溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（6）将4 µL检测抗体标记物孵化溶液Au-聚多巴胺/四氧化三铁-Ab2溶液滴至电极表面，置于4℃冰箱中孵化1 h，清洗后，晾干，制得一种Au-聚多巴胺/四氧化三铁胃癌标志物CA724的生物传感器。
实施例 2一种电沉积金及金复合物的胃癌标志物CA724生物传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05 µm的三氧化二铝抛光粉对玻碳电极抛光处理，用超纯水清洗干净；
（2）将玻碳电极放在0.02 mmol/L的10 mL的HAuCl4的电化学沉积液中，沉积过程中利用计时电流方法，在-0.6 V的条件下沉积100 s后用超纯水清洗，干燥后在电极表面沉积了Au NPs；
（3）将6 µL、15 µg/mL的胃癌标志物CA724捕获抗体Ab1滴至沉积了Au NPs的电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（4）滴加3 µL、质量分数为15 mg/mL的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（5）滴加6 µL浓度为0.0001~6 ng/mL的胃癌标志物CA724标准溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（6）将6 µL检测抗体标记物孵化溶液Au-聚多巴胺/四氧化三铁-Ab2溶液滴至电极表面，置于4℃冰箱中孵化1 h，清洗后，晾干，制得一种Au-聚多巴胺/四氧化三铁胃癌标志物CA724的生物传感器。
实施例 3检测抗体标记物孵化溶液Au-聚多巴胺/四氧化三铁-Ab2溶液制备
（1）四氧化三铁的制备
将0.54 g的FeCl3和0.15 g柠檬酸钠加入装有20 mL乙二醇的锥形瓶中，并且在室温下均匀振荡1 h。将1.1 g 醋酸钠加入到混合物中继续振荡0.5 h;将上述混合物放入高温反应釜内在200 ◦C的条件下反应12 h，超纯水洗涤、60 ◦C条件下干燥后制得四氧化三铁；
（2）聚多巴胺/四氧化三铁的制备
将制备的35 mg的四氧化三铁，溶解于20mL、含1 mg/mL多巴胺的pH=8.5 Tris-HCl溶液中，在室温下振荡8 h，利用磁分离技术进行分离，超纯水洗涤，60 ◦C干燥后制得聚多巴胺/四氧化三铁；
（3）检测抗体标记物Au-聚多巴胺/四氧化三铁的制备
将2.0mg的聚多巴胺/四氧化三铁加入2.5 mL、0.07 mmol/L HAuCl4溶液中，均匀搅拌，向上述溶液中加入1 mL的0.005 mol/L的柠檬酸钠后在室温下均匀搅拌2 h，用磁分离技术进行分离，超纯水洗涤，60 ◦C条件下干燥制得Au-聚多巴胺/四氧化三铁；
（4）检测抗体标记物孵化溶液Au-聚多巴胺/四氧化三铁-Ab2
将1.5 mg的Au-聚多巴胺/四氧化三铁加入1 mL、pH为7.4的PBS中均匀搅拌，继续加入1.0 mL、5 μg/mL的抗体Ab2，混合；将混合溶液置于4 ◦C下反应12 h，将检测抗体Ab2负载于Au-聚多巴胺/四氧化三铁表面，利用磁分离方法进行分离，制得Au-聚多巴胺/四氧化三铁-Ab2，分散于2 mL、pH为7.4的PBS溶液中，置于4 ◦C的冰箱里备用。
实施例 4 检测抗体标记物孵化溶液Au-聚多巴胺/四氧化三铁-Ab2溶液制备
（1）四氧化三铁的制备
将0.54 g的FeCl3和0.2 g柠檬酸钠加入装有20 mL乙二醇的锥形瓶中，并且在室温下均匀振荡1 h。将1.2 g 醋酸钠加入到混合物中继续振荡0.5 h;将上述混合物放入高温反应釜内在200 ◦C的条件下反应12 h，超纯水洗涤、60 ◦C条件下干燥后制得四氧化三铁；
（2）聚多巴胺/四氧化三铁的制备
将制备的40mg的四氧化三铁，溶解于20mL、含2 mg/mL多巴胺的pH=8.5 Tris-HCl溶液中，在室温下振荡8 h，利用磁分离技术进行分离，超纯水洗涤，60 ◦C干燥后制得聚多巴胺/四氧化三铁；
（3）检测抗体标记物Au-聚多巴胺/四氧化三铁的制备
将2.5 mg的聚多巴胺/四氧化三铁加入2.5 mL、0.07 mmol/L HAuCl4溶液中，均匀搅拌，向上述溶液中加入1 mL的0.005 mol/L的柠檬酸钠后在室温下均匀搅拌2 h，用磁分离技术进行分离，超纯水洗涤，60 ◦C条件下干燥制得Au-聚多巴胺/四氧化三铁；
（4）检测抗体标记物孵化溶液Au-聚多巴胺/四氧化三铁-Ab2
将2.0 mg的Au-聚多巴胺/四氧化三铁加入1 mL、pH为7.4的PBS中均匀搅拌，继续加入1.0 mL、8μg/mL的抗体Ab2，混合；将混合溶液置于4 ◦C下反应12 h，将检测抗体Ab2负载于Au-聚多巴胺/四氧化三铁表面，利用磁分离方法进行分离，制得Au-聚多巴胺/四氧化三铁-Ab2，分散于2 mL、pH为7.4的PBS溶液中，置于4 ◦C的冰箱里备用。
实施例 5 检测抗体标记物孵化溶液Au-聚多巴胺/四氧化三铁-Ab2溶液制备
（1）四氧化三铁的制备
将0.54 g的FeCl3和0.25 g柠檬酸钠加入装有20 mL乙二醇的锥形瓶中，并且在室温下均匀振荡1 h。将1.3 g 醋酸钠加入到混合物中继续振荡0.5 h;将上述混合物放入高温反应釜内在200 ◦C的条件下反应12 h，超纯水洗涤、60 ◦C条件下干燥后制得四氧化三铁；
（2）聚多巴胺/四氧化三铁的制备
将制备的45 mg的四氧化三铁，溶解于20mL、含3 mg/mL多巴胺的pH=8.5 Tris-HCl溶液中，在室温下振荡8 h，利用磁分离技术进行分离，超纯水洗涤，60 ◦C干燥后制得聚多巴胺/四氧化三铁；
（3）检测抗体标记物Au-聚多巴胺/四氧化三铁的制备
将3.0mg的聚多巴胺/四氧化三铁加入2.5 mL、0.07 mmol/L HAuCl4溶液中，均匀搅拌，向上述溶液中加入1 mL的0.005 mol/L的柠檬酸钠后在室温下均匀搅拌2 h，用磁分离技术进行分离，超纯水洗涤，60 ◦C条件下干燥制得Au-聚多巴胺/四氧化三铁；
（4）检测抗体标记物孵化溶液Au-聚多巴胺/四氧化三铁-Ab2
将2.5 mg的Au-聚多巴胺/四氧化三铁加入1 mL、pH为7.4的PBS中均匀搅拌，继续加入1.0 mL、10 μg/mL的抗体Ab2，混合；将混合溶液置于4 ◦C下反应12 h，将检测抗体Ab2负载于Au-聚多巴胺/四氧化三铁表面，利用磁分离方法进行分离，制得Au-聚多巴胺/四氧化三铁-Ab2，分散于2 mL、pH为7.4的PBS溶液中，置于4 ◦C的冰箱里备用。
实施例 6 胃癌标志物CA724的测定
（1）采用电化学工作站的三电极体系进行测定，将权利要求1所制备的免疫传感器作为工作电极，饱和甘汞电极为对电极，铂丝电极为辅助电极，在pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，采用时间-电流的方法进行扫描，输入电压为-0.4 V，运行时间400 s；
（2）在10 mL、pH=7.4的PBS溶液中，对0.0001~6 ng/mL的胃癌标志物CA724标准溶液进行测试，记录电流变化，根据所得电流差值与胃癌标志物CA724的浓度成线性关系，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替胃癌标志物CA724标准溶液进行检测，测得线性范围为0.10pg/mL ~ 6ng/mL，检测限为0.024 pg/mL。

Claims (3)

1.一种电沉积金及金复合物的胃癌标志物CA724生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）依次用1.0、0.3、0.05 µm的三氧化二铝抛光粉对玻碳电极抛光处理，用超纯水清洗干净；
（2）将玻碳电极放在0.02 mmol/L的10 mL的HAuCl4的电化学沉积液中，沉积过程中利用计时电流方法，在-0.6 V的条件下沉积100 s后用超纯水清洗，干燥后在电极表面沉积了Au NPs；
（3）将6 µL、5~15 µg/mL的胃癌标志物CA724捕获抗体Ab1滴至沉积了Au NPs的电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（4）滴加3 µL、质量分数为5~15 mg/mL的牛血清白蛋白溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（5）滴加6 µL浓度为0.0001~6 ng/mL的胃癌标志物CA724标准溶液至电极表面，4℃下晾干，超纯水冲洗；
（6）将4~6 µL检测抗体标记物孵化溶液Au-聚多巴胺/四氧化三铁-Ab2溶液滴至电极表面，置于4℃冰箱中孵化1 h，清洗后，晾干，制得一种Au-聚多巴胺/四氧化三铁胃癌标志物CA724的生物传感器。
2.如权力要求1所述的一种电沉积金及金复合物的胃癌标志物CA724生物传感器的制备方法，所述检测抗体标记物孵化溶液Au-聚多巴胺/四氧化三铁-Ab2溶液，其特征在于，制备步骤如下：
（1）四氧化三铁的制备
将0.54 g的FeCl3和0.15~0.25 g柠檬酸钠加入装有20 mL乙二醇的锥形瓶中，并且在室温下均匀振荡1 h；
将1.1~1.3 g 醋酸钠加入到混合物中继续振荡0.5 h;将混合物放入高温反应釜内在200 ◦C的条件下反应12 h，超纯水洗涤、60 ◦C条件下干燥后制得四氧化三铁；
（2）聚多巴胺/四氧化三铁的制备
将制备的35~45 mg的四氧化三铁，溶解于20mL、含1~3 mg/mL多巴胺的pH=8.5 Tris-HCl溶液中，在室温下振荡8 h，利用磁分离技术进行分离，超纯水洗涤，60 ◦C干燥后制得聚多巴胺/四氧化三铁；
（3）检测抗体标记物Au-聚多巴胺/四氧化三铁的制备
将2.0~3.0mg的聚多巴胺/四氧化三铁加入2.5 mL、0.07 mmol/L HAuCl4溶液中，均匀搅拌，向上述溶液中加入1 mL的0.005 mol/L的柠檬酸钠后在室温下均匀搅拌2 h，用磁分离技术进行分离，超纯水洗涤，60 ◦C条件下干燥制得Au-聚多巴胺/四氧化三铁；
（4）检测抗体标记物孵化溶液Au-聚多巴胺/四氧化三铁-Ab2
将1.5~2.5 mg的Au-聚多巴胺/四氧化三铁加入1 mL、pH为7.4的PBS中均匀搅拌，继续加入1.0 mL、5~10 μg/mL的抗体Ab2，混合；将混合溶液置于4 ◦C下反应12 h，将检测抗体Ab2负载于Au-聚多巴胺/四氧化三铁表面，利用磁分离方法进行分离，制得Au-聚多巴胺/四氧化三铁-Ab2，分散于2 mL、pH为7.4的PBS溶液中，置于4 ◦C的冰箱里备用。
3.如权利要求1所述的制备方法制备的一种电沉积金及金复合物的胃癌标志物CA724生物传感器用于胃癌标志物CA724的测定，步骤如下：
（1）采用电化学工作站的三电极体系进行测定，将权利要求1所制备的免疫传感器作为工作电极，饱和甘汞电极为对电极，铂丝电极为辅助电极，在pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，采用时间-电流的方法进行扫描，输入电压为-0.4 V，运行时间400 s；
（2）在10 mL、pH=7.4的PBS溶液中，对0.0001~6 ng/mL的胃癌标志物CA724标准溶液进行测试，记录电流变化，根据所得电流差值与胃癌标志物CA724的浓度成线性关系，绘制工作曲线；
（3）将待测样品溶液代替胃癌标志物CA724标准溶液进行检测。
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