CN109813786A - 双金属-有机骨架材料、支架材料及其制备方法，电化学免疫传感器及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明具体涉及一种双金属‑有机骨架材料、支架材料及其制备方法，电化学免疫传感器及其制备方法、应用，属于生物传感器技术领域。本发明的双金属‑有机骨架材料的中心离子金属为Ce3+离子和Fe3+离子。本发明的用于电化学免疫传感器的支架材料的制备方法包括以下步骤：将本发明的双金属‑有机骨架材料于惰性气氛中在500～900℃煅烧处理，即得。本发明的用于电化学免疫传感器的支架材料具有化学多功能性、特定晶体结构和表面形态。本发明的支架材料用于构建电化学免疫传感器时可较好的吸附生物敏感材料，并且可以放大传感器的电化学信号，从而提高电化学免疫传感器的检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种双金属-有机骨架材料、支架材料及其制备方法，电化学免疫传感器及其制备方法、应用，属于生物传感器技术领域。
背景技术
癌症的早期诊断对癌症的治疗极为重要。肿瘤组织分泌的标志物可以在血液、组织和体液中发现，是临床癌症的重要诊断依据。碳水化合物抗原19-9(CA19-9)是一种与恶性肿瘤高度相关的糖蛋白，是对胰腺癌敏感性最高的标志物。正常健康人血液中的CA19-9水平显著低于37U/mL，因此血液中CA19-9水平略有升高意味着胰腺癌发生和发展的可能。CA19-9的灵敏检测在胰腺癌的早期诊断，治疗和预测中起关键作用。现有技术中已有电化学免疫测定(EC)，化学发光免疫测定(CL)，酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)等免疫测定方法来检测CA19-9。但是这些方法通常需要标记抗体或抗原，导致测定过程更复杂，耗时且昂贵，并且灵敏度较低。
电化学免疫传感器是将抗原或抗体固相化在电极表面，以检测样品溶液中的待测抗体或抗原。其中，将抗原或抗体固相化在电极表面的基底材料(即支架材料)对电化学免疫传感器的灵敏度有很大的影响。申请公布号为CN108918853A的中国发明专利申请文件中公开了一种Pd@Ag@CeO2标记的免疫传感器的制备方法。该制备方法包括以下步骤：将金纳米粒子负载氨基功能化微孔碳球分散液滴涂到预处理后的玻碳电极上，晾干后滴加肿瘤标志物捕获抗体Ab1，干燥后将牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，清洗后干燥，然后在电极表面滴加抗体孵化物Pd@Ag@CeO2-Ab2溶液，然后在4℃冰箱中孵化40min，冲洗后晾干。该免疫传感器实现了对肿瘤标志物CA19-9、CA125的检测，但是灵敏度仍较低。
构建高灵敏度的电化学免疫传感器，有效锚定生物敏感材料和放大检测信号是关键步骤。此外，电化学免疫传感器对微量抗原检测的敏感性取决于吸附在支架材料上的生物敏感材料，以及固定化抗体在电极表面上的取向。最近，纳米材料被成功开发，通过表面工程有效地提高了传感器的灵敏度。各种纳米材料，如碳纳米管基质，普鲁士蓝，Fe3O4@SiO2-Au@mSiO2，4,4'-二羧基-2,2'-联吡啶钴(Co(dcbpy)3 2+)，聚(N,N0-二苯基-对苯二胺)-Au/Pt和Ag@BSA-鲁米诺，被作为电化学免疫传感器的支架材料使用。但是在癌症的早期检测应用过程中其检测灵敏度仍然较低。
MOF(金属-有机骨架)材料是一类由无机连接体和有机连接分子组成的杂化材料。近年来，MOF由于具有结构柔韧性，高孔隙率和可控合成的特性，在气体储存，化学传感，多相催化和生物应用等方面备受关注。由于MOF具有三维无限延伸、孔隙清晰、官能团丰富、对生物分子具有较强的生物亲和力等关键特征，其在传感领域的应用领域得到了扩展。近年来的研究还将MOF作为前驱体，通过热处理制备了大量的由MOF衍生的多孔或中空金属氧化物纳米材料，并在药物传递、电化学催化与储能、酶固定化、生物传感等不同领域得到了应用。
在不同的MOF材料中，Ce-MOF和Fe-MOF中铈和铁的混合价态具有优异的催化活性，因此常用于检测H2O2、葡萄糖或其他小生物分子的检测。特别是CeO2作为典型的稀土氧化物，由于其特殊的4f电子结构，具有优异的电化学性能，化学惰性，无毒性，可忽略的溶胀性和生物相容性，因而受到广泛关注。基于CeO2的纳米复合材料具有广泛的电化学性质，可应用于生物传感器和对生物标志物的检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双金属-有机骨架材料，该材料经过处理后用于电化学免疫传感器时提高了电化学免疫传感器的灵敏度。
本发明的目的还在于提供一种上述双金属-有机骨架材料的制备方法，该制备方法简单。
本发明的目的还在于提供一种用于电化学免疫传感器的支架材料的制备方法，该制备方法制得的支架材料能够提高电化学免疫传感器的灵敏度。
本发明的目的还在于提供一种用于电化学免疫传感器的支架材料，该支架材料能够提高电化学免疫传感器的灵敏度。
本发明的目的还在于提供一种电化学免疫传感器，该电化学免疫传感器具有较高的检测灵敏度。
本发明的目的还在于提供一种上述电化学免疫传感器制备方法，该制备方法工艺简单。
本发明的目的还在于提供一种上述电化学免疫传感器在癌症早期检测癌症标志物方面的应用，可实现癌症早期的诊断。
为实现上述目的，本发明的双金属-有机骨架材料采用的技术方案为：
一种双金属-有机骨架材料，所述双金属-有机骨架材料的中心离子金属为Ce3+离子和Fe3+离子。
本发明的双金属-有机骨架材料经过处理形成由铈和铁两种不同金属元素组成的双金属纳米材料，当作为电化学免疫传感器的支架材料时该双金属纳米材料由于协同效应和电子性能，其传感性能明显优于单金属纳米材料，有效提高了电化学免疫传感器的检测灵敏度。
上述双金属-有机骨架材料的制备方法采用的技术方案为：
一种双金属-有机骨架材料的制备方法，包括以下步骤：将可溶性铈盐和可溶性铁盐的混合溶液与有机配体溶液混合，然后老化，过滤干燥即得。上述制备方法简单，容易操作。
所述可溶性铈盐中铈和可溶性铁盐中铁的摩尔比为(0.5～1.5):(0.5～1.5)。控制可溶性铈盐中铈和可溶性铁盐中铁的摩尔比用于调节所形成的金属-有机骨架材料中两种金属的含量及价态组成，使金属-有机骨架材料经过处理后形成具有高电化学活性和有利于生物敏感材料固定的支架材料。
本发明的用于电化学免疫传感器的支架材料的制备方法采用的技术方案为：
一种用于电化学免疫传感器的支架材料的制备方法，包括以下步骤：将上述双金属-有机骨架材料于惰性气氛中在500～900℃煅烧处理，即得。
双金属-有机骨架材料为Ce/Fe双金属-有机骨架材料，Ce/Fe双金属-有机骨架材料在煅烧过程中有机骨架分解形成多孔碳基质，转化形成了具有特殊化学，晶体结构和表面形态的CeO2/FeOx@mC纳米复合材料。CeO2/FeOx@mC纳米复合材料在构建电化学免疫传感器时，生物敏感材料如抗体分子通过类酯桥接吸附在氧化铈上，同时氧化铈和铁的氧化物的协同作用可以放大传感器的电化学信号，高比表面积和良好生物相容性的碳基质作为基质，可以提供具有丰富的生物敏感材料固定位点的界面，从而提高传感器的检测灵敏度。
为保证Ce/Fe双金属-有机骨架材料转化完全，所述煅烧处理的时间为1～3h。
本发明的用于电化学免疫传感器的支架材料采用的技术方案为：
一种采用上述电化学免疫传感器的支架材料的制备方法制备的支架材料。
本发明的支架材料为CeO2/FeOx@mC纳米复合材料，具有良好的电化学性能、稳定性和生物相容性，可以促进电子转移和加载大量的生物敏感材料，在构建成电化学免疫传感器后可以放大输出信号，从而提高电化学免疫传感器的检测灵敏度。
本发明的电化学免疫传感器采用的技术方案为：
一种电化学免疫传感器，基底电极、修饰于基底电极上的支架材料以及固定在支架材料上的生物敏感材料，所述支架材料即为上述支架材料。
本发明的电化学免疫传感器以上述支架材料修饰基底电极，有利于提高生物敏感材料的固相化程度，提高电化学免疫传感器的检测灵敏度。
本发明的电化学免疫传感器的制备方法采用的技术方案为：
一种电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：将支架材料的悬浮液滴加到基底电极上，干燥后在含生物敏感材料的溶液中进行浸泡，取出后洗涤，即得。
本发明的电化学免疫传感器的制备方法简单、易控制，并且制得的电化学免疫传感器检测灵敏度高。
所述含生物敏感材料的溶液中生物敏感材料的浓度为0.5～2μg/mL。生物敏感材料浓度过小将导致支架材料所固定的生物敏感材料较少，影响对癌症标记物的检测效果；生物敏感材料浓度过大，支架材料所固定的生物敏感材料已经饱和，则造成浪费。
所述支架材料的悬浮液是将支架材料分散在pH为7.0～7.4的缓冲溶液中得到，支架材料的浓度为0.5～2mg/mL。上述浓度的支架材料有利于支架材料在基底电极的均匀分散。支架材料浓度过小，所固定的生物敏感材料较少，将影响对癌症标记物的检测效果；支架材料浓度过大时，材料厚度较大，容易从基底电极上脱落，影响传感器的稳定性。
本发明的电化学免疫传感器在癌症早期检测癌症标志物方面的应用的技术方案为：
一种电化学免疫传感器在癌症早期检测癌症标志物方面的应用，所述电化学免疫传感器为上述电化学免疫传感器，所述生物敏感材料为CA19-9抗体。
本发明的电化学免疫传感器具有良好的选择性、重复性和稳定性，在癌症早期可实现对标志物的检测，从而有利于癌症的早期诊断。
附图说明
图1为本发明的用于电化学免疫传感器的支架材料的实施例1～3的支架材料及双金属-有机骨架材料的实施例中Ce/Fe-MOF的XRD谱图；
图2为本发明的用于电化学免疫传感器的支架材料的实施例1～3的支架材料及双金属-有机骨架材料的实施例中Ce/Fe-MOF的拉曼谱图；
图3为本发明的用于电化学免疫传感器的支架材料的实施例1～3的支架材料及双金属-有机骨架材料的实施例中Ce/Fe-MOF的红外谱图；
图4为本发明的用于电化学免疫传感器的支架材料的实施例1～3的支架材料及双金属-有机骨架材料的实施例中Ce/Fe-MOF的XPS全谱图；
图5为双金属-有机骨架材料的实施例中Ce/Fe-MOF的Ce、Fe、C和O元素的XPS谱图；
图6为本发明的用于电化学免疫传感器的支架材料的实施例1～3的支架材料的Ce、Fe和O元素的XPS谱图，其中(a1)～(a3)分别为CeO2/FeOx@mC500的Ce、Fe和O元素的XPS谱图，(b1)～(b3)分别为CeO2/FeOx@mC700的Ce、Fe和O元素的XPS谱图，(c1)～(c3)分别为CeO2/FeOx@mC900的Ce、Fe和O元素的XPS谱图；
图7为本发明的用于电化学免疫传感器的支架材料的实施例1～3的支架材料的C元素的XPS谱图，其中(a)为CeO2/FeOx@mC500中C元素的XPS谱图，(b)为CeO2/FeOx@mC700中C元素的XPS谱图；(c)为CeO2/FeOx@mC900中C元素的XPS谱图；
图8为双金属-有机骨架材料的实施例中Ce/Fe-MOF的SEM和TEM图，其中(a)和(b)为SEM图，(c)和(d)为TEM图；
图9为本发明的用于电化学免疫传感器的支架材料的实施例1～3的支架材料的SEM图，其中(a)和(b)为CeO2/FeOx@mC500的SEM图，(c)和(d)为CeO2/FeOx@mC700的SEM图，(e)和(f)为CeO2/FeOx@mC900的SEM图；
图10为本发明用于电化学免疫传感器的支架材料的实施例1～3的支架材料的TEM、HR-TEM(高分辨率TEM)和SAED图，其中(a)和(b)为CeO2/FeOx@mC500的TEM图，(c)为CeO2/FeOx@mC500的HR-TEM和SAED图，(d)和(e)为CeO2/FeOx@mC700的TEM图，(f)为CeO2/FeOx@mC700的HR-TEM和SAED图，(g)和(h)为CeO2/FeOx@mC900的SEM图，(i)为CeO2/FeOx@mC900的HR-TEM和SAED图；
图11为ZView2软件分析EIS图谱时的等效电路图；
图12为对比例1～3的电化学免疫传感器以及对比例3的电化学免疫传感器BSA/Ab/Ce/Fe-MOF/AE检测CA19-9的EIS图；
图13为对比例4～5的电化学免疫传感器、电化学免疫传感器的实施例1的电化学免疫传感器以及电化学免疫传感器的实施例1的电化学免疫传感器检测CA19-9的EIS图；
图14为对比例6～7的电化学免疫传感器、电化学免疫传感器的实施例2的电化学免疫传感器以及电化学免疫传感器的实施例2的电化学免疫传感器检测CA19-9的EIS图；
图15为对比例8～9的电化学免疫传感器、电化学免疫传感器的实施例3的电化学免疫传感器以及电化学免疫传感器的实施例2的电化学免疫传感器检测CA19-9的EIS图；
图16为对比例1～9的电化学免疫传感器、电化学免疫传感器的实施例1～3的电化学免疫传感器以及检测CA19-9的ΔRct值；
图17为电化学免疫传感器的实施例1的电化学免疫传感器检测不同浓度的CA19-9的EIS图谱；
图18为不同CA19-9浓度与ΔRct值的关系图；
图19为图18的校准曲线图；
图20为本发明的电化学免疫传感器的实施例1的电化学免疫传感器对不同抗原的特异性分析图；
图21为本发明的电化学免疫传感器的实施例1的电化学免疫传感器的重复性检测结果；
图22为本发明的电化学免疫传感器的实施例1的电化学免疫传感器的稳定性检测结果；
图23为本发明的电化学免疫传感器的实施例1的电化学免疫传感器的再生性检测结果。
具体实施方式
本发明的双金属-有机骨架材料的中心离子金属为Ce3+离子和Fe3+离子。
优选的，Ce3+离子和Fe3+离子的摩尔比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)。
所述双金属-有机骨架材料中有机骨架由1,3,5-苯三甲酸形成。
本发明的双金属-有机骨架材料的制备方法包括以下步骤：将可溶性铈盐和可溶性铁盐的混合溶液与有机配体溶液混合，然后老化，过滤干燥即得。
优选的，可溶性铈盐和可溶性铁盐的混合溶液与有机配体溶液混合为将可溶性铈盐和可溶性铁盐的混合溶液缓慢滴加到有机配体溶液中。加入太快不利于双金属-有机骨架材料的形成。
优选的，可溶性铈盐为硝酸铈、氯化铈中的至少一种。可溶性铁盐为硝酸铁、氯化铁中的至少一种。有机配体溶液为1,3,5-苯三甲酸。
优选的，可溶性铈盐与可溶性铁盐的混合溶液中，可溶性铈盐的浓度为0.03～0.04mmol/L。可溶性铁盐的浓度为0.03～0.04mmol/mL。有机配体溶液中有机配体的浓度为0.04～0.05mmol/mL。
所述混合溶液的溶剂为水和乙醇的混合溶液。所述有机配体溶液的溶剂为水和乙醇的混合溶液。水和乙醇的混合溶液中水和乙醇的体积比为1:1。
所述老化即为放置。
本发明的双金属-有机骨架材料还可以采用现有技术中的其他方法如金属中心取代法制备。
本发明提供的用于电化学免疫传感器的支架材料的制备方法，包括以下步骤：将双金属-有机骨架材料于惰性气氛中在500～900℃煅烧处理，即得。
本发明的用于电化学免疫传感器的支架材料的制备过程中，采用的惰性气氛由流动的惰性气体形成。
优选的，所述惰性气体为氮气。
优选的，所述煅烧处理时的升温速率为1～3℃/min。
本发明的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：将支架材料的悬浮液滴加到基底电极上，干燥后在含生物敏感材料的溶液中进行浸泡，取出后洗涤，即得。
优选的，其中支架材料的悬浮液是将支架材料分散在pH为7.0～7.4的缓冲溶液中。优选的，缓冲溶液为磷酸缓冲溶液、Tris-HCl缓冲液、hepes缓冲液中的任意一种。
进一步优选的，缓冲溶液为磷酸缓冲溶液。磷酸缓冲溶液的pH值为7.0～7.4。磷酸缓冲溶液中为磷酸根的浓度为0.01M。
优选的，生物敏感材料为抗体。
优选的，基底电极为裸金电极、玻碳电极中的任意一种。
优选的，基底电极为预处理后的电极。所述预处理包括以下步骤：将基底电极进行抛光处理，然后依次在食人鱼溶液、乙醇、水中超声处理10～20min，然后在0.3～0.7M H2SO4中，在-0.2～1.6V的电压下通过氧化和还原循环的电化学方法洗涤。
下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步说明。
以下实施例中所涉及的Ce(NO3)3·6H2O和Fe(NO3)3·3H2O，1,3,5-苯三甲酸(H3BTC)和无水乙醇购自阿拉丁试剂有限公司(中国上海)。碳水化合物抗原19-9(CA19-9)，CA19-9抗体，碳水化合物抗原125(CA125)，血管内皮生长因子(VEGF)，免疫球蛋白G(IgG)，癌胚抗原(CEA)，粘蛋白-1(MUC1)，表皮生长因子受体(EGFR)，前列腺特异性抗原(PSA)，甲胎蛋白(AFP)和人血清购自Solarbio Bioengineering Ltd.公司(中国北京)。KH2PO4，Na2HPO4·12H2O，KCl，NaCl，K3[Fe(CN)6]和K4[Fe(CN)6]·H2O从国药化学试剂有限公司(中国北京)订购。所用的所有化学品均为分析试剂级，无需进一步纯化即可使用。所有溶液用水均使用Milli-Q超纯水仪(≥18.2MΩ·cm)制备。
以下实施例中所用磷酸缓冲溶液(PBS)由以下方法配制：将0.242g的KH2PO4，1.445g的Na2HPO4·12H2O，0.200g的KCl和8.003g的NaCl依次溶解水中，然后定容。
以下实施例中所用CA19-9溶液由CA19-9的储备液采用磷酸缓冲溶液稀释而成。CA19-9的储备液中CA19-9的浓度为17kU/mL，溶剂为磷酸缓冲溶液，在4℃条件下保存。
以下实施例中所用CA19-9抗体溶液由CA19-9抗体的储备液采用磷酸缓冲溶液稀释而成。CA19-9抗体的储备液中CA19-9抗体的浓度为3.8mg/mL，溶剂为磷酸缓冲溶液，在4℃条件下保存。
双金属-有机骨架材料的实施例
本实施例的双金属-有机骨架材料为Ce/Fe-MOF，中心离子金属为Ce3+离子和Fe3+离子，有机骨架材料由1,3,5-苯三甲酸形成，其中Ce3+离子和Fe3+离子摩尔比为1：1。
双金属-有机骨架材料的制备方法的实施例
本实施例的制备方法为双金属-有机骨架材料的实施例的Ce/Fe-MOF材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1mmol Ce(NO3)3·6H2O和1mmol Fe(NO3)3溶解于30mL乙醇/水(v/v＝1/1)体系中，得到溶液A；
(2)将3mmol的H3BTC(1,3,5-苯三甲酸)溶解于70mL乙醇/水(v/v＝1/1)体系中，得到溶液B；
(3)在搅拌条件下将溶液A缓慢倒入溶液B中，然后老化24h得粉红色成物，过滤后用乙醇/水(v/v＝1/1)洗涤沉淀物，然后在60℃的烘箱中烘干即得
用于电化学免疫传感器的支架材料的制备方法的实施例1
本发明的支架材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1mmol Ce(NO3)3·6H2O和1mmol Fe(NO3)3溶解于30mL乙醇/水(v/v＝1/1)体系中，得到溶液A；
(2)将3mmol的H3BTC(1,3,5-苯三甲酸)溶解于70mL乙醇/水(v/v＝1/1)体系中，得到溶液B；
(3)在搅拌条件下将溶液A缓慢倒入溶液B中，然后老化24h得粉红色成物，过滤后用乙醇/水(v/v＝1/1)洗涤沉淀物，然后在60℃的烘箱中烘干即得Ce/Fe-MOF；
(4)向管式炉中持续通入氮气，将Ce/Fe-MOF在管式炉中以2℃/min的升温速度升温至500℃，并在500℃温度下保温2h，然后自然冷却至室温，得黑色粉末，标记为CeO2/FeOx@mC500。
用于电化学免疫传感器的支架材料的制备方法的实施例2
本实施例的制备方法与用于电化学免疫传感器的支架材料的制备方法的实施例1的区别在于：步骤(4)中升温至700℃，并在700℃温度下保温2h，得到的产物标记为CeO2/FeOx@mC700。
用于电化学免疫传感器的支架材料的制备方法的实施例3
本实施例的制备方法与用于电化学免疫传感器的支架材料的制备方法的实施例1的区别在于：步骤(4)中升温至900℃，并在900℃温度下保温2h，得到的产物标记为CeO2/FeOx@mC900。
用于电化学免疫传感器的支架材料的实施例1～3
本实施例的支架材料分别由用于电化学免疫传感器的支架材料的制备方法的实施例1～3的制备方法制得，分别为CeO2/FeOx@mC500、CeO2/FeOx@mC700、CeO2/FeOx@mC900。
电化学免疫传感器的实施例1
本实施例的电化学免疫传感器为BSA/Ab/CeO2/FeOx@mC500/AE，包括基底电极、修饰于基底电极上的支架材料以及固定在支架材料上的生物敏感材料，基底电极为裸金电极(AE)，支架材料为CeO2/FeOx@mC500(用于电化学免疫传感器的支架材料的制备方法的实施例1中的方法制备)，生物敏感材料为CA19-9抗体。
电化学免疫传感器的实施例2
本实施例的电化学免疫传感器为BSA/Ab/CeO2/FeOx@mC700/AE，包括基底电极、修饰于基底电极上的支架材料以及固定在支架材料上的生物敏感材料，基底电极为裸金电极(AE)，支架材料为CeO2/FeOx@mC700(用于电化学免疫传感器的支架材料的制备方法的实施例2中的方法制备)，生物敏感材料为CA19-9抗体。
电化学免疫传感器的实施例3
本实施例的电化学免疫传感器BSA/Ab/CeO2/FeOx@mC900/AE，包括基底电极、修饰于基底电极上的支架材料以及固定在支架材料上的生物敏感材料，基底电极为裸金电极(AE)，支架材料为CeO2/FeOx@mC900(用于电化学免疫传感器的支架材料的制备方法的实施例3中的方法制备)，生物敏感材料为CA19-9抗体。
电化学免疫传感器的制备方法的实施例1
本实施例的电化学免疫传感器的制备方法，具体包括以下步骤：
1)用颗粒粒径为0.05μm的氧化铝浆料抛光清洁直径为3mm的裸金电极(AE)，然后将AE分别在食人鱼溶液(质量分数为98％的浓硫酸溶液和质量分数为30％的双氧水的混合溶液，二者体积比为3:1)、乙醇和水中超声处理15min。然后在0.5M H2SO4中，在-0.2～1.6V的电压下通过氧化和还原循环的电化学方法洗涤AE，然后用超纯水漂洗并在氮气下干燥，得预处理的AE。
2)将1mg CeO2/FeOx@mC500(用于电化学免疫传感器的支架材料的制备方法的实施例1中的方法制备)均匀分散于1mL PBS中，得悬浮液；
3)取10μL的CeO2/FeOx@mC500悬浮液滴加到预处理的AE上，并在室温下干燥6h，得CeO2/FeOx@mC500修饰的AE(表示为CeO2/FeOx@mC500/AE)；
4)将CeO2/FeOx@mC500/AE浸入CA19-9抗体溶液(1μg/mL)中4h，并用PBS彻底洗涤，得电极(表示为Ab/CeO2/FeOx@mC500/AE)；
5)将Ab/CeO2/FeOx@mC500/AE浸于浓度为0.01ng/mL BSA溶液中，浸泡30min，即得(表示为BSA/Ab/CeO2/FeOx@mC500/AE)，在4℃下储存备用。
电化学免疫传感器的制备方法的实施例2
本实施例的电化学免疫传感器的制备方法与电化学免疫传感器的制备方法的实施例1的区别在于：将CeO2/FeOx@mC500替换为CeO2/FeOx@mC700(由用于电化学免疫传感器的支架材料的制备方法的实施例2中的方法制备)。
电化学免疫传感器的制备方法的实施例3
本实施例的电化学免疫传感器的制备方法与电化学免疫传感器的制备方法的实施例1的区别在于：将CeO2/FeOx@mC500替换为CeO2/FeOx@mC900(由用于电化学免疫传感器的支架材料的制备方法的实施例3中的方法制备)。
电化学免疫传感器在癌症早期检测癌症标志物方面的应用的实施例
采用电化学免疫传感器的实施例1中的电化学免疫传感器检测人血清中的CA19-9，用于胰腺癌早期的诊断。
对比例1～3
对比例1～3的电化学免疫传感器分别标记为Ce/Fe-MOF/AE、Ab/Ce/Fe-MOF/AE、BSA/Ab/Ce/Fe-MOF/AE。电化学免疫传感器所用支架材料为双金属-有机骨架材料的实施例中的Ce/Fe-MOF。
其中电化学免疫传感器Ce/Fe-MOF/AE的制备与电化学免疫传感器的制备方法的实施例1中的步骤(1)～(3)的区别在于步骤(2)中将1mg Ce/Fe-MOF均匀分散于1mLPBS中制得悬浮液，其余完全相同。
电化学免疫传感器Ab/Ce/Fe-MOF/AE的制备与电化学免疫传感器的制备方法的实施例1中步骤(1)～(4)的区别在于步骤(2)中将1mg Ce/Fe-MOF均匀分散于1mLPBS中制得悬浮液，其余完全相同。
电化学免疫传感器BSA/Ab/Ce/Fe-MOF/AE的制备与电化学免疫传感器的制备方法的实施例1中步骤(1)～(5)的区别在于步骤(2)中将1mg Ce/Fe-MOF均匀分散于1mLPBS中制得悬浮液，其余完全相同。
对比例4～5
对比例4～5的电化学免疫传感器分别标记为CeO2/FeOx@mC500/AE和Ab/CeO2/FeOx@mC500/AE。
电化学免疫传感器CeO2/FeOx@mC500/AE的制备同电化学免疫传感器的制备方法的实施例1中步骤(1)～(3)。
电化学免疫传感器Ab/CeO2/FeOx@mC500/AE的制备同电化学免疫传感器的制备方法的实施例1中步骤(1)～(4)。
对比例6～7
对比例6～7的电化学免疫传感器分别标记为CeO2/FeOx@mC700/AE和Ab/CeO2/FeOx@mC700/AE。
电化学免疫传感器CeO2/FeOx@mC700/AE的制备与电化学免疫传感器的制备方法的实施例1中步骤(1)～(3)的区别在于将CeO2/FeOx@mC500替换为CeO2/FeOx@mC700，其余均相同。
电化学免疫传感器Ab/CeO2/FeOx@mC700/AE的制备与电化学免疫传感器的制备方法的实施例1中步骤(1)～(4)的区别在于将CeO2/FeOx@mC500替换为CeO2/FeOx@mC700，其余均相同。
对比例8～9
对比例8～9的电化学免疫传感器分别标记为CeO2/FeOx@mC900/AE和Ab/CeO2/FeOx@mC900/AE。
电化学免疫传感器CeO2/FeOx@mC900/AE的制备与电化学免疫传感器的制备方法的实施例1中步骤(1)～(3)的区别在于将CeO2/FeOx@mC500替换为CeO2/FeOx@mC900，其余均相同。
电化学免疫传感器Ab/CeO2/FeOx@mC900/AE的制备与电化学免疫传感器的工作电极的制备方法的实施例1中步骤(1)～(4)的区别在于将CeO2/FeOx@mC500替换为CeO2/FeOx@mC900，其余均相同。
试验例1
对用于电化学免疫传感器的支架材料的实施例1～3中的支架材料CeO2/FeOx@mC500、CeO2/FeOx@mC700、CeO2/FeOx@mC900及双金属-有机骨架材料的实施例中的Ce/Fe-MOF分别进行XRD、拉曼、红外测试。测试结果如图1～图3所示。
粉末X射线衍射(XRD)采用D/Max-2500型X射线衍射仪，Cu靶，Kα射线(λ＝0.15406nm)。傅里叶变换红外光谱(FT-IR)利用Bruker TENSOR27光谱仪(以4cm-1的分辨率扫描32次)。拉曼光谱在Renishaw inVia拉曼光谱仪上用固态激光器(在532nm激发)在室温下在50-4000cm-1范围内获得。
图1的XRD图谱中，Ce/Fe-MOF的主要衍生峰的2θ在5～30°范围内，与现有技术中Ce-MOF(Ce(1,3,5-BTC)(H2O)6)相匹配。这表明由于Ce-MOF优异的取向性，Ce/Fe-MOF保留了Ce-MOF的结晶相。CeO2/FeOx@mC500的特征衍射峰的2θ值分别为28.6°、47.5°和56.4°，分别指向面心立方CeO2的(JCPDS No.34-0394)的(111)、(220)和(311)晶面。CeO2/FeOx@mC700和CeO2/FeOx@mC900在28.6°、47.5°和56.4°的峰更高且窄，说明随着煅烧温度的提高，CeO2的结晶度增加。另外，CeO2/FeOx@mC900中出现了α-Fe2O3(JCPDS No.33-0664)和金属Fe(JCPDSNo.06-0696)晶体的衍射峰。
图2的拉曼图谱中，对于Ce/Fe-MOF而言，806cm-1、1003cm-1、1449cm-1和1561cm-1处的谱带归因于面外环C-H弯曲振动，苯环的C＝C模式，C-O2单元的νsym和νasym。用于电化学免疫传感器的支架材料的实施例1～3中的支架材料的拉曼谱图中，Ce/Fe-MOF的特征谱带消失，位于1335cm-1和1595cm-1的典型D带(局部缺陷/无序结构)和G带(sp2石墨化结构)出现，表明在煅烧过程中形成碳材料。与CeO2/FeOx@mC700(IG/ID＝1.01)和CeO2/FeOx@mC900(IG/ID＝0.93)相比，CeO2/FeOx@mC500表现出更高的IG/ID比(1.21)，反映了样品中石墨化碳的高含量。多孔碳结构的形成不仅可以提高材料的电子传导性，而且有利于生物分子的固定。
图3的红外谱图中，在3450cm-1处-OH的宽振动带归因于样品表面上吸附的水分子。Ce/Fe-MOF的红外谱图中显示出位于1611和1549cm-1以及1439和1369cm-1的特征谱带，它们分别被称为BTC3-的COO-基团的不对称振动(νas)和对称振动(νs)。用于电化学免疫传感器的支架材料的实施例1～3中的支架材料的红外谱图中，COO-基团带消失，而来自Ce-O拉伸的550cm-1处的带增强，表明有机骨架被分解并形成了金属氧化物。
试验例2
为了进一步研究双金属-有机骨架材料的实施例中的材料Ce/Fe-MOF和用于电化学免疫传感器的支架材料的实施例1～3中的支架材料CeO2/FeOx@mC500、CeO2/FeOx@mC700、CeO2/FeOx@mC900的化学结构和表面组分，分别对其进行了XPS分析，测试结果如图4～图7(图5～图7中的横纵坐标与图4一致)和表1所示。X射线光电子能谱(XPS)测试采用的设备为ESCALAB 250Xi光谱仪(Thermo Fisher Science，Manchester，UK)上。
表1 XPS测试样品的各元素原子比
表1为测试样品各元素的原子含量百分比。由表1可知Ce/Fe-MOF煅烧后得到的CeO2/FeOx@mC复合材料的C元素含量升高，而O元素含量降低。
图4的XPS全谱图中，284.6eV和531.4eV处分别是C 1s和O 1s的特征峰，而705～730eV和880～920eV区域的峰分别是Fe 2p和Ce 3d的特征峰。
Ce/Fe-MOF中各元素的XPS光谱图如图5所示。其中Ce 3d光谱(图5(a))呈现两个标记为v'(885.1eV)和u'(903.9eV)的主峰，它们对应于Ce(III)态；而标记为v(881.8eV)，v”(886.9eV)，u(900.2eV)和u”(907.1eV)的四个峰是Ce(IV)的特征。Fe 2p光谱(图5(b))中，结合能为710.5eV和719.6eV处的峰是Fe(II)的特征峰，而在712.6eV和721.6eV处的峰被归为Fe(III)的特征峰。715.8eV，717.8eV以及724.5eV处的峰值分别归于Fe 2p3/2和Fe 2p1/2的卫星峰值。C 1s光谱中(图5(c))，在284.6eV，285.4eV，288.5eV和290.9eV处存在四个峰，分别对应于C＝C/C-C/C-H，C-O，O＝C-O基团和π-π*键。O 1s光谱(图5(d))可以适合三种有氧基团，分别为C＝O(530.6eV)，C-O(531.9eV)和吸附O(533.0eV)。
用于电化学免疫传感器的支架材料的实施例1～3的支架材料CeO2/FeOx@mC500、CeO2/FeOx@mC700、CeO2/FeOx@mC900的各元素的XPS如图6和图7所示。图6中(a1)～(a3)分别为CeO2/FeOx@mC500中Ce 3d、Fe 2p、O 1s的XPS光谱图，(b1)～(b3)分别为CeO2/FeOx@mC700中Ce3d、Fe 2p、O 1s的XPS光谱图，(c1)～(c3)分别为CeO2/FeOx@mC900中Ce 3d、Fe 2p、O 1s的XPS光谱图。图7中(a)～(c)分别为CeO2/FeOx@mC500、CeO2/FeOx@mC700、CeO2/FeOx@mC900中C 1s的光谱图。
由图6的(a1)、(b1)和(c1)可知，本发明的用于电化学免疫传感器的支架材料的实施例1～3的支架材料的Ce 3d光谱中标记为v0，v'，u0和u'的峰归因于Ce(III)；而v，v”，v”'，u，u'和u”'被分配给Ce(IV)。根据Ce(IV)相关峰面积与Ce 3d各分峰面积之和的比值(Ce元素各价态原子分峰面积与Ce元素相关峰总面积的比值)，实施例1～3中的支架材料中Ce(IV)的计算含量与Ce/Fe-MOF相比有所增加，这是由于在煅烧过程中形成了CeO2晶体。由图6的(a2)、(b2)和(c2)可知，实施例1～3中的支架材料的Fe 2p的光谱中结合能为710.5eV和719.6eV处的峰是Fe(II)的特征峰，而在712.6eV和721.6eV处的峰被归为Fe(III)的特征峰。715.8eV，717.8eV以及724.5eV处的峰值分别归于Fe 2p3/2和Fe 2p1/2的卫星峰值。由图6的(a3)、(b3)和(c3)可知，相比于Ce/Fe-MOF，实施例1～3中的支架材料产生了529.6eV的新峰，这是由于M-O(M＝Ce，Fe)键的生成。
由图7可知，与Ce/Fe-MOF相比，实施例1～3中的支架材料中C元素的XPS光谱中O＝C-O基团相关的峰明显减弱，这是由于在煅烧过程中Ce/Fe-MOF中有机骨架被分解形成碳。
试验例3
对双金属-有机骨架材料的实施例中的Ce/Fe-MOF材料和用于电化学免疫传感器的支架材料的实施例1～3中的CeO2/FeOx@mC500、CeO2/FeOx@mC700、CeO2/FeOx@mC900材料分别进行SEM和TEM测试，测试结果如图8～图10所示。所用设备分别为JSM-6490LV场发射扫描电子显微镜(FE-SEM，日本)和场发射枪为200kV的JEOL JEM-2100高分辨率透射电子显微镜(HR-TEM)。
由图8可知，Ce/Fe-MOF具有直径约100nm和长度为几微米的棒状形状，棒具有光滑的表面并聚集成束。
由图9可知，经过500℃煅烧形成的CeO2/FeOx@mC500显示出轻微的粗糙表面(图9(a)和9(b))；随着煅烧温度从700℃升高到900℃，越来越多的纳米颗粒均匀地生长并在纳米棒上聚集(图9(c)～图9(f))。
由图10可知，CeO2/FeOx@mC500(图10(a)和10(b))的TEM和HR-TEM图像显示纳米棒呈现松散且多孔的结构，其装饰有许多小纳米颗粒，其不仅附着于表面而且嵌入形成的碳棒内。相反，在CeO2/FeOx@mC700(图10(d)和10(e))和CeO2/FeOx@mC900复合物(图10(g)和10(h))的TEM图像中观察到具有不规则形状的大纳米晶体。在图10(c)，10(f)和10(i)中，层间距测量为0.31nm和0.19nm，其指向立方CeO2的(111)和(220)晶面；0.27nm的晶格条纹可以指向CeO2的(200)面和/或Fe2O3的(104)面。在电子选区衍射(SAED)分析(图10(c)，10(f)和10(i)的插图)中显示出了散射的衍射图案和环，表明金属氧化物是多晶结构，说明Ce/Fe-MOF在煅烧过程中逐渐分解并转化为嵌入多孔碳基质中的氧化铈和氧化铁。
试验例4
采用CHI760电化学工作站(中国上海晨华)以纯AE电极作为空白对照进行电化学阻抗(EIS)测试，配备有普通的三电极系统。测试时以电化学免疫传感器为工作电极，Pt丝作对电极，Ag/AgCl(饱和KCl)用作参比电极。测试频率为0.01Hz～100kHz，振幅为5mV。
其中电解液由1.650g K3Fe(CN)6和2.111g K4Fe(CN)6·H2O溶解在1L PBS中制得(K3Fe(CN)6和K4Fe(CN)6·H2O为氧化还原探针)。并用ZView2软件分析EIS光谱，如图11所示，采用Randles等效电路对奈奎斯特(Nyquist)曲线进行模拟。该模型中，Rs为溶液阻抗，CPE为常相位角元件，W为Warburg阻抗，Rct(charge-transfer resistance)为界面电子转移电阻。Rct对应于Nyquist图的半圆直径，反映不同电极表面上的电子转移动力学信息。
图12中，曲线a为裸电极AE的EIS曲线，曲线b～d分别为对比例1～3中的电化学免疫传感器Ce/Fe-MOF/AE、Ab/Ce/Fe-MOF/AE和BSA/Ab/Ce/Fe-MOF/AE的EIS曲线，曲线e为对比例4的电化学免疫传感器BSA/Ab/Ce/Fe-MOF/AE在0.01U/mL的CA19-9溶液中孵育，CA19-9与传感器上的抗体结合形成的CA19-9/BSA/Ab/Ce/Fe-MOF/AE在电解液中测得的EIS曲线。由图12可知，AE，Ce/Fe-MOF/AE，Ab/Ce/Fe-MOF/AE，BSA/Ab/Ce/Fe-MOF/AE和CA19-9/BSA/Ab/Ce/Fe-MOF/AE的Rct值分别为0.10，0.42，0.56，0.62和0.71kohm。
图13中，曲线a为裸电极AE的EIS曲线，曲线b～d分别为对比例4～5及电化学免疫传感器的实施例1中的电化学免疫传感器CeO2/FeOx@mC500/AE、Ab/CeO2/FeOx@mC500/AE和BSA/Ab/CeO2/FeOx@mC500/AE的EIS曲线，曲线e为实施例1的电化学免疫传感器BSA/Ab/CeO2/FeOx@mC500/AE在0.01U/mL的CA19-9溶液中孵育，CA19-9与传感器上的抗体结合形成的CA19-9/BSA/Ab/Ce/Fe-MOF/AE在电解液中测得的EIS曲线。由图13可知，裸AE表示小半圆，Rct值为0.09kΩ，表明转移电阻低；用CeO2/FeOx@mC500修饰后，由于CeO2/FeOx@mC500薄膜阻碍了氧化还原探针和电极之间的电子交换，CeO2/FeOx@mC500/AE的Rct值增加到0.51kΩ；随后，Ab/CeO2/FeOx@mC500/AE的Rct值进一步增加到1.46kΩ，这意味着Ab固定在CeO2/FeOx@mC500层上并阻止电化学探针中的电子转移；当用BSA封闭Ab/CeO2/FeOx@mC500/AE层后，由于空间位阻，观察到Rct值为1.71kΩ的较大半圆。在BSA/Ab/CeO2/FeOx@mC500/AE在0.01U/mL CA19-9溶液中孵育后，电极的转移电阻逐渐增加(Rct＝2.60kΩ)，表明CA19-9被捕获并附着于电化学免疫传感器。
图14中，曲线a为裸电极AE的EIS曲线，曲线b～d分别为对比例6～7及电化学免疫传感器的实施例2中的电化学免疫传感器CeO2/FeOx@mC700/AE、Ab/CeO2/FeOx@mC700/AE和BSA/Ab/CeO2/FeOx@mC700/AE的EIS曲线，曲线e为对实施例2的电化学免疫传感器BSA/Ab/CeO2/FeOx@mC700/AE在0.01U/mL的CA19-9溶液中孵育，CA19-9与传感器上的抗体结合形成的CA19-9/BSA/Ab/Ce/Fe-MOF/AE在电解液中测得的EIS曲线。
图15中，曲线a为裸电极AE的EIS曲线，曲线b～d分别为对比例8～9及电化学免疫传感器的实施例3中的电化学免疫传感器CeO2/FeOx@mC900/AE、Ab/CeO2/FeOx@mC900/AE和BSA/Ab/CeO2/FeOx@mC900/AE的EIS曲线，曲线e为实施例3的电化学免疫传感器BSA/Ab/CeO2/FeOx@mC900/AE在0.01U/mL的CA19-9溶液中孵育，CA19-9与传感器上的抗体结合形成的CA19-9/BSA/Ab/Ce/Fe-MOF/AE在电解液中测得的EIS曲线。
由图14和图15可知，不同支架材料修饰的电化学免疫传感器的Rct的变化趋势相同，但是具体的Rct值不同。
Rct(ΔRct＝Rct，i+1-Rct，i)值的变化可以表示表面覆盖率和粘附层数量。对比例1～9及电化学免疫传感器的实施例1～3中的各电化学免疫传感器的ΔRct以及对比例3及电化学免疫传感器的实施例1～3的电化学免疫传感器在0.01U/mL的CA19-9溶液中孵育，CA19-9与传感器上的抗体结合后的ΔRct值如图16所示，由图16可知，各支架材料Ce/Fe-MOF、CeO2/FeOx@mC500、CeO2/FeOx@mC700、CeO2/FeOx@mC900修饰后的电化学免疫传感器的ΔRct值没有显著差异。然而，在与抗体结合后的电化学免疫传感器的ΔRct值产生明显差异，顺序如下：Ab/CeO2/FeOx@mC500/AE(ΔRct＝0.95kΩ)>Ab/CeO2/FeOx@mC700/AE(ΔRct＝0.40kΩ)>Ab/CeO2/FeOx@mC900/AE(ΔRct＝0.35kΩ)>Ab/Ce/Fe-MOF/AE(ΔRct＝0.14kΩ)，这表明更多的抗体分子固定在CeO2/FeOx@mC500纳米复合材料上。由于更多的抗体分子CA19-9可以在CeO2/FeOx@mC500基电化学免疫传感器上组装，与CeO2/FeOx@mC700，CeO2/FeOx@mC900和Ce/Fe-MOF基电化学免疫传感器相比，观察到更高的ΔRct值。结果表明，CeO2/FeOx@mC500作为支架材料的电化学免疫传感器具有高的灵敏度。
试验例5
将电化学免疫传感器的实施例1中的BSA/Ab/CeO2/FeOx@mC500/AE电化学免疫传感器分别在一系列具有不同浓度的CA19-9标准溶液中孵育后，测定其EIS。CA19-9标准溶液的配制过程为：在0.01M的PBS溶液(pH＝7.4)中加入不同量的CA19-9，配制成浓度分别为0，0.0001，0.001，0.01，0.1，1.0，5.0和10U/mL的。
测试结果如图17～19所示。由图17可知随着CA19-9浓度增加，电化学免疫传感器的半圆直径增加。由图18和图19可知，电化学免疫传感器的ΔRct值随着CA19-9的在0.0001至10U/mL范围的对数浓度内线性增加。回归方程为ΔRct＝1.522+0.184log10CCA19-9，相关系数为0.996，检测限(LOD)可以计算为0.000025U/mL，信噪比(S/N)为3。
本发明的电化学免疫传感器的实施例1中的BSA/Ab/CeO2/FeOx@mC500/AE电化学免疫传感器与现有技术中其他测试方法(表2)相比，在检测CA19-9时显示出优异的灵敏度和低LOD。这得益于Ce/Fe-MOF衍生的CeO2/FeOx@mC纳米复合材料的明确的多孔结构和化学功能，其中CeO2/FeOx纳米晶体均匀地嵌入并分布在整个多孔碳基质中，实现了将大量抗体分子锚定在CeO2/FeOx@mC基板上。同时，CeO2/FeOx@mC具有良好的电化学性能，稳定性和生物相容性，这也有利于促进电子转移和加载大量抗体，从而放大输出信号并对CA19-9进行超灵敏检测。
表2本发明的电化学免疫传感器与用于检测CA19-9的其他方法之间的比较。
(A～I的具体信息为：A:Signal Amplification in Capillary ElectrophoresisBased Chemiluminescent Immunoassays by Using an Antibody–Gold Nanoparticle–DNAzyme Assembly.Talanta 2014,124,14-20；B:L-Proline Bio-Inspired Synthesis ofAuPt Nanocalliandras as Sensing Platform for Label-Free ElectrochemicalImmunoassay of Carbohydrate Antigen 19-9.Sensors and Actuators B:Chemical2017,250,61-68；C:Multiplex Electrochemical Origami Immunodevice Based OnCuboid Silver-Paper Electrode and Metal Ions Tagged Nanoporous Silver–Chitosan.Biosensors and Bioelectronics 2014,56,167-173；D:UltrasensitiveElectrochemical Immunosensor for Carbohydrate Antigen19-9Using Au/porousGraphene Nanocomposites as Platform and Au@Pd Core/Shell BimetallicFunctionalized Graphene Nanocomposites as Signal Enhancers.Biosensors andBioelectronics 2015,66,356-362；E：A One-Step ElectrochemiluminescenceImmunosensor Preparation for Ultrasensitive Detection of Carbohydrate Antigen19-9 Based On Multi-Functionalized Graphene Oxide.Biosensors andBioelectronics 2015,66,468-473；F：A Novel Sandwich ElectrochemiluminescenceImmunosensor for Ultrasensitive Detection of Carbohydrate Antigen 19-9 BasedOn Immobilizing Luminol On Ag@BSA Core/Shell Microspheres.Biosensors andBioelectronics 2016,75,206-212；G：Ultrasensitive PhotoelectrochemicalImmunoassay for CA19-9Detection Based On CdSe@ZnS Quantum Dots SensitizedTiO2NWs/Au Hybrid Structure Amplified by Quenching Effect of Ab2@V2+Conjugates.Biosensors and Bioelectronics 2016,77,339-346；H:An UltrasensitiveMulti-Walled Carbon Nanotube–Platinum–Luminol Nanocomposite-BasedElectrochemiluminescence Immunosensor.Analyst 2017,142(12),2253-2260；I：CA19-9Pancreatic Tumor Marker Fluorescence Immunosensing Detection Via ImmobilizedCarbon Quantum Dots Conjugated Gold Nanocomposite.International journal ofmolecular sciences,2018,19(4),1162。)
试验例6
为了评估本发明的BSA/Ab/CeO2/FeOx@mC500/AE电化学免疫传感器的免疫分析的特异性，在0.0001U/mL CA19-9存在下，分别测试了浓度为0.01ng/mL的一些代表性干扰蛋白(包括VEGF，IgG，CEA，MUC1，EGFR，PSA，AFP和CA125)的影响。如图20所示，与在CA19-9溶液中获得的信号变化的结果相比，在干扰溶液中没有观察到显著的ΔRct值。它表明，由于抗体-抗原相互作用，本发明的电化学免疫传感器具有高度特异性。
采用独立制备的五个BSA/Ab/CeO2/FeOx@mC500/AE电化学免疫传感器(分别标记为1，2，3，4，5)检测0.0001U/mL的CA19-9来验证本发明的电化学免疫传感器的再现性。测试结果如图21所示，获得3.74％的相对标准偏差(RSD)，表明本发明的电化学免疫传感器具有良好再现性。
为了评估BSA/Ab/CeO2/FeOx@mC500/AE电化学免疫传感器的储存稳定性，将传感器储存在4℃条件下并每天测量一次。从图22可以看出，在长达两周的储存时间后，对相同浓度的CA19-9的Rct反应表现出相对小的变化(RSD＝3.72％)，表明本发明的电化学免疫传感器具有可接受的稳定性。
另外，通过将使用后的BSA/Ab/CeO2/FeOx@mC500/AE电化学免疫传感器在1M H2SO4溶液中浸泡20min再生电化学免疫传感器，并用PBS彻底洗涤。接下来，进行EIS测量并连续重复该过程。如图23所示，可观察到CA19-9溶液的可重复Rct反应信号，证明所本发明的电化学免疫传感器的再生性也是良好的。
试验例7
将BSA/Ab/CeO2/FeOx@mC500/AE电化学免疫传感器用于检测含不同的CA19-9浓度的人血清样品，其中人血清为用PBS溶液稀释100倍后的人血清。记录EIS图，然后计算本发明的电化学免疫传感器吸附的CA19-9值。测试结果如表3所示，如表3所总结，CA19-9测定的回收率为95.2～106.4％，RSD值小于2％，表明本发明的电化学免疫传感器具有理想的实用性。
表3人血清样品中的CA19-9测定结果
Claims (10)
1.一种双金属-有机骨架材料，其特征在于，所述双金属-有机骨架材料的中心离子金属为Ce3+离子和Fe3+离子。
2.一种如权利要求1所述的双金属-有机骨架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将可溶性铈盐和可溶性铁盐的混合溶液与有机配体溶液混合，然后老化，过滤干燥即得。
3.根据权利要求2所述的双金属-有机骨架材料的制备方法，其特征在于，所述可溶性铈盐中铈和可溶性铁盐中铁的摩尔比为(0.5～1.5):(0.5～1.5)。
4.一种用于电化学免疫传感器的支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将如权利要求1所述的双金属-有机骨架材料于惰性气氛中在500～900℃煅烧处理，即得。
5.根据权利要求4所述的用于电化学免疫传感器的支架材料的制备方法，其特征在于，所述煅烧处理的时间为1～3h。
6.一种采用如权利要求4所述的用于电化学免疫传感器的支架材料的制备方法制得的支架材料。
7.一种电化学免疫传感器，包括基底电极、修饰于基底电极上的支架材料以及固定在支架材料上的生物敏感材料，其特征在于，所述支架材料为权利要求6所述的支架材料。
8.一种如权利要求7所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将支架材料的悬浮液滴加到基底电极上，干燥后在含生物敏感材料的溶液中进行浸泡，取出后洗涤，即得。
9.根据权利要求8所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述支架材料的悬浮液是将支架材料分散在pH为7.0～7.4的缓冲溶液中得到，支架材料的浓度为0.5～2mg/mL。
10.一种电化学免疫传感器在癌症早期检测癌症标志物方面的应用，其特征在于，所述电化学免疫传感器为权利要求7所述的电化学免疫传感器，所述生物敏感材料为CA19-9抗体。
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