CN108051491B - 一种用于检测lag-3蛋白的电化学免疫传感器 - Google Patents
一种用于检测lag-3蛋白的电化学免疫传感器 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108051491B CN108051491B CN201711367978.1A CN201711367978A CN108051491B CN 108051491 B CN108051491 B CN 108051491B CN 201711367978 A CN201711367978 A CN 201711367978A CN 108051491 B CN108051491 B CN 108051491B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lag
- electrode
- solution
- albumen
- immunosensor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
- G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
- G01N27/3278—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction involving nanosized elements, e.g. nanogaps or nanoparticles
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
Abstract
本发明提供一种用于检测LAG‑3蛋白的电化学免疫传感器，包括工作电极、参比电极和辅助电极，工作电极由基底电极修饰rGO‑SnO2与Ni‑Co层状双氢氧化物的复合物获得。本发明具有结构优势和优异的导电性，表现出优异的电催化活性，使用生物素‑链霉亲和素蛋白系统来提高所提出的免疫传感器的灵敏度。此外，SiO2的利用增加了电化学信号的区别。由于这些优点，所提出的免疫传感器具有很宽的线性范围，检测下限为1.1pg·mL‑1，满足了对低量LAG‑3在人血清中的检测，为临床早期肿瘤诊断应用中测定LAG‑3提供了一种新的方法。因此，本发明有可能用于确定用于临床诊断的生物标志物。
Description
技术领域
本发明涉及电化学领域，特别是涉及一种用于检测LAG-3蛋白的电化学免疫传感器。
背景技术
淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)是在活化的CD4+和CD8+T细胞上表达的I型跨膜蛋白。作为负检查点抑制剂，LAG-3负调节T细胞功能，从而促进肿瘤逃逸。LAG-3浓度的变化可能被认为是HIV感染、冠状动脉疾病、慢性淋巴细胞白血病、黑色素瘤、肾细胞癌、胰腺癌、前列腺癌等疾病的标志。作为潜在的肿瘤生物标志物，在人类癌症患者中，已发现LAG-3优先在一些肿瘤亚型中与外周相比表达。因此，开发具有高灵敏度和特异性的LAG-3检测方法对临床实时监测和早期诊断至关重要，以减少对人体健康的不利影响。根据文献报道，免疫印迹、化学发光、酶联免疫吸附试验和胸苷掺入试验已被用于LAG-3检测，这些方法可以检测到LAG-3，具有很高的准确性和稳定性。然而，这些方法的样品前处理过程复杂，且需要昂贵的设备，较长的检测时间和复杂的样品制备，上述缺点限制了这些方法在临床检测的床旁检测的使用。近年来，电化学免疫传感器已被用于便携式设备和即时护理应用中。因此，电化学免疫传感器已被开发出来并被广泛用于检测肿瘤标志物、食品添加剂和环境污染物。
现有的电化学免疫传感器对LAG-3的检测灵敏度不够，亟待改进。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于检测LAG-3蛋白的电化学免疫传感器，用于解决现有技术中对LAG-3的检测灵敏度低、准确性和稳定性差等问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种用于检测LAG-3蛋白的复合物，由rGO-SnO2与Ni-Co层状双氢氧化物中空纳米体通过Au-NH2和Pt-NH2键结合获得。
本发明第二方面提供上述复合物的制备方法，包括如下步骤：
1)将Co(NO3)2溶于CTAB水溶液中，得到混合液，再将2-甲基咪唑溶液加入该混合液中，固液分离，得到钴基沸石咪唑骨架纳米立方体；
2)将步骤1)制得的钴基沸石咪唑骨架纳米立方体溶于乙醇中，再加入含有Ni(NO3)2的乙醇溶液，反应结束后，固液分离，干燥，得到Ni-Co层状双氢氧化物中空纳米体；
3)将步骤2)制得的Ni-Co层状双氢氧化物中空纳米体分散于水中，加入NaBH4乙醇溶液，反应结束后，滴加H2PtCl6乙醇溶液和HAuCl4乙醇溶液，反应结束后，滴加NaBH4乙醇溶液，反应结合后，固液分离，将固体干燥，得到产物；
4)rGO-SnO2复合物分散于乙醇中，加入APTES，反应结束后，固液分离，干燥，将所得产物rGO-SnO2-APTES分散于水中，制成水溶液，将该水溶液与步骤3)所得产物的水溶液混合，反应结束后，固液分离，得到所述用于检测LAG-3蛋白的复合物。
在本发明的一些实施例中，rGO-SnO2复合物与Ni(NO3)2的质量比为2：1。
在本发明的一些实施例中，步骤3)中，H2PtCl6乙醇溶液的体积为5mL，其中H2PtCl6的浓度为0.5-1.5wt％。
在本发明的一些实施例中，步骤3)中，HAuCl4乙醇溶液的体积为5mL，其中HAuCl4的浓度为1wt％。
本发明第三方面提供一种用于检测LAG-3蛋白的夹心型电化学免疫传感器，包括工作电极、参比电极和辅助电极，所述工作电极由基底电极修饰上述复合物获得。
在本发明的一些实施例中，所述基底电极上还修饰有链霉亲和素。
在本发明的一些实施例中，所述基底电极为玻碳电极。
本发明第四方面提供上述电化学免疫传感器中工作电极的制备方法，包括如下步骤：
a)将上述用于检测LAG-3蛋白的复合物滴加至基底电极基底电极表面，干燥，得到修饰电极，备用；
b)将链霉亲和素涂覆至步骤a)制得的修饰电极表面，通过Au-NH2和Pt-NH2键将链霉亲和素与AuPt合金结合，再将生物素修饰的抗体滴加至电极表面，反应结束后，采用BSA溶液封闭电极，得到所述工作电极。
在本发明的一些实施例中，步骤a)中，用于检测LAG-3蛋白的复合物浓度为1.0-3.0mg·mL-1。
在本发明的一些实施例中，步骤b)中，链霉亲和素的浓度为0.1-0.5μg·mL-1。
在本发明的一些实施例中，步骤b)中，生物素修饰的抗体浓度为1.0-3.0μg·mL-1。
本发明第五方面提供一种用于检测LAG-3蛋白的试剂盒，包括上述电化学免疫传感器、L-半胱氨酸修饰的SiO2。
在本发明的一些实施例中，还包括抗LAG-3、EDC/NHS溶液、牛血清白蛋白。
本发明第六方面提供一种用于检测LAG-3蛋白的方法，采用上述试剂盒，包括如下步骤：
1)将L-半胱氨酸修饰的SiO2、抗LAG-3、EDC/NHS溶液混合，反应结束后，加入牛血清白蛋白溶液，封闭L-半胱氨酸修饰的SiO2表面剩余的活性位点，固液分离，得到结合物；
2)将LAG-3溶液滴加到所述工作电极上，采用PBS冲洗后，再将步骤1)制得的结合物滴加至所述工作电极上，温育后，采用PBS冲洗，在背景电流稳定后，向工作缓冲溶液中加入H2O2，进行电化学测量。
在本发明的一些实施例中，步骤1)中，L-半胱氨酸修饰的SiO2浓度为1-5mg·mL-1。
在本发明的一些实施例中，步骤2)中，LAG-3的固定时间为20-100min。
在本发明的一些实施例中，步骤2)中，PBS的pH为6.4-7.2。
在本发明的一些实施例中，步骤2)中，H2O2的浓度为2-4mmol·L-1。
如上所述，本发明的一种用于检测LAG-3蛋白的电化学免疫传感器，具有以下有益效果：一方面，本发明具有结构优势和优异的导电性，表现出优异的电催化活性；另一方面，有效提高免疫传感器的灵敏度。此外，SiO2的利用增加了电化学信号的区别。由于这些优点，所提出的免疫传感器具有很宽的线性范围，检测下限为1.1pg·mL-1，满足了对低量LAG-3在人血清中的检测，为临床早期肿瘤诊断应用中测定LAG-3提供了一种新的方法。因此，本发明有可能用于确定用于临床诊断的生物标志物。
附图说明
图1显示为本发明实施例的纳米复合材料FE-SEM和TEM形貌表征图，其中
FE-SEM
(A)ZIF-67nanocube-MOFs；
(B)ZIF-67-LDH hollow nanobox-MOFs；
(C)hollow nanobox-MOFs/AuPt alloys；
(G)rGO-SnO2；
(H)rGO-SnO2/hollow nanobox-MOFs/AuPt alloys；
TEM
(D)ZIF-67nanocubes-MOFs；
(E)ZIF-67-LDH hollow nanobox-MOFs；
(F)hollow nanobox-MOFs/AuPt alloys；
EDX
(I)of rGO-SnO2/hollow nanobox-MOFs/AuPt alloys。
图2显示为本发明实施例中电极的CV和EIS测量曲线图，其中
EDX
(A)ZIF-67nanocube-MOFs；
(B)ZIF-67-LDH hollow nanobox-MOFs；
(C)AuPt alloys；
(D)hollow nanobox-MOFs/AuPt alloys；
(E)rGO-SnO2。
图3显示为本发明实施例中SiO2SEM图以及Ab2、SiO2、cys-SiO2-tag-Ab2的紫外-可见光谱图，其中
SEM(A)SiO2；
UV-vis spectrums(B)Ab2(a),SiO2(b),and cys-SiO2-tag-Ab2(c)。
图4显示为本发明实施例中逐步修饰电极的循环伏安响应曲线、阻抗响应曲线，其中
(a)GCE；
(b)rGO-SnO2/hollow nanobox-MOFs/AuPt alloys；
(c)streptavidin/rGO-SnO2/hollow nanobox-MOFs/AuPt alloys；
(d)Bio-Ab1/streptavidin/rGO-SnO2/hollow nanobox-MOFs/AuPt alloys；
(e)BSA/Bio-Ab1/streptavidin/rGO-SnO2/AuPt alloys/hollow nanoboxes；
(f)LAG-3/BSA/Bio-Ab1/streptavidin/rGO-SnO2/AuPt alloys/hollownanoboxes；
(g)cys-SiO2-tag-Ab2/LAG-3/BSA/Bio-Ab1/streptavidin/rGO-SnO2/hollownanobox-MOFs/AuPt alloys。
图5显示为本发明实施例中各放大策略之间的电催化电流响应变化图，其中
基底材料
A(a)hollow nanobox-MOFs(b)hollow nanobox-MOFs/AuNPs；
B(a)hollow nanobox-MOFs/AuNPs(b)hollow nanobox-MOFs/AuPt alloys；
链霉亲和素系统比较
C LAG-3/BSA/Bio-Ab1/rGO-SnO2/hollow nanobox-MOFs/AuPt alloys:(a)LAG-3(blank)and(b)LAG-3(10μg·mL-1)；
D LAG-3/BSA/Bio-Ab1/streptavidin/rGO-SnO2/hollow nanobox-MOFs/AuPtalloys:(a)LAG-3(blank)and(b)LAG-3(10μg·mL-1)；
信号标签比较
E LAG-3/BSA/Bio-Ab1/streptavidin/rGO-SnO2/hollow nanobox-MOFs/AuPtalloys:(a)LAG-3(blank)and(b)LAG-3(10μg·mL-1)；
F cys-SiO2-tag-Ab2/LAG-3/BSA/Bio-Ab1/AuPt alloys hollow nanoboxes:(a)LAG-3(blank)and(b)LAG-3(10μg·mL-1)。
图6显示为本发明实施例中各优化条件下所构建的电化学免疫传感器差分脉冲伏安扫描结果图，其中：
(A)concentration of rGO-SnO2/hollow nanobox-MOFs/AuPt alloys；
(B)concentration of streptavidin；
(C)concentration of Bio-Ab1；
(D)immobilization time of the LAG-3；
(E)concentration of cys-SiO2；
(F)pH value of supporting electrolyte；
(G)concentration of H2O2；
(H)the quantity of Pt NPs。
图7显示为本发明实施例的电化学性能分析图，其中
(A)不同浓度(0、0.01、0.1、1、10、100、1000ng/mL)电化学i-t响应曲线；
(B)新型夹心法电化学传感器标准曲线；
(C)新型夹心法电化学传感器重复性分析；
(D)新型夹心法电化学传感器特异性分析。
图8显示为本发明实施例的新型夹心法电化学传感器稳定性分析图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
1概述
作为一种最新发现的生物标志物，淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)优先在多种肿瘤亚型中与外周表达。因此，本发明开发了一种新型电化学夹心免疫传感器，用于超灵敏定量测定LAG-3。本发明首次在电化学免疫传感器上合成并应用了新型中空纳米金属和有机框架(MOFs)纳米复合材料，利用L-半胱氨酸修饰的SiO2标记LAG-3抗体(cys-SiO2-tag-Ab2)信号材料和用于信号放大的生物素-链霉亲和素蛋白系统。值得注意的是，将二氧化锡功能化的还原氧化石墨烯(rGO-SnO2)以及金和铂合金(AuPt alloy)封装在中空纳米复合材料MOFs表面，制备rGO-SnO2/nanobox-MOFs/AuPt alloy作为基体，由于基体纳米复合材料具有较高的电导率，催化H2O2的能力强，已被用作固定链霉亲和素的理想载体平台，因此，它们被进一步用于固定更多的生物素修饰抗体(Bio-Ab1)。由于用作标记的cys-SiO2-tag-Ab2具有较大的空间位阻，可以利用cys-SiO2-tag-Ab2增强抗体与抗原特异识别后的电化学信号的区别。从这个意义上说，这种新型免疫夹心法传感器可以达到很高的灵敏度，特别是在低浓度的LAG-3存在的情况下。在最佳条件下，该新型三明治设计的免疫传感器对LAG-3的检测灵敏度为0.01ng·mL-1～1μg·mL-1，检出限为1.1pg·mL-1(以3σ为基准)。我们提出这种超灵敏的生物传感器可以应用于临床早期肿瘤诊断中LAG-3的测定。
在电化学免疫传感器策略中，具有催化能力的纳米复合材料被用作基底材料，这是在设计的免疫传感器中获得灵敏度的关键因素。纳米结构材料由于其特殊的结构而具有独特的性质，近年来引起了人们的广泛关注，在众多的纳米材料中，具有较高的比表面积与体积比和独特的结构特征的中空纳米结构已经显示出作为电极材料的巨大前景。因此，中空纳米材料被广泛用于信号放大和提高电化学免疫传感器的灵敏度。
在此基础上，我们开发了一种基于金属-有机骨架(MOF)的合成方法来合成二氧化锡功能化还原氧化石墨烯(rGO-SnO2)，其中包括Ni-Co中空纳米MOFs混合AuPt合金(rGO-SnO2/nanobox-MOFs/AuPt alloy)作为基体电活性材料，并表现出令人满意的电催化性能的还原过氧化氢。为提高生物传感器的电导率和灵敏度，rGO-SnO2被认为是一种理想的材料，可以提供大比表面积以改善导电性和增加负载物质。为了进一步提高表面积和促进电子转移，引入了nanobox-MOFs/AuPt alloy与rGO-SnO2作为基本材料。Ni-Co纳米空心球是一种新型的主体基质，具有较高的化学反应活性和较大的表面/体积比。此外，双金属合金在催化中具有特别重要的意义，因为第二种金属的加入提供了对催化活性和化学选择性有贡献的化学和物理性质的变化。具体而言，铂基双金属体系已经被证明是具有显著改善的催化和电催化活性的新型结构。特别是AuPt合金纳米颗粒与纯Pt和纯Au相比，具有更高的催化活性和更强的功能。在这个系统中，AuPt合金不仅被选择为基底材料和被吸附物质之间的连接，还被用作纳米盒和rGO-SnO2之间的连接。为了进一步提高免疫传感器的灵敏度，在免疫夹心传感器中来固定更多的目标LAG-3。选择生物素-链霉亲和素系统，是由于链霉亲和素对生物素的高度特异性和强亲和力。即单个分子链霉亲和素可以与四个生物素分子结合，展现出链霉亲和素-生物素相互作用的高效性。因此，通过对生物素-链霉亲和素系统的高度选择性识别，生物素修饰的抗体(Bio-Ab1)可以有效地固定在电极表面，以实现更高的灵敏度。因此，我们将rGO-SnO2/nanobox-MOFs/AuPt alloy纳米复合材料作为良好载体和桥梁，采用生物素-链霉亲和素体系高效固定检测蛋白，提高了灵敏度和选择性。
夹心法免疫传感器作为最常用的电化学分析模型，由于其在电化学免疫传感器方面具有突出的便利性，超灵敏性和选择性，被广泛应用于临床疾病诊断。在典型的夹心式电化学传感器中，多功能纳米材料作为标记，并且使用标记的二抗(Ab2)的制备来实现具有良好电化学特性的信号放大。随着抗原浓度的增加，与Ab2结合的标记数量也相应增加，导致电化学信号的增强和免疫传感器灵敏度的提高。显然，标记物是提高传统夹心免疫传感器灵敏度的关键因素。然而，抗体与抗原之间的特异性识别可以在修饰电极上产生疏水性绝缘层，阻碍电子转移。因此，灵敏度可能会受到一定程度的限制。
在本文中，为了实现低浓度LAG-3的测量，可以使用具有较差的电子传递能力和较差的电催化活性的标记来增强电化学信号的变化。二氧化硅(SiO2)因其尺寸均匀，生物相容性好，毒性低，生物应用成本低，而且还具有位阻大，电子转移能力弱，电催化活性差等缺点。通过将半胱氨酸(cys)连接到Ab2上作为标记物，在该免疫传感器中将氨基施加到SiO2上以形成新的夹心型。所得到的结合物(cys-SiO2-tag-Ab2)和抗原均可促进电催化电流响应的降低，增加电流差异，并有助于提高所设计的免疫传感器的灵敏度。
在此基础上，本发明将rGO-SnO2/nanobox-MOFs/AuPt alloy纳米复合材料作为基体电活性材料和信号放大标签cys-SiO2-tag-Ab2进行组装，开发了一种新型的夹心无酶电化学免疫传感器。首先，基底材料直接滴涂在GCE表面，产生电化学信号。为了固定Bio-Ab1并进一步提高我们的免疫传感器的灵敏度，我们通过利用NH2-Au和NH2-Pt的键合亲和力来连接链霉亲和素。众所周知，链霉亲和素和生物素之间的高亲和力有利于捕获特定类型的蛋白。通过抗原抗体反应，cys-SiO2-tag-Ab2包被免疫传感器，提高了灵敏度。最后，所提出的生物传感器通过还原过氧化氢来放大电化学信号，获得了良好的电化学信号响应。所建议的无酶新型夹心免疫传感器对人血清中LAG-3的定量测定具有较高的灵敏度，在临床诊断LAG-3检测中具有相当的潜力。
2实验部分
2.1化学试剂
人类淋巴细胞激活基因3蛋白(LAG-3)ELISA试剂盒，购自Cusabio有限公司(中国武汉)；抗LAG-3抗体购自生物生工科技有限公司(中国上海)；氯化金(HAuCl4·4H2O)、牛血清白蛋白(BSA)、氯铂酸(H2PtCl6)、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)、硼氢化钠(NaBH4)均来自Sigma-Aldrichgon公司；氧化石墨烯购自南京先丰材料科技有限公司(中国)；2-甲基咪唑、六水合硝酸钴(Co(NO3)2·6H2O)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、六水合硝酸镍(Ni(NO3)2·6H2O)、二氧化硅(500nm)和L-半胱氨酸购自阿拉丁试剂有限公司。使用含有0.1MNa2HPO4、0.1M KH2PO4和0.1M KCl的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.8)作为工作缓冲液；所有其他试剂都是分析纯，不经进一步纯化即可使用；所有水溶液均使用超纯水(≥18MΩ·cm)制备。
2.2分析仪器
电化学测量，包括循环伏安法(CV)、计时电流分析法(i-t)和电化学阻抗谱(EIS)都在三电极系统的AUTOLAB PGSTAT302N电化学工作站上进行；其中铂丝作为辅助电极，以Ag/AgCl(含3M KCl)为参比电极，经rGO-SnO2/nanobox-MOFs/AuPt alloy包被的3mm直径的玻碳电极(GCE)作为工作电极；使用Hitachi S4800(Hitachi Limited，Japan)获得场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)图像；透射电子显微镜(TEM)图像从JEM-2100F显微镜(日本)获得；通过使用Lambda 35UV/vis分光计(Perkin-Elmer，美国)进行UV-vis测量。
2.3ZIF-67纳米立方体和ZIF-67-LDH中空纳米盒的合成
钴基沸石咪唑骨架(ZIF-67)纳米立方体和Ni-Co层状双氢氧化物(ZIF-67-LDH)中空纳米体是通过表面活性剂介导的方法合成的。简言之，将58mg Co(NO3)2·6H2O溶于2毫升含有3毫克CTAB的超纯水中。然后，将该溶液迅速注入14mL含有908mg 2-甲基咪唑的超纯水溶液中，溶液的颜色立即从无色变为紫色，并在室温下搅拌20分钟。通过离心收集产物，并用乙醇以10000rpm的转速洗涤10分钟，六次。
合成ZIF-67-LDH中空纳米盒的方法如下：将30mg ZIF-67纳米立方体分散到20mL乙醇中，然后，加入5毫升含有50毫克Ni(NO3)2的乙醇溶液。然后搅拌混合物1分钟。随后，将反应容器置于超声波浴中(超声波发生器的功率为600W)90分钟。最后，将产物以8000rpm离心5分钟，用10mL超纯水洗涤6次以除去未反应的化学物质，然后在70℃下干燥。
2.4合成hollow nanobox/AuNPs,nanobox-MOFs/AuPt alloy和rGO-SnO2/nanobox-MOFs/AuPt alloy
为了合成中空的nanobox-MOFs/AuPt alloy，将10mg中空纳米体分散到10mL超纯水中，剧烈振荡2min，然后超声处理1h以获得均匀溶液。然后加入10mL的NaBH4乙醇溶液(0.05mol·L-1)。搅拌20分钟后，向溶液中滴加5毫升1％H2PtCl6乙醇溶液和5毫升1％HAuCl4乙醇溶液，超声处理30分钟。然后，将2mL的NaBH4乙醇溶液(0.05mol·L-1)滴加到该溶液中，并将该溶液超声处理30分钟。最后，将产物以8000rpm离心5分钟，并用超纯水洗涤三次并在70℃下干燥。除了使用5mL的1％HAuCl4乙醇溶液代替5mL的1％H2PtCl6之外，hollownanobox/AuNPs的合成与nanobox-MOFs/AuPt alloy的合成相同。
合成rGO-SnO2/nanobox-MOFs/AuPt alloy的方法如下：首先，将0.1g rGO-SnO2复合物分散在25mL乙醇中，超声处理至少30分钟以获得均匀分散的溶液。然后，加入0.1mL的APTES并在70℃下搅拌1.5小时。冷却至室温后，8000rpm离心5分钟并用超纯水洗涤三次。最后，将制备的产物在70℃下干燥。随后，将10mg rGO-SnO2-APTES分散在10mL超纯水中并进行超声处理以获得均匀分散溶液。接下来，将溶液与nanobox-MOFs/AuPt alloy(1mg·mL-1，10mL)混合，超声处理并搅拌过夜。得到的rGO-SnO2/nanobox-MOFs/AuPt alloy通过Au-NH2和Pt-NH2键结合获得。随后，将混合物以8000rpm离心5分钟3次并在70℃下干燥。
2.5cys-SiO2和cys-SiO2-tag-Ab2的制备
L-半胱氨酸修饰的SiO2(cys-SiO2)是根据文献的一步法合成的。简而言之，将干燥的SiO2粉末悬浮于2mL水中，随后加入5mL的1mM L-半胱氨酸水溶液，并超声处理30分钟。为了获得纯化产物，将溶液进行重复离心(5000rpm，5分钟)和洗涤循环三次。最后，溶液在70℃下干燥。
为了固定抗LAG-3，将cys-SiO2(3mg·mL-1,2mL)、1mL抗LAG-3(10μg·mL-1)和1mLEDC/NHS(10mM/2mM)在4℃下搅拌12小时。在中等交联剂EDC/NHS存在下，cys-SiO2和抗LAG-3通过-NH2和-COOH基团之间的相互作用连接起来。然后，在混合物中加入1mL BSA(w/w，1％)4小时以封闭cys-SiO2表面上剩余的活性位点。在8000rpm离心5分钟并用PBS洗涤几次后，将所得的cys-SiO2-tag-Ab2标记，将离心后的沉淀重新分散在2mL的PBS中并在4℃下储存。
2.6电化学免疫传感器的构建
使用0.3μm和0.05μm的氧化铝浆料将裸露的GCE重复抛光成镜面状。然后，将GCE依次用超纯水、无水乙醇和超纯水分别超声洗涤3分钟。在室温氮气中干燥后，将5mg 2mg·mL-1rGO-SnO2/nanobox-MOFs/AuPt alloy复合材料滴加到GCE表面，并在空气中干燥。随后，将10μL链霉亲和素(300ng·mL-1)涂覆到修饰的电极表面上，并通过Au-NH2和Pt-NH2键将链霉亲和素与AuPt合金结合。将电极在4℃下储存过夜以使链霉亲和素蛋白更有效地与rGO-SnO2/nanobox-MOFs/AuPt alloy结合。反应后，用0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.8)溶液除去未固化的结合反应物以彻底清洗电极，然后在氮气中干燥。接下来，在37℃下将10μL生物素修饰的抗体(Bio-Abl)(2μg·mL-1)滴加到制备的电极表面1小时，接着用6μL BSA溶液(1％，w/v)在37℃封闭电极30分钟以阻断非特异性吸附。
2.7电化学测量
将10μL不同浓度范围从10pg·mL-1至1μg·mL-1之间的LAG-3标准溶液滴加到修饰电极上，37℃。用PBS彻底冲洗后，将10μL的cys-SiO2-tag-Ab2滴在电极上并再温育60分钟。用PBS洗涤至少三次以冲洗未结合的cys-SiO2-tag-Ab2，用于电化学测量的工作电极。电压-0.4V，在背景电流稳定后，向8mL工作缓冲溶液(pH＝6.8)中加入10μL H2O2(3mmol·L-1)，记录i-t曲线中电流值的变化。
3结果与讨论
3.1各种纳米材料的表征
采用FE-SEM和TEM对纳米复合材料的形貌进行表征。如图1A所示，得到的纳米立方体表面光滑，均匀，平均直径约200nm。TEM图像(图1D)同时验证了纳米立方体的立方体形状。能量色散X射线(EDX)图2A证实了ZIF-67纳米立方体的形成。在25℃下与适量的Ni(NO3)2反应90分钟后，固体纳米立方体被转化为纳米立方盒。图1B所示的FE-SEM图像表明，颗粒仍然保留了前体ZIF-67纳米立方体的固体形态和尺寸，但表面变得粗糙(图1E)。透射电镜图像(图1E)清晰地表明纳米体表面是由纳米片组装的。纳米杆的空心内部可以通过片层与纳米盒的内部空隙之间的对比来观察。壳的厚度约为10nm。EDX谱图(图2B)揭示了Ni元素的存在，表明纳米盒的形成。当AuPt纳米粒子形成在纳米盒的表面时，FE-SEM图像(图1C)表明纳米盒的边缘明显塌陷，并被颗粒状物质所包裹而增厚。图1F所示的TEM图像显示了附着在立方体盒边缘上的球形AuPt NP颗粒。EDX(图2C)同时显示了包含Au和Pt的框架边缘的颗粒物质的特征元素，证明颗粒物质是AuPt合金。EDX图像的检查(图2D)显示Au、Pt、Co、Ni、C、O和N的特征元素可以被观察到，这意味着AuPt合金成功加载到纳米盒上。如图1G所示，rGO-SnO2呈小圆形金属颗粒的皱纹纸状结构，并且可以提供用于AuPt合金中空纳米杆的改性的大的表面积。EDX(图2E)显示了C、O和Sn的特征元素。如图1H所示，在rGO-SnO2-APTES与nanobox-MOFs/AuPt alloy搅拌后，褶皱的纸样结构明显地附着到几个立方体固体上。对EDX图像(图1I)的检查表明，可以观察到Sn、Au、Pt、Co、Ni、C、O和N等特征元素，证实rGO-SnO2-APTES-nanobox-MOFs/AuPt alloy的合成。
图3A显示了SEM图像，其表示SiO2的平均尺寸为550nm。为了证实Ab2可以被标记到cys-SiO2表面，SiO2，Ab2和cys-SiO2-tag-Ab2的紫外可见光谱如图3B所示。观察到在278nm的吸收峰对于Ab2分散(曲线a)。cys-SiO2水溶液(曲线b)没有明显的吸收峰。因此，278nm处的吸收峰主要归因于cys-SiO2-tag-Ab2水溶液中Ab2的存在(曲线c)。因此，可以得出结论，Ab2成功地结合在cys-SiO2表面。
3.2逐步修饰电极的电化学表征
逐步进行CV和EIS测量，以检查在含有0.1M KCl的5mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中制造过程中修饰电极的界面性质。在0.1V·s-1的扫描速率下从-0.2V到+0.6V进行CV测量。如图4A所示，裸玻碳电极曲线表现出明确的可逆氧化还原峰(曲线a)。在曲线b中，显示了rGO-SnO2/nanobox-MOFs/AuPt alloy修饰电极的结果，由于纳米复合材料促进了电子转移，氧化还原峰电流显着增加。链霉亲和素加入后，峰值电流显着下降(曲线c)，因为在链霉亲和素与生物素的作用下，亲和性的表面和诱导的电导率如所预期的减少，生物的Ab1结合引起的屏蔽效应并减少电子转移率(曲线d)。接着，添加作为封闭剂的非导电性BSA导致峰电流的另一个降低(曲线e)。随后，由于抗原抗体反应产生高电阻，抗原作为惰性电子和传质阻挡层，与LAG-3(曲线f)结合后电流持续下降。最后，由于cys-SiO2-tag-Ab2与LAG-3的特异性结合(曲线g)，峰值电流降低到最小值。这一结果归因于阻断介体活性位点并降低其电子传递能力的免疫复合物的产生。CV结果与EIS结果一致(图4B)。在EIS中，半圆直径相当于电子转移电阻(Ret)，电子转移电阻控制氧化还原探针在电极界面处的电子转移动力学。EIS在0.1到105Hz的频率范围内进行。与CV和EIS数据一致，所有的结果表明免疫传感器被成功构建。
3.3信号放大策略的机制
灵敏度与电流信号的差异密切相关，并且受到免疫传感器电导率的显著影响。在该免疫传感器中，纳米复合材料的电催化活性和电导率是免疫传感器灵敏度的关键因素。为了研究这种免疫传感器中基质的信号放大策略，三种基底纳米复合物包括(a)中空纳米盒、(b)nanobox-MOFs/AuNPs和(c)nanobox-MOFs/AuPt alloy。如图5A所示，与只有中空纳米盒作为基底的生物传感器相比，由于AuNPs催化还原H2O2的能力更好，所以nanobox-MOFs/AuNPs显示出显著的电化学信号增加。当免疫传感器中hollow nanobox-MOFs/AuPt alloys作为基底信号材料时，hollow nanobox-MOFs/AuPt alloys表现出更大的电催化电流响应。这表明Pt NPs可以催化H2O2的还原，导致电化学信号增加(图5B)。
为了研究在该免疫传感器中生物素-链霉亲和素蛋白系统的信号放大策略，使用不同的纳米材料对于3mM H2O2还原的对照实验在-0.4V的PBS(pH＝6.8)中进行。如图5C所示，在添加链霉亲和素蛋白之前，在空白和10μg·mL-1浓度的LAG-3之间观察到约80μA的电流差异。如图5D所示，当免疫传感器与生物素-链霉亲和素系统结合而不是简单地使用AuPt合金时，电流差异显著增加至180μA。由于生物素-链霉亲和素系统为Bio-Ab1作为信号放大单元的固定提供了丰富的活性位点，因此，也提高了所提出的夹心型免疫传感器的灵敏度。
免疫传感器的灵敏度还取决于由LAG-3和cys-SiO2-tag-Ab2产生的电催化电流响应变化。在-0.4V的PBS(pH＝6.8)中进行rGO-SnO2/hollow nanobox-MOFs/AuPt alloy(2mg·mL-1)的浓度的对照实验以用于向3mM H2O2的还原。如图5E所示，当10μg·mL-1的LAG-3与Bio-Ab1组合时，与空白的LAG-3相比，电催化电流响应仅减少约180μA。然而，加入cys-SiO2-tag-Ab2后，电流差值变化增加到约280μA(图5F)。可以得出结论，cys-SiO2-tag-Ab2可以提供更大的空间位阻，更有效地抑制电子转移。因此，将cys-SiO2-tag-Ab2引入到电化学传感器中，形成一种对电催化信号响应更敏感的新型夹心型电化学免疫传感器。
3.4实验条件的优化
某些外部实验参数会影响电化学免疫传感器的性能。因此，为了获得最佳的免疫传感器响应，优化了rGO-SnO2/hollow nanobox-MOFs/AuPt alloy、链霉亲和素、Bio-Ab1、cys-SiO2和H2O2的浓度、LAG-3的固定时间、支持电解质的pH值以及AuPt合金的量。如图6A所示，随着rGO-SnO2/hollow nanobox-MOFs/AuPt alloy的浓度从1.0mg·mL-1增加到2.0mg·mL-1，电流响应明显增加，随后一直保持稳定。因此，选择2.0mg·mL-1作为最佳浓度。
此外，链霉亲和素浓度是固定Bio-Ab1并影响免疫传感器性能的关键因素。链霉亲和素浓度在0.1-0.5μg·mL-1范围内进行检测。图6B显示，随着链霉亲和素浓度的增加，电流首先下降，然后达到0.3μg·mL-1的平台，表明链霉亲和素的量在免疫传感器表面上达到最大值，基于Au、PtNPs和链霉亲和素的NH2-Au和NH2-Pt亲和力。因此，选择0.3μg·mL-1作为链霉亲和素的最佳浓度。
此外，图6C显示了Bio-Ab1浓度对免疫传感器响应的影响。当Bio-Ab1浓度从1μg·mL-1变为2μg·mL-1时，电流显著下降，随之达到平台。这表明Bio-Ab1的量通过与链霉亲和素的结合而达到免疫传感器表面上的最大值。因此，选择2μg·mL-1作为Bio-Ab1的优化浓度。
LAG-3的固定时间同样是非常重要的参数。本发明研究了LAG-3的固定时间，如图6D所示。伴随着固定时间的增加，电流迅速下降并在约1小时保持稳定，这归因于抗原-抗体反应，表明获得了LAG-3的最大固定化。为了在下一步中有效结合cys-SiO2-tag-Ab2，选择1小时作为最佳孵育时间。
cys-SiO2的浓度是影响电催化电流响应值变化的重要因素。图6E显示了不同浓度的cys-SiO2用作检测10ng·mL-1LAG-3在pH＝6.8的PBS中的标记的电催化电流响应。如图所示，电催化电流响应从1mg·mL-1持续下降到3mg·mL-1，电流保持稳定。推测在电极表面特异性结合大量的cys-SiO2，阻碍电子转移，导致电催化电流响应逐渐下降。因此，本研究选择3mg·mL-1的cys-SiO2作为标记物的浓度。
pH值对免疫传感器中的生物蛋白的催化能力和活性有显著的影响。如图6F所示，免疫传感器的电流响应随着检测溶液的pH从6.4增加到6.8而持续增加，并且在pH6.8时达到最大值。在pH值大于6.8时，电流明显下降。这是由于在高酸性或碱性环境下蛋白质的生物活性下降。因此，选择检测溶液的pH值为6.8作为实验中优化的检测条件。
H2O2浓度是影响免疫传感器电流响应的另一个重要因素。如图6G所示，随着H2O2浓度的增加，电流增加明显，加入3mmol·L-1H2O2后电流达到平台，说明此时电催化效率最高。因此，H2O2的浓度选择为3mmol·L-1。
PtNPs的量也是影响电化学免疫传感器的催化功效的重要因素。图6H显示，随着PtNPs用量的增加，电流显著增加，然后用5mL的1％H2PtCl6保持稳定，表明中空纳米棒表面PtNPs的数量已经达到饱和状态。因此，选择5mL的H2PtCl6(w/w，1％)作为最佳Pt量。
3.5电化学免疫传感器的性能分析
在优化的实验条件下，电压-0.4V，每隔100s在8mL PBS(pH＝6.8)进行i-t曲线检测，用于检测不同浓度的LAG-3对催化能力的影响。电化学信号对H2O2还原和LAG-3浓度之间的关系如图7A所示。电流随着LAG-3浓度的增加而逐渐降低。电化学电流信号响应与LAG-3浓度对数之间的标准曲线呈现良好的线性关系，从0.01ng·mL-1到1μg·mL-1(图7B)，检测限为1.1pg·mL-1，拟合线性回归方程Y＝-52.3027logCLAG-3+251.39，相关系数R＝0.9998。结果表明，所提出的电化学免疫传感器可用于定量检测LAG-3。此外，还进行了近年来设计的基于MOFs的免疫传感器与其他MOFs电化学传感器的性能比较。在这项工作中，与其他现有的基于MOFs的传感器相比，免疫传感器实现了更宽的线性动态范围，并具有可接受的检测限，如表1所示。
Table.1.Analytical performance compared with other based MOFselectrochemical sensor
3.6免疫生物传感器的特异性，稳定性和重复性
采用1ng·mL-1的LAG-3和100倍浓度的抗原(100ng·mL-1)，包括肌红蛋白(Mb)、癌胚抗原(CEA)、凝血酶(Tb)、肌钙蛋白(cTn)和所有上述蛋白质化合物(Mix)的混合物。每种类型的当前响应记录在图7C中。首先，当加入100倍浓度时，CEA、Tb、Mb和Hb的当前反应与空白样品没有显着差异。其次，如混合电流所示，与仅1ng·mL-1的LAG-3相比，混合电流响应仍然没有显示出显著的变化。这些结果表明其他蛋白质的非特异性相互作用，这些外源蛋白质对电化学免疫传感器上的LAG-3测定具有可忽略的影响。
如图7D所示，使用内部测定法和测定间测定法评价电化学免疫传感器的再现性，以检测浓度为10pg·mL-1的LAG-3。批内和批间的RSD分别为1.47％和1.27％。这些结果显示组装的免疫传感器展现出来可接受的重现性。为了评估免疫传感器的稳定性，制造的传感器在不使用时保存在4℃。如图8所示，在储存的第一周，电流没有明显的变化，电流变化小于1.2％。贮存4周后，检测到相同浓度LAG-3的测定结果没有明显的变化，保留了初始电流响应的94.7％，表明所设计的生物传感器具有良好的稳定性。
3.7分析实际血清样本
为了评价所设计的免疫传感器在实际应用中的精确度和准确性，将不同浓度的LAG-3加入10倍稀释的人血清样品(来自重庆医科大学附属大学城医院)中，通过i-t权限电流差值计算回收率曲线。如表2所示，相对标准偏差为1.31％～2.19％，回收率为96.91％～106.31％。结果表明，本文所设计的生物传感器检测LAG-3是可行的，可以满足实际分析的要求。
Table 2.Determination of LAG-3in human serum(n＝3)with the proposedimmunosensor
4结论
综上所述，基于链霉亲和素-生物素亲和系统的新型超灵敏型夹心无酶免疫传感器，以“rGo-SnO2/hollow nanobox-MOFs/AuPt alloy”作为基底，以cys-SiO2-tag-Ab2作为信号减弱标签，用于人血清中检测LAG-3。一方面，rGo-SnO2/hollow nanobox-MOFs/AuPtalloy复合材料首次成功合成，由于其结构优势和优异的导电性，表现出优异的电催化活性。另一方面，使用生物素-链霉亲和素蛋白系统来提高所提出的免疫传感器的灵敏度。此外，SiO2的利用增加了电化学信号的区别。由于这些优点，所提出的免疫传感器在0.01ng·mL-1到1μg·mL-1范围内具有很宽的线性范围，检测下限为1.1pg·mL-1，满足了对低量LAG-3在人血清中的检测，为临床早期肿瘤诊断应用中测定LAG-3提供了一种新的方法。因此，我们的方法有可能用于确定用于临床诊断的生物标志物。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种用于检测LAG-3蛋白的复合物，其特征在于，由rGO-SnO2与Ni-Co层状双氢氧化物中空纳米体通过Au-NH2和Pt-NH2键结合获得；所述复合物的制备方法如下：
1)将Co(NO3)2溶于CTAB水溶液中，得到混合液，再将2-甲基咪唑溶液加入该混合液中，固液分离，得到钴基沸石咪唑骨架纳米立方体；
2)将步骤1)制得的钴基沸石咪唑骨架纳米立方体溶于乙醇中，再加入含有Ni(NO3)2的乙醇溶液，反应结束后，固液分离，干燥，得到Ni-Co层状双氢氧化物中空纳米体；
3)将步骤2)制得的Ni-Co层状双氢氧化物中空纳米体分散于水中，加入NaBH4乙醇溶液，反应结束后，滴加H2PtCl6乙醇溶液和HAuCl4乙醇溶液，反应结束后，滴加NaBH4乙醇溶液，反应结合后，固液分离，将固体干燥，得到产物；
4)rGO-SnO2复合物分散于乙醇中，加入APTES，反应结束后，固液分离，干燥，将所得产物rGO-SnO2-APTES分散于水中，制成水溶液，将该水溶液与步骤3)所得产物的水溶液混合，反应结束后，固液分离，得到所述用于检测LAG-3蛋白的复合物。
2.根据权利要求1所述的用于检测LAG-3蛋白的复合物，其特征在于：所述复合物的制备方法中，rGO-SnO2复合物与Ni(NO3)2的质量比为2：1；
和/或，步骤3)中，H2PtCl6乙醇溶液的体积为5mL，其中H2PtCl6的浓度为0.5-1.5wt％；
和/或，步骤3)中，HAuCl4乙醇溶液的体积为5mL，其中HAuCl4的浓度为1wt％。
3.一种用于检测LAG-3蛋白的电化学免疫传感器，其特征在于：包括工作电极、参比电极和辅助电极，所述工作电极由基底电极修饰权利要求1所述的复合物获得。
4.根据权利要求3所述的电化学免疫传感器，其特征在于：所述基底电极上还修饰有链霉亲和素。
5.根据权利要求4所述的电化学免疫传感器，其特征在于：所述基底电极为玻碳电极。
6.根据权利要求3-5任意一项所述电化学免疫传感器中工作电极的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
a)将上述用于检测LAG-3蛋白的复合物滴加至基底电极基底电极表面，干燥，得到修饰电极，备用；
b)将链霉亲和素涂覆至步骤a)制得的修饰电极表面，通过Au-NH2和Pt-NH2键将链霉亲和素与AuPt合金结合，再将生物素修饰的抗体滴加至电极表面，反应结束后，采用BSA溶液封闭电极，得到所述工作电极。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤a)中，用于检测LAG-3蛋白的复合物浓度为1.0-3.0mg·mL-1；
和/或，步骤b)中，链霉亲和素的浓度为0.1-0.5μg·mL-1；
和/或，步骤b)中，生物素修饰的抗体浓度为1.0-3.0μg·mL-1。
8.一种用于检测LAG-3蛋白的试剂盒，其特征在于：包括权利要求4或5所述电化学免疫传感器、L-半胱氨酸修饰的SiO2、抗LAG-3、EDC/NHS溶液、牛血清白蛋白。
9.一种用于检测LAG-3蛋白的方法，采用权利要求8所述试剂盒，包括如下步骤：
1)将L-半胱氨酸修饰的SiO2、抗LAG-3、EDC/NHS溶液混合，反应结束后，加入牛血清白蛋白溶液，封闭L-半胱氨酸修饰的SiO2表面剩余的活性位点，固液分离，得到结合物；
2)将LAG-3溶液滴加到所述工作电极上，采用PBS冲洗后，再将步骤1)制得的结合物滴加至所述工作电极上，温育后，采用PBS冲洗，在背景电流稳定后，向工作缓冲溶液中加入H2O2，进行电化学测量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤1)中，L-半胱氨酸修饰的SiO2浓度为1-5mg·mL-1；
和/或，步骤2)中，LAG-3的固定时间为20-100min；
和/或，步骤2)中，PBS的pH为6.4-7.2；
和/或，步骤2)中，H2O2的浓度为2-4mmol·L-1。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711367978.1A CN108051491B (zh) | 2017-12-18 | 2017-12-18 | 一种用于检测lag-3蛋白的电化学免疫传感器 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711367978.1A CN108051491B (zh) | 2017-12-18 | 2017-12-18 | 一种用于检测lag-3蛋白的电化学免疫传感器 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108051491A CN108051491A (zh) | 2018-05-18 |
| CN108051491B true CN108051491B (zh) | 2019-10-18 |
Family
ID=62133331
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711367978.1A Expired - Fee Related CN108051491B (zh) | 2017-12-18 | 2017-12-18 | 一种用于检测lag-3蛋白的电化学免疫传感器 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108051491B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109545572B (zh) * | 2018-11-30 | 2020-07-31 | 北方民族大学 | 一种Ni1-x Cox(OH)2/石墨烯复合材料的制备方法 |
| CN110320367A (zh) * | 2019-05-30 | 2019-10-11 | 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） | 基于lag-3的诊断试剂盒及其在帕金森病诊断产品上的应用 |
| CN110412259B (zh) * | 2019-08-28 | 2022-05-06 | 浙江理工大学 | 一种基于Au@Co-MOFs复合材料的电化学免疫传感器的构建方法 |
| CN112964765B (zh) * | 2021-02-05 | 2022-12-27 | 重庆医科大学 | 一种用于检测cea的电化学免疫传感器及其制备与应用 |
| CN114384064B (zh) * | 2021-12-08 | 2023-11-10 | 江苏大学 | 一种基于印迹MOFs探针高灵敏快速检测农残的方法 |
| CN115112728A (zh) * | 2022-06-30 | 2022-09-27 | 国纳纳米技术研究(河北)有限公司 | 一种用于检测过氧化氢的高灵敏度电化学传感器的制备方法及其产品和应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106124586B (zh) * | 2016-06-20 | 2018-08-14 | 山东理工大学 | 一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBs/HBe的传感器的制备方法及应用 |
| CN106483176B (zh) * | 2016-09-30 | 2019-12-03 | 重庆医科大学 | 一种用于fgfr3-1138g＞a基因多态性检测的电化学传感器制备方法 |
| CN107290412B (zh) * | 2017-06-05 | 2019-09-13 | 南京理工大学 | 一种基于ZnTCPP@MOF的电化学免疫检测微囊藻毒素的方法 |
-
2017
- 2017-12-18 CN CN201711367978.1A patent/CN108051491B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108051491A (zh) | 2018-05-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108051491B (zh) | 一种用于检测lag-3蛋白的电化学免疫传感器 | |
| Huang et al. | A disposable electrochemical immunosensor for carcinoembryonic antigen based on nano-Au/multi-walled carbon nanotubes–chitosans nanocomposite film modified glassy carbon electrode | |
| Li et al. | An electrochemical immunosensor for carcinoembryonic antigen enhanced by self-assembled nanogold coatings on magnetic particles | |
| He et al. | A sensitive amperometric immunosensor for carcinoembryonic antigen detection with porous nanogold film and nano-Au/chitosan composite as immobilization matrix | |
| CN108169303B (zh) | 基于金属有机框架材料作为信号探针的核酸适配体电化学传感器 | |
| Jia et al. | Triple signal amplification using gold nanoparticles, bienzyme and platinum nanoparticles functionalized graphene as enhancers for simultaneous multiple electrochemical immunoassay | |
| CN106442994B (zh) | 一种基于Ag@Au纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法及应用 | |
| Agrahari et al. | Nanoscale materials-based hybrid frameworks modified electrochemical biosensors for early cancer diagnostics: An overview of current trends and challenges | |
| Hasanzadeh et al. | Ultrasensitive immunoassay of tumor protein CA 15.3 in MCF-7 breast cancer cell lysates and unprocessed human plasma using gold nanoparticles doped on the structure of mesoporous silica | |
| CN106596942B (zh) | 一种夹心型乙型肝炎病毒标志物免疫传感器的构建方法及应用 | |
| Ma et al. | Ultrasensitive immunosensor for prostate-specific antigen based on enhanced electrochemiluminescence by vertically ordered mesoporous silica-nanochannel film | |
| Qiu et al. | Biocompatible and label-free amperometric immunosensor for hepatitis B surface antigen using a sensing film composed of poly (allylamine)-branched ferrocene and gold nanoparticles | |
| Hasanzadeh et al. | Ultrasensitive immunoassay of glycoprotein 125 (CA 125) in untreated human plasma samples using poly (CTAB‑chitosan) doped with silver nanoparticles | |
| CN110823980A (zh) | 一种基于类过氧化酶催化银沉积检测gpc3的方法 | |
| CN108469461B (zh) | 一种夹心型肺癌标志物电化学传感器的制备方法及应用 | |
| CN108918853B (zh) | 一种Pd@Ag@CeO2标记的免疫传感器的制备方法及应用 | |
| Kuntamung et al. | A label-free immunosensor for the detection of a new lung cancer biomarker, GM2 activator protein, using a phosphomolybdic acid/polyethyleneimine coated gold nanoparticle composite | |
| WO2022049540A1 (en) | An electrochemical biosensor | |
| CN105606681B (zh) | 一种基于金铜-多壁碳纳米管-二氧化锰构建的生物传感器的制备方法及应用 | |
| CN110376380A (zh) | 一种电化学酶联免疫传感器及其制备与检测抗原的应用 | |
| Song et al. | Dual amplification strategy for the fabrication of highly sensitive amperometric immunosensor based on nanocomposite functionalized interface | |
| CN114813872A (zh) | 一种基于H-rGO-Mn3O4纳米酶的电化学/比色双模式检测GP73的方法 | |
| CN108802390A (zh) | 一种基于石墨烯-金-钯纳米复合材料的胰腺癌肿瘤标志物免疫传感器的制备 | |
| Wang et al. | Immunosensors Based on Layer‐by‐Layer Self‐Assembled Au Colloidal Electrode for the Electrochemical Detection of Antigen | |
| Xiao et al. | Electrochemiluminescence immunosensor using poly (l-histidine)-protected glucose dehydrogenase on Pt/Au bimetallic nanoparticles to generate an in situ co-reactant |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20191018 Termination date: 20201218 |