CN108169303B - 基于金属有机框架材料作为信号探针的核酸适配体电化学传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于金属有机框架材料(MOFs)作为信号探针的核酸适配体电化学传感器,将其用于β‑淀粉样蛋白(Aβ)寡聚体的检测,属于功能纳米复合材料和生物传感器检测技术领域。本方法利用金纳米花(AuNFs)修饰的玻碳电极固定第一层核酸适配体,进一步识别Aβ寡聚体后结合第二层核酸适配体修饰的负载金纳米粒子的Cu‑MOFs(AuNPs/Cu‑MOFs),从而形成夹心型电化学传感器用于检测Aβ寡聚体。AuNPs/Cu‑MOFs作为氧化还原介质可以直接检测Cu2+信号,不需要另外标记电化学活性分子,大大简化了检测步骤,提高测定的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于铜基‐金属有机框架材料标记的夹心型核酸适配体电化学传感器及其制备方法,将其用于β‐淀粉样蛋白寡聚体的检测,属于新型功能纳米复合材料和生物传感器检测技术领域。
背景技术
金属有机骨架(MOF)材料由于具有多样的结构、固有的大比表面积、均匀的可调孔径和可拆剪的化学性质等特点被广泛应用于各个领域,如气体吸附、分离、传感器、药物输送以及催化。除此之外,基于MOFs构筑电化学传感器引起了人们的浓厚兴趣(L.T.Liu,Y.L.Zhou,S.Liu,M.T.Xu,ChemElectroChem,Doi:10.1002/celc.201700931)。与其他的改性剂相比,MOFs比较大的表面积可有效地提高传感器的灵敏度,其独特的结构和性质也可用于固定其他功能性分子。更为重要的是骨架的功能性不仅限于它自身的多孔性,还可以得益于自身金属的磁性、催化性、或者配体的手性或荧光性及两者的协同作用。例如由于Cu2+具有优异的氧化还原活性,可以利用Cu‐MOFs自身的电化学活性构建电化学传感器。且由于MOF中具有大量的Cu2+可以获得高的电化学信号从而提高测定的灵敏度,同时Cu‐MOFs大的比表面积还可以负载识别分子。因此,基于Cu‐MOF纳米材料的可控构筑将为提高测试的灵敏性提供新的契机。
阿尔茨海默病(AD)作为老年痴呆症中最常见的一种类型,是一种神经退行性疾病。目前尚无有效方法治愈此疾病,使其成为国家沉重的社会负担。虽然我们目前尚未完全了解AD的发病机制,但许多研究已经证明,该疾病是由于β‐淀粉样蛋白(Aβ)在脑组织中的沉积引起的。此外,Aβ不仅可以形成规则的纤维状聚集体,而且还可以形成高毒性的可溶性寡聚体,其在AD病理学中具有致病作用。因此,在生理条件下灵敏地监测Aβ寡聚体对于AD的早期临床诊断至关重要。实验室和医院目前用于检测溶液和脑组织中Aβ含量的现有技术昂贵且复杂,因此,电化学生物传感器作为一种简单、稳定、灵敏的替代方法已被应用于Aβ寡聚体的检测。基于抗体和Aβ寡聚体的高亲和力设计电化学传感器被用来检测AD患者脑中Aβ寡聚体的含量(A.J.Veloso,A.M.Chow,H.V.S.Ganesh,N.Li,D.Dhar,D.C.H.Wu,S.Mikhaylichenko,I.R.Brown,K.Kerman,Analytical Chemistry,2014,86,4901.),然而抗体分子价格高昂。核酸适配体具有抗体类似的高亲和力和特异性,且方便合成和修饰。本课题组设计了抗体‐核酸适配体的夹心型类免疫电化学传感器测定Aβ寡聚体,具有较高的灵敏度和特异性(Y.L.Zhou,H.Q.Zhang,L.T.Liu,C.M.Li,Z.Chang,X.Zhu,B.X.Ye,M.T.Xu,Scientific Reports,2016,6,35186);但是在此设计中仍使用了抗体,且核酸适配体修饰到金纳米颗粒表面需要进一步标记电化学活性分子引入电化学信号。为了将所设计的电化学传感器应用于AD患者体液中Aβ寡聚体的检测,需要进一步提高传感器的性能。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种基于Cu‐MOFs作为信号探针的夹心型核酸适配体电化学传感器及其制备方法。
本发明的目的之二是将该夹心型核酸适配体电化学传感器应用于Aβ寡聚体的高灵敏和高选择性检测。
本发明采用以下技术方案来实现上述目的:(1)将AuNFs电沉积在玻碳电极表面,将使得所使用的电极基底具有更大的比表面积及更高的电子传递速率;并通过Au‐S键的作用固定特异性识别基团核酸适配体。
(2)将AuNPs与Cu‐MOFs作用形成纳米复合物,且通过自身的多孔及吸附特性使其表面固定大量的AuNPs,从而通过Au‐S键自组装更多的第二层核酸适配体。
(3)在Aβ寡聚体的存在下,自组装于电极表面和纳米复合物表面的两层核酸适配体共轭物共同捕获目标分子Aβ寡聚体,从而形成夹心型的核酸适配体传感器;其中Cu‐MOFs含有大量的Cu2+,可作为信号探针直接对Aβ寡聚体进行定量检测。
所述的Aβ寡聚体核酸适配体的序列是5′‐HS‐GCCTGTGGTGTTGGGGCGGGTGCG,利用其与Aβ寡聚体的强相互作用和抗体的高特异性,从而提高利用本发明方法进行Aβ寡聚体检测的选择性。
具体地,所述基于Cu‐MOFs作为信号探针的β‐淀粉样蛋白寡聚体的核酸适配体电化学传感器通过如下方法制备而成:
(1)AuNPs/Cu-MOFs的制备:将均苯三甲酸在超声条件下溶解于甲醇中,并将CuSO4·3H2O溶解于H2O中,然后将CuSO4·3H2O溶液逐滴滴入上述均苯三甲酸溶液中,在室温下静置反应;反应结束后利用离心的方法将沉淀物反复洗涤,真空干燥过夜得到Cu-MOFs。将Cu-MOFs粉末加入到AuNPs溶液中在室温下连续搅拌反应,反应结束后,将沉淀反复洗涤,真空干燥。
(2)核酸适配体在AuNPs/Cu-MOFs上的固定:将AuNPs/Cu-MOFs粉末分散在磷酸盐缓冲溶液中(pH 7.4),将硫醇化的核酸适配体(5′-HS-GCCTGTGGTGTTGGGGCGGGTGCG)粉末溶解于上述AuNPs/Cu-MOFs溶液中,并在室温下孵育过夜得到核酸适配体溶液。
(3)夹心型核酸适配体传感器的构筑:将玻碳电极打磨抛光,清洗,将电极表面吹干,将其放入HAuCl4水溶液中在恒电位下电沉积,得到AuNFs修饰的玻碳电极。将AuNFs修饰的玻碳电极浸泡于硫醇化的核酸适配体(5′-HS-GCCTGTGGTGTTGGGGCGGGTGCG)溶液中室温孵育过夜。随后,用1-己硫醇溶液封闭电极表面,以消除AuNFs的非特异性结合位点。然后将上述电极浸入不同浓度的Aβ寡聚体溶液中,在恒温水浴下使适配体与Aβ寡聚体进行特异性结合。再将电极浸泡于核酸适配体修饰的AuNPs/Cu-MOFs溶液中进行孵育,使二层核酸适配体与Aβ寡聚体进行充分的特异性结合。用缓冲溶液洗涤后,制得该夹心型核酸适配体电化学传感器。
进一步的,步骤(1)所述的进行AuNPs/Cu‐MOFs复合物制备时,Cu‐MOFs粉末和AuNPs溶胶的比例为50mg:15mL,从而提高利用本发明进行Aβ寡聚体检测的灵敏度。
进一步的,进行了实验条件的优化,步骤(2)所述的固定核酸适配体时最佳的核酸适配体浓度为10μM;步骤(3)中电极适配体与Aβ寡聚体最佳的培养时间为3h,与核酸适配体修饰的AuNPs/Cu‐MOFs最佳培养时间为3h,从而提高本发明方法进行Aβ寡聚体检测的灵敏性。
本发明创新点在于:利用金纳米花(AuNFs)修饰的玻碳电极固定第一层核酸适配体,进一步识别Aβ寡聚体后结合第二层核酸适配体修饰的负载金纳米粒子的Cu‐MOFs(AuNPs/Cu‐MOFs),从而形成夹心型电化学传感器用于检测Aβ寡聚体。AuNPs/Cu‐MOFs作为氧化还原介质可以直接检测Cu2+信号,不需要另外标记电化学活性分子,大大简化了检测步骤;且Cu‐MOFs中大量的Cu2+可以引入高的电化学信号,提高测定的灵敏度。另外,Cu‐MOFs负载的AuNPs和电极表面的AuNFs都起到了固定核酸适配体和促进电子传递的作用。这种简单、灵敏及经济的电化学适应传感器对于AD的早期临床诊断具有重要意义。
本发明具有如下的有益的效果:
(1)Cu‐MOFs作为氧化还原介质可以直接检测Cu2+信号,大大简化了检测步骤,且MOFs内部含有大量的Cu2+可以提高测定的灵敏度。
(2)玻碳电极上修饰的AuNFs和Cu‐MOFs复合的AuNPs分别起到了固定核酸适配体的作用,同时还促进了电子传递,进一步提高了传感器的灵敏度;
(3)本发明中利用Aβ寡聚体的核酸适配体替代免疫夹心传感器中的一抗和二抗分子,避免了使用昂贵的抗体试剂,且具有与免疫传感器相当的特异性。
(4)AuNPs@Cu‐MOFs表现出良好的生物兼容性和化学稳定性。
(5)本发明以Cu‐MOFs作为信号探针设计的夹心型核酸适配体电化学传感器实现了Aβ寡聚体的高灵敏高选择性测定,检测限为0.45nM,可用于AD患者体液中Aβ寡聚体的测定。
附图说明
图1是本发明原理图。
图2是玻碳电极表面所形成的AuNFs扫描电镜图。
图3是制备的Cu‐MOFs的扫描电镜图(A);透射电镜图(B)及元素分析图(C)。
图4是本发明夹心型核酸适配体传感器对不同浓度Aβ寡聚体的响应曲线图,图中,A为利用差式脉冲(DPV)的方式测定Cu2+的电化学信号图,由a到i代表Aβ寡聚体浓度依次降低;B为Ip‐C标准曲线。
图5是本发明夹心型核酸适配体传感器的选择性图,图中a‐f分别代表Aβ1–40单体,Aβ1–42单体,Aβ1–40纤维,Aβ1–42纤维,Aβ1–40寡聚体及Aβ1–42寡聚体;可以看出,本发明传感器对Aβ1–40寡聚体及Aβ1–42寡聚体有很好的选择性。
具体实施方式
为对本发明进行更好地说明,举实施例如下:
实施例1检测基于Cu‐MOFs作为信号探针的夹心型核酸适配体传感器的制备方法
(1)AuNPs/Cu-MOFs的制备:将3.6mmol均苯三甲酸在超声条件下溶解于12mL甲醇中,并将2.0mmol CuSO4·3H2O溶解于12mL H2O中,然后将CuSO4·3H2O溶液逐滴滴入上述均苯三甲酸溶液中。接下来使其混合物在室温下静置反应2小时以产生蓝色沉淀。最后,利用离心的方法将沉淀物用水和甲醇反复洗涤,真空干燥过夜得到Cu-MOFs。然后,将50mg Cu-MOFs粉末加入到15mL柠檬酸盐还原法制备的AuNPs(15nm)溶液中在室温下连续搅拌48小时,产生肉眼可见的紫色沉淀即AuNPs/Cu-MOFs。最后,将沉淀分别用乙醇和水反复洗涤,真空干燥。
(2)核酸适配体在AuNPs/Cu-MOFs上的固定:将0.05mg AuNPs/Cu-MOFs粉末分散在1mL 0.01M的磷酸盐缓冲溶液中(pH 7.4)中。然后,将1OD硫醇化的核酸适配体(5′-HS-GCCTGTGGTGTTGGGGCGGGTGCG)粉末在12000rpm的转速下离心1分钟,溶解于460μL上述的AuNPs/Cu-MOFs溶液中,并在室温下孵育过夜(140rpm)得到10μM核酸适配体溶液。
(3)夹心型核酸适配体传感器的构筑:首先,将玻碳电极在抛光布上用0.05μm的氧化铝粉末打磨抛光,分别用无水乙醇和二次去离子水超声清洗。然后,利用氮气将电极表面吹干,将其放入10mL 40mM HAuCl4水溶液中在-0.2V的恒电位下电沉积180s,得到AuNFs修饰的玻碳电极。接着,将修饰电极浸泡于60μL 10μM的硫醇化的核酸适配体(5′-HS-GCCTGTGGTGTTGGGGCGGGTGCG)溶液中室温孵育过夜。随后,用4mM 1-己硫醇溶液封闭电极表面,以消除AuNFs的非特异性结合位点。最后,将上述电极浸入60μL不同浓度的Aβ寡聚体溶液中,在37℃恒温水浴下使适配体与Aβ寡聚体进行特异性结合。3小时后,再将电极浸泡于60μL10μM核酸适配体修饰的AuNPs/Cu-MOFs溶液中进行孵育,在相同的温度条件下孵育3小时,使二层核酸适配体与Aβ寡聚体进行充分的特异性结合。在用0.01M PBS 7.4最终洗去未结合的二层共轭物后,制得该夹心型核酸适配体电化学传感器。
应用例1对Aβ寡聚体的测定
采用三电极体系进行检测,所制备的修饰电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为对电极,利用电化学工作站进行检测。利用差式脉冲(DPV)的方式测定Cu2+的电化学信号,其扫描电位窗口为‐0.3V至0.5V,脉冲幅度为0.005V,脉冲频率为15Hz,脉冲宽度为0.1μs,样品宽度为0.0167μs。实验条件包括核酸适配体固定时的浓度、与Aβ寡聚体最佳的培养时间及与核酸适配体修饰的AuNPs/Cu‐MOFs最佳培养时间分别为10μM、3h及3h。在优化的实验条件下,通过测不同浓度的Aβ寡聚体标准溶液,记录Cu2+还原峰电流信号Ip,以Ip‐C绘制标准曲线。该峰电流与Aβ寡聚体的浓度在1nM到2μM的范围内成正比,其线性方程为Ip=0.00124C+0.706,相关系数为0.996,检测限为0.45nM。
实际应用时,根据Cu2+还原峰电流信号Ip,基于上述线性方程,确定所述脑脊髓液中Aβ寡聚体浓度,可以实现定量检测。
应用例2本发明电化学传感器性能考察
为了研究本发明传感器的稳定性,重复测定相同浓度的Aβ寡聚体(2μM),5次重复测定结果的相对标准偏差为1.8%。此外,使用相同的方法构筑8个适体传感器,其测定结果的相对标准偏差为2.7%。另外,将该适体传感器在4℃的冰箱中保存一周,其峰电流值可达到初始峰电流值的90.42%。这进一步说明了构筑的生物传感器具有好的稳定性。
当Aβ纤维体及Aβ单体存在时,与Aβ寡聚体相比峰电流较小,这主要是由于核酸适配体与Aβ寡聚体特异性结合,不结合纤维体和单体,所以不会产生电化学信号的变化。从而说明了此夹心型核酸适配体传感器有很高的选择性。
应用例3脑脊髓液中Aβ寡聚体的测定
按照人工合成脑脊髓液的方法进行配置:150mM NaCl、3.0mM KCl、1.4mM CaCl2·2H2O、0.8mM MgCl2·6H2O、1mM磷酸盐组成。采用加标回收的方法,加入不同浓度的标准样品,进行分析。得到加标回收率为97.3%‐103.9%,此结果基本符合要求。由此说明该方法对于实际样品中Aβ寡聚体的测定具有潜在的应用价值。
表1脑脊髓液中Aβ寡聚体的加标回收实验
Claims (4)
1.一种基于金属有机框架材料作为信号探针的β-淀粉样蛋白寡聚体的核酸适配体电化学传感器,其特征在于,通过如下方法制备而成:
(1)金纳米粒子/Cu-MOFs复合物AuNPs/Cu-MOFs的制备:将均苯三甲酸在超声条件下溶解于甲醇中,并将CuSO4·3H2O溶解于H2O中,然后将CuSO4·3H2O溶液逐滴滴入上述均苯三甲酸溶液中,在室温下静置反应;反应结束后利用离心的方法将沉淀物反复洗涤,真空干燥过夜得到Cu-MOFs;将Cu-MOFs粉末加入到AuNPs溶液中在室温下连续搅拌反应,反应结束后,将沉淀反复洗涤,真空干燥得AuNPs/Cu-MOFs粉末;
(2)核酸适配体在AuNPs/Cu-MOFs上的固定:将AuNPs/Cu-MOFs粉末分散在磷酸盐缓冲溶液中,将硫醇化的核酸适配体粉末溶解于上述AuNPs/Cu-MOFs溶液中,并在室温下孵育过夜得到核酸适配体溶液;
(3)夹心型核酸适配体传感器的构筑:将玻碳电极打磨抛光,清洗,将电极表面吹干,将其放入HAuCl4水溶液中在恒电位下电沉积,得到金纳米花AuNFs修饰的玻碳电极;将AuNFs修饰的玻碳电极浸泡于硫醇化的核酸适配体溶液中室温孵育过夜;随后,用1-己硫醇溶液封闭电极表面,消除AuNFs的非特异性结合位点;然后将上述电极浸入不同浓度的Aβ寡聚体溶液中,在恒温水浴下使适配体与Aβ寡聚体进行特异性结合;再将电极浸泡于步骤(2)制得的核酸适配体修饰的AuNPs/Cu-MOFs溶液中进行孵育,使第二层核酸适配体与Aβ寡聚体进行特异性结合;用缓冲溶液洗涤后,制得夹心型核酸适配体电化学传感器;
所述硫醇化的核酸适配体的DNA序列为5′-HS-GCCTGTGGTGTTGGGGCGGGTGCG-3’。
2.根据权利要求1所述的基于金属有机框架材料作为信号探针的β-淀粉样蛋白寡聚体的核酸适配体电化学传感器,其特征在于,步骤(1)所述的进行AuNPs/Cu-MOFs复合物制备时,Cu-MOFs粉末和AuNPs溶液的比例为50mg:15mL。
3.根据权利要求1所述的基于金属有机框架材料作为信号探针的β-淀粉样蛋白寡聚体的核酸适配体电化学传感器,其特征在于,步骤(2)所述的核酸适配体溶液浓度为10μM。
4.根据权利要求1所述的基于金属有机框架材料作为信号探针的β-淀粉样蛋白寡聚体的核酸适配体电化学传感器,其特征在于,步骤(3)中核酸适配体修饰的电极与Aβ寡聚体的培养时间为3h;电极识别Aβ寡聚体后与核酸适配体修饰的AuNPs/Cu-MOFs的最佳培养时间为3h。
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Fabrication of an antibody-aptamer sandwich assay for electrochemical evaluation of levels of β-amyloid oligomers;Yanli Zhou 等;《SCIENTIFIC REPORTS》;20161011;第6卷;第1-8页 |
Metal−Organic Framework Nanomaterials as Novel Signal Probes for Electron Transfer Mediated Ultrasensitive Electrochemical Immunoassay;Ting-Zhi Liu 等;《analytical chemistry》;20161115;第88卷;第12516-12523页 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN108169303A (zh) | 2018-06-15 |
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